CC BY
73
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 615.213
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НОВОГО АНКСИОЛИТИКА ТРАНКВИРИДИНА © Шабанов П.Д., Морозов А.И., Лебедев А.А., Бычков Е.Р., Вислобоков А.И.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12
Резюме: транквиридин, производное 1,2-диазациклопропана, обладает типичным анксиолитическим действием в поведенческих экспериментах в открытом поле, темной/светлой камере, конфликтной ситуации (наказуемое потребление воды), изучении поведения крыс с активной и пассивной эмоциональной стратегией. В дозе 100 мг/кг анксиолитический эффект был сопоставим с таковым диазепама 1 мг/кг. В дозе 50 мг/кг транквиридин проявил умеренный анксиолитический эффект, характерный для дневных транквилизаторов. В дозе 10 мг/кг транквиридин в большинстве тестов был неактивным. Следовательно, эффекты транквиридина зависели от дозы, их выраженность возрастала с увеличением дозы вводимого вещества. Подтверждением транквилизирующего действия транквиридина стало выявление антидофаминового типа действия препарата, когда транквиридин 100 мг/кг, сходно с диазепамом 1 мг/кг замедлял обмен дофамина в стриатуме крыс (хроническое введение препаратов). Кроме того, транквиридин в широком диапазоне концентраций (от 10 мкМ до 10 мМ) вызывал урежение частоты импульсной активности изолированных нейронов моллюсков, которое происходило на фоне незначительной гиперполяризации. В этих же условиях эксперимента транквиридин умеренно подавлял входящие натриевые токи (не меняя кальциевых) и оказывал двухфазное действие на медленные калиевые токи: в концентрациях 1*10-6 и 1*10-5 М препарат их незначительно активировал, а в более высоких концентрациях - снижал. Все сказанное выше подтверждает анксиолитический эффект транквиридина, механизмом которого является функциональный антидофаминовый эффект и прямое снижение импульсной активности нейронов.
Ключевыге слова: транквилизаторы, транквиридин, диазепам, механизм действия, поведенческие эффекты, обмен моноаминов, ионные токи
EXPERIMENTAL STUDY OF A NEW ANXIOLYTIC TRANQUIRIDINE Shabanov P.D., Morozov A.I., Lebedev A.A., Bychkov E.R., Vislobokov A.I.
Institute of Experimental Medicine, Russia, 197376, St. Petersburg, Acad. Pavlov St., 12
Summary: tranquiridine, a derivative of 1.2-diazocyclopropane, was shown to possess a typical anxiolytic effect in behavioral experiments in elevated plus maze, open field, dark/light chamber, conflict situation (punished water intake) in rats and mice, and in rats with active and passive strategy of emotional behavior. Effect of tranquiridine 100 mg/kg was the same as of diazepam 1 mg/kg. Tranquiridine 50 mg/kg acted as a middle, or daily tranquilizer. Tranquiridine 10 mg/kg was ineffective in majority of behavioral tests. Therefore, effects of tranquiridine depended on the dose, its power increased with enhancement of the dose. The tranquilizing effect of tranquiridine was supported with antidopaminic type of its action when tranquiridine 100 mg/kg like as diazepam 1 mg/kg slowed dopamine turnover in the rat striatum (chronic administration of drugs for 5 days). Besides, tranquiridine in a wide range of concentrations (from 10 ^M till 10 mM) decreased impulse activity frequency of the isolated neurons of the mollusk lasted on the background of slight hyperpolarization. In the same experimental conditions, tranquiridine slightly inhibited influx sodium currents (without changing calcium currents) and acted biphasically on slow potassium currents: in concentrations of 1* 10-6 and 1 *10-5 M tranquiridine activated them slightly, and in higher concentrations inhibited them. All supports anxiolytic effect of tranquiridine, mechanism of action of which is functional antidopaminergic effect and direct inhibition of impulse activity of neurons.
Key words: tranquilizers, tranquiridine, diazepam, mechanism of action, behavioral effects, monoamine turnover, ionic currents
Введение
Разработка новых анксиолитиков представляет собой актуальную проблему нейрофармакологии. В этом отношении рассматриваются разные по химическому строению соединения, например, производные 3,4-бензодиазепина (наиболее широко распространенная структура, на основании которой получено и внедрено более 110 препаратов), бензимидазола (афобазол), триметоксибензойной кислоты (триоксазин), азапирона (буспирон), бисфенильные производные ацетилхолина (бенактизин, метамизил) и другие гетероциклические соединения [7, 8]. В то же время, как потенциальные психотропные средства рассматриваются и производные диазиридина (1,2-диазациклопропаны), содержащие в своем трехчленном ядре два атома азота [4]. С фармакологической точки зрения, производные диазиридина позиционируются как психотропные средства [16] и средства лечения нейродегенеративных заболеваний [13]. Первоначально в литературе описаны лишь антидепрессантные эффекты данных соединений, полученные в опытах in vitro по блокированию моноаминоксидазы [15]. В наших недавних исследованиях показано, что производные диазиридина проявляют свойства анксиолитиков [9] и атипичных нейролептиков [10], что в целом укладывается в представления о наличии у данных соединений разной по направленности психотропной активности.
