CC BY
17МАЙ
- ИЮНЬ 2О 1 3
УДК 54-31 : 615.91
Экспериментальное исследование острой токсичности суперпарамагнитных наночастиц Fe O и нанокомплекса 1ДМ+Ре304]
С.Ф.Вершинина', А.Н.Стуков2,
Е.и. Якубович', Р.Б. Самсонов1, Д.М. Лавникевич',
В.и. Евтушенко'
'ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Минздрава России, Санкт-Петербург 2ФГБУ «НИИ онкологии
им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
В работе на мышах SHR (самцах и самках) определена острая токсичность созданных в ФГБУ РНЦРХТ суперпарамагнитных наночастиц на основе FeзO4 и нанокомплекса [ДНК+FeзO4]. Были испытаны дозы 2, 4, 6, 8 и 10 ммоль/кг. Результаты исследования продемонстрировали малую токсичность препаратов. 100% гибели животных не наблюдалось ни при одной из доз. Среднесмертельная доза (LD50) при испытании парамагнетика FeзO4 для самок составила 18,8 ммоль/кг, для самцов - 30 ммоль/кг. LD50 при испытании нанокомплекса [ДНК+Fe3O4] для самок была равна 11,2 ммоль/кг, для самцов - 11,5 ммоль/кг.
Ключевые слова: острая токсичность, мыши SHR, суперпарамагнитные наночастицы Ре^О4, нанокомплекс [ДНК+FeJOJ.
Введение. Токсичность противоопухолевых препаратов представляет важнейшую клиническую проблему, с которой непосредственно связаны результаты лечения опухолевых заболеваний [1]. Одним из путей снижения токсических эффектов лекарственных антибластомных средств является направленный транспорт препаратов непосредственно в опухолевый очаг. В этом отношении перспективным может быть создание суперпарамагнитных наночастиц и их комплексов с терапевтическими агентами, с помощью которых под действием внешнего магнитного поля можно направленно доставить противоопухолевые препараты, включая ДНК-вакцины, непосредственно к опухоли, не повреждая здоровые ткани. Вместе с тем вопрос токсичности наночастиц и их комплексов в настоящее время недостаточно изучен и нуждается в детальном исследовании по причине особенностей их физико-химических свойств, таких как высокая дисперсность, огромная удельная поверхность, высокая напряженность электростатического поля и избыточная свободная энергия поверхности [2]. Поэтому перед новой дисциплиной - нанотоксиколо-гией - стоит двоякая задача, прежде всего - это анализ негативного воздействия наноо-бъектов на организм человека и далее - разработка способов нейтрализации этих воздействий путем модификации физико-химических свойств наночастиц. При этом, несмотря на разработку различных in vitro экспресс-систем для оценки биологических эффектов наночастиц, включая токсичность, исследования на экспериментальных животных остаются «золотым стандартом» [5].
В настоящей работе оценена острая токсичность созданных в ФГБУ РНЦРХТ суперпарамагнитных наночастиц Fe3O4 и нанокомплекса ^HK+Fe3OJ на животных.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках Госконтракта № 16.552.11.7021 с использованием оборудования ЦКП «Биотехнологический центр исследования экспрессии генома».
Материалы и методы исследования. В работе использовались созданные в ФГБУ РНЦРХТ суперпарамагнитные наночастицы на основе Fe3O4 и нанокомплекс, состоящий из наночастиц Fe^, на которых сорбирована фрагментированная ультразвуком ДНК из тимуса теленка со средним размером 300 пар оснований. Емкость наночастиц составляла 2,5 мкг ДНК на 1 мг Fe3O4
Синтез суперпарамагнитных наночастиц на основе Fe3O4 производился в лаборатории генной инженерии ФГБУ РНЦРХТ следующим образом.