Целью работы было экспериментальное изучение анксиолитической активности нового производного диазиридина препарата транквиридина в дозах 10, 50, 100 мг/кг в сравнении с транквилизатором диазепамом 1 мг/кг на грызунах (крысы, мыши).
Методика
Опыты выполнены на 226 крысах самцах Вистар массой 180-200 г и 57 беспородных мышах самцах массой 18-22 г, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). Эффекты транквиридина (10-50-100 мг/кг) и препарата сравнения диазепама (седуксен, Гедеон Рихтер, Венгрия; 1 мг/кг), вводимых внутрибрюшинно, оценивали в батарее поведенческих тестов («приподнятый крестообразный лабиринт», «открытое поле», темная/светлая камера, конфликтная ситуация в варианте наказуемого потребления воды, поведение крыс с активной и пассивной эмоциональной стратегией) в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» для транквилизаторов [5, 6]. Механизм действия транквиридина исследовали по его влиянию (100 мг/кг) на содержание и обмен дофамина и серотонина в стриатуме головного мозга крыс, измеренных методом высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимическим детектором [3]. Также исследовали влияние транквиридина в диапазоне концентраций от 10 мМ (10-2 М) до 10-6 М (1 мкМ) при внеклеточном приложении на частоту импульсной активности изолированных нейронов моллюска катушки роговой (Planorbarius corneus) и на входящие натриевые, медленные калиевые и кальциевые токи изолированных идентифицированных педальных нейронов моллюска (ППед1) [1, 2, 12, 14].
Для статистической обработки полученных количественных данных и построения графиков применяли пакеты программ Graph Pad Prizm v.4; SPSS Sigma Stat 3.0 и Minitab 14. В качестве статистических критериев использовали традиционные показатели описательной статистики. Для сравнения контрольной и экспериментальных групп использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, а также критерии попарных сравнений групп Стьюдента-Ньюмена-Кейлса и Данна. Из непараметрических критериев использовали критерий Краскела-Уоллиса для сравнения групп. Для оценки соответствия распределений случайных величин гауссовым применяли критерий нормальности Колмогорова-Смирнова.
Результаты исследования и их обсуждение
В поведенческих опытах на грызунах показано, что транквиридин обладает типичным анксиолитическим действием. В «приподнятом крестообразном лабиринте» транквиридин в дозе 10 мг/кг на 28,5% увеличивал время пребывания крыс Вистар в открытых рукавах лабиринта (показатели сопоставимы с действием диазепама 1 мг/кг, но ниже). В дозе 100 мг/кг транквиридин не менял времени пребывания крыс в открытых рукавах лабиринта, а в дозе 50 мг/кг лишь выявил тенденцию к увеличению этого времени (табл. 1). Число свешиваний с открытых краев платформы при этом практически не менялось во всех исследованных группах.
Таблица 1. Влияние транквиридина и диазепама на поведение крыс в приподнятом крестообразном лабиринте_
Показатели Контроль (физ. р-р) Диазепам 1 мг/кг Транквиридин
10 мг/кг 50 мг/кг 100 мг/кг
Время в светлом рукаве, с 63±6 94±6* 82±5* 72±5 65±8
Число свешиваний 5,0±0,9 5,8±0,6 5,1±0,8 4,9±0,9 4,9±0,8
Примечание. * р<0,05 в сравнении с контролем. Животные получали внутрибрюшинно инъекцию диазепама 1 мг/кг или транквиридина в дозе 10, 50, 100 мг/кг за 1 ч. до посадки в установку, поведение оценивали в течение 3 мин. (180 с)
Следовательно, транквиридин только в дозе 10 мг/кг проявляет умеренный транквилизирующий эффект в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». В дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг транквиридин не проявляет анксиолитических свойств в данном тесте. Препарат сравнения диазепам 1 мг/кг выявляет типичный анксиолитический эффект.
В тесте «светлая/темная камера» у мышей диазепам 1 мг/кг выявлял устойчивый анксиолитический эффект, на 139% повышая время пребывания в светлом отсеке установки. Транквиридин в дозе 100 мг/кг оказывал сходный эффект, на 112% повышая данный показатель (табл. 2). В дозах 50 мг/кг и 10 мг/кг транквиридин более чем на 50% увеличивал время пребывания в светлом отсеке установки, однако из-за высокого разброса данные не были статистически значимыми.
Таблица 2. Влияние транквиридина и диазепама на поведение в тесте «светлая/темная камера» у мышей
Показатели Контроль (физ. р-р) Диазепам 1 мг/кг Транквиридин
10 мг/кг 50 мг/кг 100 мг/кг
Время проведенное в светлом отсеке, с 41±6 98±14* 61±11 70±13 88±13*
Количество переходов 1,8±0,3 4,2±0,5* 1,9±0,4** 2,3±0,5** 2,6±0,5*
Примечание. * р<0,05; ** р<0,01 в сравнении с контролем, # р<0,05; ## р<0,01 - в сравнении с группой диазепама. Мыши получали внутрибрюшинно инъекцию диазепама 1 мг/кг или транквиридина в дозах 10, 50, 100 мг/кг за 1 ч. до посадки в установку, поведение оценивали в течение 5 мин. (300 с)
В то же время второй важнейший показатель - число переходов из темной части установки в светлую - также увеличивался в случае введения диазепама 1 мг/кг (в 2,3 раза), но достоверно не менялся в случае введения транквиридина в дозах 10, 50, 100 мг/кг. При этом данные, полученные после введения всех доз транквиридина, были достоверно ниже таковых от действия диазепама 1 мг/кг.
Следовательно, транквиридин в дозе 100 мг/кг оказывает типичное анксиолитическое действие в тесте «светлая/темная камера» у мышей, сопоставимое с таковым диазепама 1 мг/кг. В дозах 10 мг/кг и 50 мг/кг транквиридин в данном тесте анксиолитическими свойствами не обладает.
В «открытом поле» крысы Вистар были распределены на два типа: с активной и пассивной стратегией поведения (определяли по числу переходов из одной камеры в другую в двухкамерной установке в течение 10 минут). У крыс с пассивным типом эмоционально-стрессовой реакции (число переходов из одной камеры в другую меньше 7) диазепам 1 мг/кг почти втрое снижал горизонтальную двигательную активность, в 8 раз - вертикальную двигательную активность, в 9 раз - исследовательскую активность (число заглядываний в норки) и в 5 раз - эмоциональность (число болюсов дефекаций). Транквиридин зависимо от дозы также умеренно уменьшал все эти показатели. Максимальный эффект отмечали в дозе 100 мг/кг, когда транквиридин вдвое снижал горизонтальную активность, в 3 раза - вертикальную и исследовательскую активность, и на 57% -эмоциональность (табл. 3).
В дозе 50 мг/кг транквиридин оказывал более умеренный анксиолитический эффект, а в дозе 10 мг/кг не регистрировали статистически значимых отличий от контрольных значений.
Таким образом, диазепам 1 мг/кг оказывает выраженное депримирующее действие в тесте «открытое поле» у крыс с пассивным типом эмоционально-стрессовой реакции, существенно подавляя все исследованные показатели. Транквиридин в дозах 100 мг/кг и в меньшей степени 50 мг/кг проявляет типичную анксиолитическую активность в данном тесте. При этом действие транквиридина 100 мг/кг по показателям приближалось к действию диазепама 1 мг/кг. В дозе 10 мг/кг транквиридин был не эффективен.
Таблица 3. Влияние транквиридина и диазеиама на поведение в тесте «открытое поле» у крыс с пассивным типом эмоционально-стрессовой реакции_
Показатели Контроль (физ. р-р) Диазепам 1 мг/кг Транквиридин
10 мг/кг 50 мг/кг 100 мг/кг
Число пересеченных квадратов 18,4±2,3 6,8±1,4*** 15,0±1,9# 10,3±1,6** 9,0±1,7**
Вертикальная активность 1,6±0,4 0,2±0,1* 1,0±0,3 0,9±0,4 0,5±0,2
Число заглядываний в норки 2,8±0,5 0,3±0,2** 2,2±0,6* 1,9±0,5" 0,9±0,4*
Болюсы дефекаций 1,1±0,3 0,2±0,1 0,8±0,4 0,4±0,2 0,7±0,3
Примечание. *р<0,05, *р<0,01, ***р<0,001 в сравнении с группой контроля, #р<0,05 - в сравнении с группой диазепама
Интактных и контрольных крыс с активным типом эмоционально-стрессовой реакции (число переходов из одной камеры в другую больше 8) отличали более высокие исходные показатели в «открытом поле» в сравнении с крысами с пассивным типом эмоционально-стрессовой реакции. У крыс с активным типом эмоционально-стрессовой реакции диазепам 1 мг/кг в 2,5 раза снижал горизонтальную двигательную активность, в 3,5 раз - вертикальную двигательную активность, в 9 раз - исследовательскую активность (число заглядываний в норки) и в 4,5 раз - эмоциональность (число болюсов дефекаций). Транквиридин зависимо от дозы также уменьшал все эти показатели. Максимальный эффект отмечали в дозе 100 мг/кг, когда транквиридин почти вдвое снижал горизонтальную активность, в 2,5 раза - вертикальную активность, в 5 раз - исследовательскую активность, и в 3 раза - эмоциональность (болюсы дефекации). Более умеренное анксиолитическое действие отмечено у транквиридина 50 мг/кг по показателям горизонтальная, вертикальная и исследовательская активность и транквиридина 10 мг/кг по показателям исследовательская активность. В этой дозе транквиридин 10 мг/кг, так же, как и транквиридин 50 мг/кг снижал данный показатель (число заглядываний в норки) в среднем в 3 раза (рис. 4).