Одномолярные растворы FeCl2 и FeCl3 (Merck, Германия) фильтровали через фильтры Millipore с диаметром пор 0,45 мкм и смешивали в соотношении 2:1. Смесь дегазировали и титровали раствором NH4ОН для доведения рН до 11, после чего сосуд для синтеза частиц помещали в емкость с холодной водой и обрабатывали образовавшуюся суспензию ультразвуком при мощности 18 мВт и частоте 44 кГц в течение 10 минут. Суспензию наночастиц оставляли «созревать» в течение 1 часа при температуре +200С, затем образовавшиеся суперпарамагнитные наночастицы (СПМЧ) промывали 3 раза деионизованной водой. Наночастицы собирали с помощью ниобиевого магнита на стенке поликарбонатного стакана и аккуратно сливали супернатант через край стакана. Магнит убирали, на-ночастицы ресуспендировали в 3-5 объемах деионизованной воды и оставляли на 20 мин при температуре +200С. Процедуру отмывки повторяли 2 раза. Объём осадка полученных суперпарамагнитных наночастиц измеряли и приготавливали 20% (v/v) суспензию нано-частиц в деионизованной воде, аликвотировали и хранили при +40С.
При приготовлении нанокомплекса [ДНK+FeзO4] количество ДНК рассчитывали из соотношения 2,5 мкг ДНК на 1 мкг частиц. Сорбцию ДНК проводили в объеме 200 мкл суспензии частиц в течение 1 минуты, затем осаждали частицы с помощью магнита, удаляли супернатант и ресуспендировали частицы в 200 мкл физиологического раствора. Вышеописанную отмывку частиц от возможных примесей не связавшейся ДНК повторяли еще два раза. Отмытый осадок СПМЧ с иммобилизованной ДНК ресуспендировали в физиологическом растворе до конечного объёма 200 мкл.
Для определения острой токсичности суперпарамагнитных наночастиц Fe3O4 и нано-комплекса [ДНK+FeзO4] использовали 100 белых мышей SHR обоего пола с массой 22-24 г. Животные были разделены на 10 групп и индивидуально промаркированы. В каждой группе было по 10 животных (5 самок и 5 самцов). Дозы нанокомплекса [ДНK+FeзO4] и суперпарамагнитных наночастиц Fe3O4 были следующие: 2 ммоль/кг (464 мг/кг), 4 ммоль/кг (928 мг/кг), 6 ммоль/кг (1392 мг/кг), 8 ммоль/кг (1856 мг/кг), 10 ммоль/кг (2320 мг/кг). Препараты вводили мышам внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл на 25 г массы жи-
8
вотного. За животными наблюдали в течение 2 месяцев. Определяли средне-смертельные дозы (LD50), а также LDlб и LD84 При оценке результатов опыта по острой токсичности у мышей суперпарамагнитных наночастиц FeзO4 и нанокомплекса [ДНК+Fe 3О4] использовали метод наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности по В.Б. Прозоровскому [3, 4].
Результаты и обсуждение. В результате проведенного исследования было обнаружено, что на протяжении 2 месяцев наблюдения за мышами SHR обоего пола при всех испытанных дозах как нанокомплекса [ДНК+ FeзO4 ], так и парамагнетика FeзO4 не наблюдалось 100% гибели животных. Результаты обработки полученных данных по методу В.Б. Прозоровского представлены в таблицах.
На основании анализа полученных данных установлено, что, LD50 суперпарамагнитных наночастиц FeзO4 у самок мышей SHR составляет 4362мг/кг (18,8 ммоль/кг), LDlб -1090 мг/кг, LD84 - 9800 мг/кг.
Исходя из данных таблицы 2, LD50 суперпарамагнитных наночастиц FeзO4 у самцов мышей SHR равно 7053 мг/кг (30 ммоль/кг), LDlб - 1299 мг/кг, LD84 - 23664 мг/кг.
Исходя из данных таблицы 3, у самок мышей SHR LD50 нанокомплекса [ДНК+Fe3O4] равно 2589 мг Fe3O4/кг (11,2 ммоль Fe/кг), LDlб - 1276 мг/кг, LD84 - 6454 мг/кг.
Исходя из данных таблицы 4, у мышей SHR самцов LD50 нанокомплекса [ДНК+Fe3O4] равно 2677 мг FeзO4/кг (11,5 ммоль Fe/кг), LDlб - 1471 мг FeзO4/кг, LD84 - 3881 мг FeзO4/кг.