Таблица 4. Влияние транквиридина и диазепама на поведение в тесте «открытое поле» у крыс с активным типом эмоционально-стрессовой реакции_
Показатели Контроль (физ. р-р) Диазепам 1 мг/кг Транквиридин
10 мг/кг 50 мг/кг 100 мг/кг
Число пересеченных квадратов 32,8±2,3 14 4±1 4*** 27,4±3,1** 23,3±2,5*" 17,8±2,8***
Вертикальная активность 2,9±0,5 0,8±0,3** 2,5±0,4* 1,5±0,4* 1,3±0,3**
Число заглядываний в норки 7,1±0,9 0,8±0,3*** 2,4±0,7*** 2,3±0,7*** 1,4±0,7***
Болюсы дефекаций 0,9±0,4 0,2±0,1 0,5±0,3 0,5±0,3 0,3±0,2
Примечание. * р<0,05, * р<0,01, *** р<0,001 в сравнении с группой контроля, # р<0,05, ## р<0,01 - в сравнении с группой диазепама
Таким образом, у крыс с активным типом эмоционально-стрессовой реакции диазепам 1 мг/кг проявлял типичный выраженный анксиолитический эффект, сходный с таковым для крыс с пассивным типом эмоционально-стрессовой реакции. Транквиридин во всех исследованных дозах (10, 50, 100 мг/кг) также выявлял анксиолитический эффект, причем в дозе 100 мг/кг эффекты диазепама и транквиридина были близки по значениям, а в дозах 50 мг/кг и в меньшей степени 10 мг/кг анксиолитические эффекты транквиридина были слабее, чем у диазепама 1 мг/кг. Тест «открытое поле» у крыс с активным типом эмоционально-стрессовой реакции оказался более чувствительным для оценки анксиолитических свойств препаратов, в частности транквиридина, чем тест «открытое поле» у крыс с пассивным типом эмоционально-стрессовой реакции.
Исследования в тесте конфликтной ситуации проводили в течение двух дней. В первый день животных обучали инструментальной реакции захождения в темный отсек для осуществления питьевого поведения на фоне депривации от воды. В этот день эксперименты проводили без введения препаратов, поэтому не фиксировали время захода в темную камеру. Отметим лишь, что все крысы в течение двух первых минут заходили в темный отсек и пили воду, не выходя из него. На следующий день производили регистрацию поведения в тесте конфликтной ситуации на фоне действия препаратов (вводили за 1 ч. до помещения животных в установку). Все крысы в экспериментальной камере сразу находили темный отсек с поилкой, заходили в него, получали удар тока по лапам и проявляли реакцию избегания в светлый отсек.
Латентный период захождения в темный отсек был достоверно больше при использовании диазепама 1 мг/кг и транквиридина 100 мг/кг (табл. 5). Животные на фоне введения диазепама и транквиридина достоверно больше заходили в темный отсек с поилкой по сравнению с группой
контроля и получали каждый раз наказание ударом электрического тока по лапам, проявляя тем самым транквилизирующее действие. Транквиридин проявлял дозозависимый эффект, в дозе 100 мг/кг его действие было сравнимо с эффектом диазепама. Животные на фоне введения диазепама и транквиридина достоверно меньше заглядывали в темный отсек с поилкой по сравнению с группой контроля, проявляя тем самым седативное действие.
Таблица 5. Влияние транквиридина и диазепама на поведение в тесте конфликтной ситуации (наказуемого потребления воды) у крыс 2-й день эксперимента_
Показатели Контроль (физ. р-р) Диазепам 1 мг/кг Транквиридин
10 мг/кг 50 мг/кг 100 мг/кг
Число захождений в темный отсек 3,3±0,6 7,3±0,9* 4,6±0,8 5,3±1,0 6,7±0,8*
Число заглядываний в темный отсек с поилкой 34,9±3,5 17,9±1,8*** 29,4±2,7# 24,8±1,9* 20,6±2,9**
ЛП захождений в темный отсек с поилкой (сек) 4,4±0,6 10,4±1,3** 6,8±1,2 7,3±1,1 8,8±1,3*
Время нахождения в светлом отсеке (сек) 32,9±5,8 251,7 ±24,1*** 90,5 ±12,4### 129,8 ±22,3**## 192,3 ±28,9***
Примечание. *р<0,05, *р<0,01, ***р<0,001 в сравнении с группой контроля, #р<0,05, ##р<0,01, ###р<0,001 - в сравнении с группой диазепама. Экспозиция - 10 мин. ЛП - латентный период
Таким образом, транквиридин в тесте конфликтной ситуации проявлял анксиолитическое и умеренное седативное действие, при этом его эффекты зависели от дозы. В дозе 100 мг/кг действие транквиридина было сопоставимо с эффектом диазепама 1 мг/кг. В дозах 50 мг/кг и 10 мг/кг транквиридин проявлял более умеренное анксиолитическое действие.
С целью выяснения нейромедиаторного механизма действия транквиридина исследовали его эффекты на содержание дофамина, серотонина и их метаболитов в стриатуме крыс. Крысам в течение 5 дней вводили диазепам 1 мг/кг или транквиридин 100 мг/кг. На 5-й день через 2 ч. после последнего введения препаратов животных декапитировали, извлекали головной мозг, выделяли стриатум (дофаминергическая структура мозга) и определяли в нем содержание дофамина и его метаболитов (ДОФУК, ГВК), а также соотношение ДОФУК/дофамин и ГВК/дофамин, характеризующее скорость обмена дофамина (табл. 6).
Таблица 6. Влияние транквиридина и диазепама при хроническом введении на содержание дофамина и его метаболитов в стриатуме крыс (нг/мг ткани)
Группа животных ДА ДОФУК ГВК ДОФУК/ДА ГВК/ДА
Контроль (физ. р-р) 4,457±0,714 0,483±0,050 0,131±0,014 0,115±0,010 0,030±0,002
Диазепам 1 мг/кг 5,243±0,583 0,400±0,052 0,147±0,016 0,078±0,009* 0,028±0,002
Транквиридин, 100 мг/кг 5,454±1,074 0,413±0,053 0,181±0,021 0,083±0,009* 0,037±0,004
Примечание: Препараты вводили в течение 5 дней ежедневно. Декапитацию осуществляли через 2 ч. после последнего введения препаратов. *р<0,05 в сравнении с контролем. ДА - дофамин, ДОФУК - диоксифенилуксусная кислота, ГВК - гомованилиновая кислота
Хроническое (в течение 5 дней) введение диазепама 1 мг/кг не меняло содержания дофамина, ДОФУК и ГВК в стриатуме, но на 47% снижало отношение ДОФУК/дофамин, что указывает на замедление обмена дофамина в стриатуме под воздействием препарата. Отношение ГВК/дофамин при этом не менялось.
Хроническое (5 дней) введение транквиридина 100 мг/кг оказывало сходный с диазепамом эффект: содержание дофамина и метаболитов (ДОФУК, ГВК) при этом не менялось, но на 39% замедлялся обмен дофамина в стриатуме, характеризуемый отношением ДОФУК/дофамин.
Содержание серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриатуме, равно как и отношение 5-ГИУК/серотонин при этом не менялись (табл. 6), что указывает в основном на дофаминергический тип действия транквиридина и диазепама.
Следовательно, диазепам 1 мг/кг и транквиридин 100 мг/кг при хроническом (5 дней ежедневно) введении замедляет обмен дофамина в стриатуме крыс, не меняя обмена серотонина. Изменение
метаболизма дофамина характеризуется уменьшением соотношения ДОФУК/дофамин (на 47% в случае введения диазепама и 39% в случае введения транквиридина. Со стороны серотонинергической системы не наблюдали каких-либо достоверных изменений. Полученные данные свидетельствуют о сходном влиянии препаратов диазепама и транквиридина на активность моноаминергических систем мозга. При этом оба препарата обладают антидофаминергическим типом действия, замедляя обмен дофамина в головном мозге животных.
Таблица 6. Влияние транквиридина и диазепама при хроническом введении на содержание серотонина и его метаболитов в стриатуме крыс (нг/мг ткани)_
Группа животных СЕР 5-ГИУК 5-ГИУК/СЕР
Контроль (физ. р-р) 0,488±0,026 0,309±0,015 0,638±0,035
Диазепам 1 мг/кг 0,636±0,067 0,344±0,020 0,583±0,091
Транквиридин 100 мг/кг 0,635±0,040 0,334±0,022 0,538±0,046
Примечание. Препараты вводили в течение 5 дней ежедневно. Декапитацию осуществляли через 2 ч. после последнего введения препаратов. СЕР - серотонин, 5-ГИУК - 5-гидроксиуксусная кислота
С целью уточнения клеточных механизмом действия транквиридина исследовали его влияние на внутриклеточные потенциалы и ионные токи нейронов моллюсков. В первой серии экспериментов на изолированной ЦНС катушки показано, что исходные величины потенциала покоя (ПП) для разных нейронов катушки (п=15) варьировали от -5 до -60 мВ, нейроны генерировали потенциал действия (ПД) амплитудой от 50 до 90 мВ с «овершутом», что указывало на их хорошее исходное функциональное состояние. Некоторые из клеток были молчащими, а преимущественно - с различным характером импульсной активности (ИА): регулярной или нерегулярной, одиночной или пачечной. Большинство результатов получено на импульсноактивных нейронах педальных ганглиев.