Гибель животных при внутрибрюшинном введении суперпарамагнитных наночастиц FeзO4 происходила с 7-го по 52-й день после однократной инъекции, при введении нанокомплекса [ДНК+FeзO4] мыши погибали с 7-го по 50-й день. На вскрытии погибших животных, получавших высокие дозы (2320 мг/кг) суперпарамагнитных наночастиц FeзO4 или нанокомплекса [ДНК+FeзO4], в брюшной полости обнаруживались конгломераты частиц FeзO4, тогда как у мышей, погибших от меньших доз, наблюдали равномерное распределение частиц FeзO4 по брюшине.
В литературе данные о токсичности микро- и наночастиц оксидов железа отрывочны. Так, в статье Nissim J.A. 1954 г., посвященной токсическим реакциям оксида железа при внутривенном введении человеку [6], LD50 для двух препаратов суспензии оксида железа в сахарозе для мышей составила 180 мг Fe на 1 кг и 300 мг Fe на 1 кг соответственно, то есть токсичность используемого препарата оксида железа была достаточно высокой. К сожалению, размеры частиц оксида железа в работе не указаны, упомянуто только, что использовали коллоидный препарат. Оценка острой токсичности препарата суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, стабилизированных цитратом (препарат АМ1-25, приготовленный для клинических исследований - контрастный агент для магнитного резонанса) показала отсутствие летального эффекта при самой высокой дозе 3 ммоля на 1 кг массы животного в течение 14 дней [7], к сожалению, перед авторами работы не стояла задача определения LD50. Для другого стабилизированного препарата суперпарамагнитных наночастиц оксида железа (VSOP-C184) на мышах была определена величина LD50, которая составила 17,9 ммоль Fe/кг, что превышает максимальную дозу, используемую для человека в 230 раз [8]. Приведенная величина LD50 17,9 ммоль Fe/кг для VSOP-C184 очень близка к нашей величине 4362 мг/кг (18,8 ммоль Fe/кг) для суперпарамагнитных наночастиц FeзO4. Интересно, что величина LD50 для препарата VSOP-C184 на крысах в два раза ниже, чем на мышах, и превышает максимальную дозу, используемую для человека, в 116 раз.
Нами впервые показана разная токсичность (LD50) суперпарамагнитных наночастиц FeзO4 для самцов и самок мышей - 30,0 и 18,8 ммоль Fe/кг соответственно, что свидетельствует о необходимости учитывать не только видовую, но и гендерную составляющую при экстраполяции оценки риска использования наночастиц, полученную на грызунах, на человека.
Заключение. В целом, на основании полученных результатов можно заключить, что созданные в РНЦРХТ суперпарамагнитные наночастицы FeзO4 и нанокомплекс [ДНК+FeзO4] умеренно токсичны или малотоксичны и могут быть использованы в дальнейших разработках для создания конструкта для генной терапии опухолей.