Под влиянием транквиридина в диапазоне концентраций от 1 мкМ до 10 мМ в целом происходили зависимые от концентрации незначительные (на 2-5 мВ) гипер- или деполяризационные изменения ПП с соответствующими изменениями ИА, параметров ПД и скоростей развития ПД отражающих суммарные входящие и выходящие ионные токи). Эффекты стабилизировались в течение 1-3 мин. от начала действия веществ, они были обратимы в течение 2-10 мин. Перестройка ИА была разнообразной, что зависело от типа нейронов, величины ПП (уровня функционального состояния), характера фоновой ИА и концентраций соединений. Таким образом, хотя исходные параметры электрической активности различных нейронов и их реакции на вещества были вариабельными, но характерные тенденции эффектов повторялись.
В табл. 7 представлены результаты обработки характера изменений ИА по средней частоте и по ряду других параметров.
Таблица 7. Результаты обработки изменений параметров импульсной активности нейрона ППед1
под влиянием транквиридина
Параметры Норма (100%) Концентрации транквиридина, 1*10п
-6 -5 -4 -3 0,5* (-2) отмыв
%
Средняя частота (имп/с) 0,29 51,7 44,8 72,4 93,1 127,6 444,8
Средний период (мс) 3393 189,1 225,2 137,9 107,3 78,2 22,8
Средняя амплитуда (мВ) 84,2 95,0 90,3 87,2 86,4 84,4 84,8
Самый короткий интервал (мс) 637,9 124,0 146,8 132,6 125,3 118,2 52,9
Самый длинный интервал (мс) 13801 248,3 215,6 317,0 245,2 264,4 40,0
Общее число ПД (п) 47 39 40 54 71 107 340
Подобный характер изменения электрической активности нейрона ППед1 в другом эксперименте представлен на рис. 1. Происходило снижение частоты ПД под влиянием транквиридина в концентрациях от 1*10-6 до 1*10-3 и ее увеличение - при действии транквиридина в концентрации 10 мМ и в следовом порядке при отмывании.
Во второй серии экспериментов на изолированных нейронах катушки и прудовика в условиях фиксации мембранного потенциала было показано, что под влиянием транквиридина в
концентрациях 1 мкМ-10 мМ изменения ионных токов были слабо дозозависимы и по величине незначительны. Все изменения ионных токов под влиянием соединения наступали в течение 1 мин, а их восстановление при отмывании было замедленным (3-5 мин.). Неспецифические токи утечки мембраны нейронов под влиянием транквиридина существенно не изменялись.
Норма
■ ЧА.
-6 (А)
-5
-4
-3
10 ММ
Отмыв
N
1
2 мин
Рис. 1. Изменения электрической активности нейрона ППед1 катушки под влиянием транквиридина в различных концентрациях (1 х 10-6 до 1х 10-2)
Зависимости «концентрация-эффект» для натриевых и кальциевых токов представлены на рис. 2, (А, Б) и в табл. 8.
Таблица 8. Исходные данные для построения зависимостей «концентрация-эффект»
Концентрация транквиридина, мкМ № токи, п=6 Са токи, п=7 К токи, п=10
(М) Ш (М) Ш (М) Ш
1 100,4 1,8 100,5 0,6 105,8 2,3
10 98,2 2,7 100,3 2,7 107,8 2,9
100 95,4 3,5 99,3 4,4 98,0 4,5
1000 93,4 3,8 97,8 4,9 91,1 4,2
10000 85,6 4,5 95,1 5,1 80,3 6,8
В качестве примера на рис. 2, А и Б приведены и записи суммарных входящих натрий-кальциевых токов при действии транквиридина в концентрациях 1 х 1о-6 и 1 х 10-5 М. Все кривые (4 кривых) практически сливаются, т.е. изменения амплитуд токов не более 5% от нормы. Выраженное снижение амплитуд входящих токов происходило под влиянием соединений в концентрациях 1 и 10 мМ. Видно, что амплитуда натриевых токов снижалась в большей степени, чем кальциевых. Кинетика развития (активации и инактивации) входящих токов не изменялась.
Амплитуда калиевых медленных токов под влиянием транквиридина изменялась двухфазно: при его действии в концентрациях 1 х 10-6 и 1х10-5 М она незначительно (на 4-7%) возрастала, а при более высоких концентрациях - снижалась, например, при 10 мМ до 70-80% от нормы (рис. 2, В и Г). Изменения были обратимы. Быстрые калиевые токи изменялись так же, как и медленные. Следовательно, транквиридин оказывает заметным мембранотропным (модулирующим) действием на функциональное состояние нейронов.