Токсикологический вестник №з (120)
Таблица 1
определение острой токсичности суперпарамагнитных наночастиц Fe3O4 у самок мышей SHR
Доза, мг/кг ХЭ Летальность, % УЭ Место концентрации Х Пробиты У Весовой коэфф. В ХВ Х2В УВ ХУВ
464 20 1 4,16 3,9 3,9 3,9 16,2 16,2
928 0 2 3,04 1,8 3,6 7,2 5,47 10,94
1392 60 4 5,25 4,7 18,8 75,2 24,67 98,68
1856 60 6 5,25 4,7 28,2 169,2 24,67 148,0
2320 20 8 4,16 3,9 31,2 24,96 16,2 129,6
19 85,7 505,1 87,2 403,4
Таблица 2
определение острой токсичности суперпарамагнитных наночастиц Fe3O4 у самцов мышей SHR
Доза, мг/кг ХЭ Летальность, % УЭ Место концентрации Х Пробиты У Весовой коэфф. В ХВ Х2В УВ ХУВ
464 0 1 3,04 1,8 1,8 1,8 5,47 5,47
928 40 2 4,75 4,75 9,5 19 22,56 45,1
1392 20 4 4,16 3,9 15,6 62,4 16,2 64,9
1856 40 6 4,75 4,75 28,5 171 22,56 135,4
2320 20 8 4,16 3,9 31,2 249,6 16,2 129,8
19,1 86,6 503,8 83,0 380,7
9
МАЙ
- ИЮНЬ 2О 1 3
Таблица 3
Определение острой токсичности нанокомплекса [ДНК+Ре304] у самок мышей БИР
Доза, мг/кг ХЭ Летальность, % УЭ Место концентрации Х Пробиты У Весовой коэф. В ХВ Х2В УВ ХУВ
464 80 1 5,84 3,9 3,9 3,9 22,8 22,8
928 40 2 4,75 4,75 9,5 19 22,6 45,2
1392 40 4 4,75 4,75 19 76 22,6 90,4
1856 20 6 4.16 3,9 23,4 140,4 16,2 97,2
2320 40 8 4,75 4,75 38 304 22,6 180,8
22,05 93,8 543,3 106,8 436,4
Таблица 4
Определение острой токсичности нанокомплекса [ДНК+Ре304] у самцов мышей БИР
Доза, мг/кг ХЭ Летальность, % УЭ Место концентрации Х Пробиты У Весовой коэфф. В ХВ Х2В УВ ХУВ
464 0 1 3,04 1,8 1,8 1,8 5,47 5,47
928 0 2 3,04 1,8 3,6 7,2 5.47 10,94
1392 40 4 4,75 4,75 19 76 22,56 90,24
1856 20 6 4,16 3,9 23,4 140,4 16,2 97,2
2320 40 8 4,75 4,75 38 304 22,56 180,48
17 64,8 529,4 72,3 384,3
10
Токсикологический вестник №з (120)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов МА., Акимов A.A. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. СПб.: Сотис, 1999.
2. Радилов A.C., Глушкова A.B., Дулов СА. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов // Нанотехнологии. Экология Производство. 2009. - № 1. - С. 86-89.
3. Прозоровский В.Д. Использование метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности //Фармакология и токсикология, 1962. -
Т. 25. - № 1. - С. 115-120.
4. Прозоровский В.Д. Практическое пособие по ускоренному определению средних эффективных доз и концентраций биологически активных веществ. Байкальск: Изд-во Общества духовной и психической культуры, 1994.
5. Shaw S.Y., Westly E.C., PittetM.J. et al. Perturbational profiling of nanomaterial biologic activity // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. - Vol. - 105. № 21. - P. 7387-7392.
6. Nissim JA. // Toxic reactions after intravenous saccharted iron oxide in man. British Medical Journal. 1954. Feb. 13. - P.
352-356.
7. WeisslederR., Stark D.D., EngelstadB.L.et al. // Superparamagnetic iron oxide: pharmacokinetics and toxicity Amer. J. Roentgenol. 1989. - Vol. 152. - P. 167-173.
8. Citrate-coated (184th variant) very small superparamagnetic iron oxide particles VSOP-C184. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [Internet]. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US). 2006. Sep 27.
S.F.Vershinina1, A.N.Stukov2, Ye.I.Yakubovich1, R.B.Samsonov1, D.M.Lavnikevich1, V.I. Yevtushenko1
Experimental study of acute toxicity of supermagnetic Fe3O4 nanoparticles and nanocomplex [DNA+Fe3OJ
'Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies (RSCRST) 2N.N.Petrov Institute of Oncology, St.-Petersburg
In experiments on mice SHR, acute toxicity of Fe3O4-based nanoparticles and nanocomplex [DNA+Fe3O4] created at RSCRST was determined. Doses 2,4,6,8 and 10 mmol/kg were tested. Investigation results showed a low toxicity of the preparations. 100% death of animals was not observed for either dose. When testing paramagnetics Fe3O4 , a median lethal dose (LD50) was 18.8 mmol/kg for females and 30 mmol/kg for males. [DNA+Fe3O4] tested, LD50 was 11.2 mmol/kg for females and 11.5 mmol/kg for males.
Материалы поступили в редакцию 23.03.2012 г
11