Таким образом, впервые полученные данные о сравнительных изменениях электрофизиологических параметров нейронов под влиянием нового анксиолитика транквиридина убедительно свидетельствуют о его существенно выраженных мембранотропных эффектах, что может указывать на его возможную широкую терапевтическую активность. Эта активность действительно может быть анксиолитической, или, по крайней мере, депримирующей. Это предположение основывается на том, что при действии транквиридина в концентрациях 1х10-6 и 1х 10-5 М показана сходная незначительная дозозависимая (зависимая от концентрации) и обратимая гиперполяризация нейронов. Она может приводить к снижению возбудимости
нейронов, уменьшению частоты ИА и к расширению функциональных возможностей клеток. Незначительная деполяризация нейронов при действии соединения в более высоких концентрациях, небольшое подавление амплитуд натриевых, кальциевых и калиевых токов также могут являться в определенной степени «успокаивающим» нейроны фактором. При этом деполяризация нейронов и увеличение частоты электрической активности могут указывать на активирующий эффект исследованных соединений. Следует отметить, что указанные эффекты проявлялись в широком диапазоне концентраций, что может характеризовать транквиридин, как вещество с широким диапазоном терапевтической активности и малотоксичное.
Рис. 16. Изменения трансмембранных натриевых, кальциевых (А, Б) и калиевых медленных (В, Г) ионных токов нейронов моллюсков под влиянием транквиридина в различных концентрациях (п=6-10).
Примечание. А - слабые эффекты транквиридина в концентрациях 1*10-6 и 1*10-5 М (4 кривых - норма, 2 кривых при действии соединения и отмывание сливаются); Б: 1 - контроль, транквиридин 2 - 10 мМ, 3 - отмывание); В - транквиридин (кривые под стрелкой сверху-вниз: 1*10-5, 1х10-6, норма, 1*10-3, частичное отмывание и 5 мМ); Г: 1 - контроль, 2 - транквиридин 10 мМ, 3 -отмывание; По оси абсцисс - время (А) и пилообразное напряжение от -40 до 100 мВ при длительности 50 мс (Б); по оси ординат -ионные токи (I - при действии вещества, 10 - до действия); Ша - натриевый ток; 1Са - кальциевый ток; 1К - калиевый медленный ток; доверительные интервалы при р = 95%. На всех кадрах: поддерживаемый потенциал (УЬ) = -90 мВ, тестирующие (VI) -10 мВ, при исследовании медленных калиевых токов - 30 мВ
За указанными клеточными эффектами транквиридина стоят определенные молекулярные механизмы их действия. В принципе, деполяризация клеточных мембран может быть связана с подавлением электрогенной части в работе натрий-калиевого насоса и с изменениями пассивной проницаемости клеточных мембран к ионам натрия, кальция или калия при действии новых соединений. Однако, поскольку неспецифические токи утечки мембраны изменялись незначительно, то вклад изменений пассивной ионной проницаемости мембраны, вероятно, незначителен [1, 2]. Гиперполяризацию клеток при действии нового соединения или после его действия можно объяснить усилением вклада в величину ПП электрогенной составляющей натрий-калиевого насоса, а также и снижением пассивной проницаемости к ионам натрия и кальция, или повышением ее к ионам калия [2, 12]. Не исключается участие в этих процессах ионов хлора или каких-либо клеточных (мембранных) рецепторов.
Кроме всего перечисленного, среди молекулярных мишеней можно рассматривать и мембранные липиды, поскольку липотропное действие веществ на мембраны может приводить к увеличению их текучести и оказывать так называемое разжижающее действие. А последнее приводит к изменениям жидкокристаллического состояния мембран, возрастает подвижность молекул липидов и белков в ее липидном бислое. Известно, что изменения фазового состояния мембраны оказывают существенное влияние на процессы мембранного транспорта, на системы трансмембранной передачи информации, на активность мембраносвязанных ферментов [1]. Могут изменяться нейромедиаторные процессы, функционирование ферментов и ионных каналов.
Изменения суммарных ионных токов, параметров ПД и ИА нейронов под влиянием транквиридина обусловлены как соответствующими изменениями ПП, так и незначительным прямым влиянием на потенциалоуправляемые ионные каналы [2, 12].
Таким образом, можно сделать основной вывод, что транквиридин через изменения ПП и ионных токов нейронов модулируют их функциональную активность. Он оказывает как «успокаивающее», так и активирующее действие на электрическую активность нейронов. Молекулярные механизмы разнонаправленных клеточных эффектов транквиридина до конца пока не ясны, что требует дополнительных специальных исследований.
Заключение
Во всех поведенческих исследованиях на грызунах (крысы, мыши) было показано, что транквиридин в широком диапазоне доз (10, 50, 100 мг/кг) оказывает анксиолитическое действие. Об этом свидетельствуют результаты поведенческих экспериментов в открытом поле, темной/светлой камере, конфликтной ситуации (наказуемое потребление воды), при оценке поведения крыс с активной и пассивной эмоциональной стратегией. В дозе 100 мг/кг анксиолитический эффект транквиридина был сопоставим с таковым диазепама 1 мг/кг. В дозе 50 мг/кг транквиридин проявил умеренный анксиолитический эффект, характерный для дневных транквилизаторов. В дозе 10 мг/кг транквиридин в большинстве тестов был неактивным. Следовательно, эффекты транквиридина зависели от дозы, их выраженность возрастала с увеличением дозы вводимого вещества. Подтверждением транквилизирующего действия транквиридина стало выявление антидофаминового типа действия препарата, когда транквиридин 100 мг/кг, сходно с диазепамом 1 мг/кг, замедлял обмен дофамина в стриатуме крыс (хроническое введение препаратов), не влияя на содержание и обмен серотонина. Кроме того, транквиридин в широком диапазоне концентраций (от 10 мкМ до 10 мМ) вызывал урежение частоты импульсной активности изолированных нейронов моллюсков, которое происходило на фоне незначительной гиперполяризации. В этих же условиях эксперимента транквиридин умеренно подавлял входящие натриевые токи (не меняя кальциевых) и оказывал двухфазное действие на медленные калиевые токи: в концентрациях 1 х 10-6 и 1х10-5 М препарат их незначительно активировал, а в более высоких концентрациях - снижал. Полученные экспериментальные данные подтверждает наличие у транквиридина анксиолитического эффекта. Предполагаемым механизмом фармакологического действия транквиридина можно рассматривать функциональный антидофаминовый эффект (замедление обмена дофамина) и прямое снижение импульсной активности нейронов.
Литература
1. Вислобоков А.И., Игнатов Ю.Д., Галенко-Ярошевский П.А., Шабанов П.Д. Мембранотропное действие фармакологических средств. - Санкт-Петербург - Краснодар: Просвещение-Юг, 2010. - 528 с.
2. Вислобоков А.И., Шабанов П. Д. Клеточные и молекулярные механизмы действия лекарств. - Серия: Цитофармакология. Т. 2. - СПб.: Информ-Навигатор, 2014. - 624 с.
3. Карпова И.В., Михеев В.В., Марышева В.В., Бычков Е.Р., Шабанов П. Д. Влияние острой гипоксии с гиперкапнией на содержание моноаминов в симметричных структурах головного мозга самцов мышей линии Balb/c // Биомедицинская химия. - 2014. - Т.60, №2. - С.258-263.
4. Костяновский Р.Г., Шустов Г.В. Набиев О.Г. и др. Синтез и психотропная активность функционально замещенных диазиридинов и бисдиазиридинов // Химико-фармацевтический журнал. - 1986. - Т.20, №6. - С. 671-674.
5. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А. Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П. Фисенко. - М.: МЗ РФ, 2000. - С. 126-130.
7. Шабанов П. Д. Психофармакология. - СПб.: Н-Л, 2008. - 362 с.
8. Шабанов П. Д. Наркология. Изд. 2-е. - М.: Гэотар-Медиа, 2012. - 832 с.
9. Шабанов П.Д., Морозов А.И., Бычков Е.Р. и др. Фармакология нового анксиолитика, производного диазиридина // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2015. - Т.13, Спецвыпуск. - С. 191.
10. Шабанов П. Д., Морозов А.И., Бычков Е.Р., Лебедев А.А., Махова Н.Н. Фармакология нового атипичного нейролептика диазлептина, производного диазиридина // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2015. - Т.13, Спецвыпуск. - С. 191-192.
11. Шабанов П. Д., Морозов А.И., Лебедев А.А., Бычков Е.Р., Шевцов А.В., Махова Н.Н. Фармакология транквиридина, нового анксиолитика, производного 1,2-диазациклопропана // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2015. - Т.13, №4. - С. 22-28.
12. Camerino D.C., Tricarico D., Desaphy J.F. Ion channel pharmacology // Neurotherapeutics. - 2007. - V.4, N2. -P. 184-198.
13. Makhova N.N., Petukhova V.Y., Shevtsov A.V. et al. Agents for treating neurodegenerative disorders // WIPO PCT WO 2013/111118 A2 from 01.08.2013. - P. 1-51.
14. Narahashi T. Neuroreceptors and ion channels as the basis for drug action: past, present, and future // Journal of Pharmacology and Experimental Therapy. - 2000. - V.294, N1. - P. 1-26.
15. Paget C.J., Davis C.S. Synthesis and in vitro activity of some aryl diaziridines as potential monoamine oxidase inhibitors // Aryl Diaziridines and MAO / Ed. by M.E. Freed, E. Hertz, L.M. Rice. New York; London: Plenum press, 1964. - V.7. - P. 626-628.
16. Shevtsov A.V., Petukhova V.Y., Novakovskiy V.V., Makhova N.N. Diaziridine derivatives for treating mental disorders // WIPO PCT WO 2012/042502 A1 from 05/04/2012. - P. 1-43.
Информация об авторах
Шабанов Петр Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». E-mail: [email protected]
Морозов Александр Иванович - аспирант отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». E-mail: [email protected]
Лебедев Андрей Андреевич - доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». E-mail: [email protected]
Бычков Евгений Рудольфович - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». E-mail: [email protected]
Вислобоков Анатолий Иванович - доктор биологических наук, научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». E-mail: [email protected]
