CC BY
141
© ЗАХАРОВА Л.Н., БАЛТАБАЕВА А.К., ПИМЕНОВА Ю.А.,
АГЕЕВА Т.А., ЕВСТРОПОВ А.Н.
УДК 616.94-022.7:579.353-091.8
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СТАФИЛОКОККОВАЯ ИНФЕКЦИЯ: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Л.Н. Захарова, А.К. Балтабаева, Ю.А. Пименова,
Т.А. Агеева, А.Н. Евстропов Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.О. Маринкин; кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, зав. - д.м.н. проф. А.Н. Евстропов.
Резюме. При экспериментальной стафилококковой инфекции у крыс выявлено два типа реагирования животных на инфицирование, отличавшиеся продолжительностью пребывания микроба в организме. Динамика соотношения ИЛ-1р/ИЛ-4 носила двухфазный характер с преобладающим влиянием провос-палительного цитокина. Изменения содержания иммуноцитов в клеточных инфильтратах печени позволяют предполагать гуморальный механизм реакции иммунной системы на инфекцию.
Ключевые слова: стафилококковая инфекция, цитокины, нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты.
Захарова Людмила Николаевна - к.м.н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии НГМУ; e-mail: nisngma@ngs.ru.
Пименова Юлия Александровна - ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии; тел. 8(383)2226835.
Балтабаева Асем Кенжегалиевна - к.м.н., врач-микробиолог Национальный научный центр материнства и детства Республики Казахстан; тел. 8(7172)701454.
Проблемы, связанные со стафилококковой инфекцией, не теряют остроты до настоящего времени. Они обусловлены высокой биологической пластичность патогена, тяжестью и разнообразием форм стафилококковой инфекции, его ведущей ролью как микроба-оппортуниста при самых разных видах патологии [1,2]. В то же время при всей актуальности проблемы до сих пор остаются неясными проблемы возникновения носительства, отсутствуют четкие представления о закономерностях распространения микроба в организме.
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось изучение динамики распространения инфекционного агента при экспериментальной стафилококковой инфекции и оценка некоторых реакций иммунной системы, сопровождающих элиминацию микроба из организма животных.
Материалы и методы Исследования были проведены на 160 самцах крыс Wistar массой 180-200 г. Животные содержались в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных и с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных приказом МЗ РФ. Суточную культуру S. aureus в объеме 1 мл в концентрации 1-109 микробных клеток/кг вводили внутрибрюшинно. В качестве контрольной группы использованы крысы, которым внутрибрюшинно вводили 1 мл стерильного физиологического раствора.
Через 1, 3, 6, 12 часов и 1, 2, 3, 7, 9, 14 суток под эфирным наркозом животных декапитировали. Для бактериологического исследования забирали кровь, перитонеальную жидкость, мезентериальные и паравертебральные лимфатические узлы, печень и селезенку. Образцы взвешивали, измельчали, растирали в ступке со стерильным стеклом в физиологическом растворе из расчета 1:10. Материал центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант разводили далее в 100 раз и по 0,1 мл высевали на ЖСА в чашках Петри. Посевы инкубировали при температуре +37°С в течение 24 часов. После учета выросших колоний производили пересчет их количества на 1 г исследуемого ма-
териала. Количество выделенных микробов выражали в колониеобразующих единицах в 1 г материала (КОЕ/г).
Для определения цитокинов кровь забирали в сухие центрифужные пробирки, отстаивали 1 ч при комнатной температуре, и 1 ч при +4°С. После центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин получали сыворотку, которую замораживали и хранили при t=-20°C. Определение концентрации цитокинов ИЛ-1Р и ИЛ-4 в сыворотке крови экспериментальных животных проводилось на тест-системах BioSource International, Inc., (каталожные номера KRC0011, KRC0041) по инструкции производителя. Концентрацию цитокинов выражали в пикограммах на 1 мл сыворотки (пг/мл).
Для приготовления гистологических срезов ткань печени фиксировали в нейтральном формалине, проводили в серии спиртов возрастающей концентрации, изготавливали парафиновые блоки и срезы, окрашивали их гематоксилином и эозином. Клеточный состав инфильтратов печеночной ткани изучали при увеличении в 900 раз. В каждом срезе подсчитывали по 500 клеток. Общее количество подсчитанных клеток принимали за 100% и вычисляли процентное содержание клеточных элементов: макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов, плазматических клеток, эозинофилов.
Статистическая обработка результатов исследований выполнена методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ "Statistica v.6,0» (StatSoft Inc., USA). Для установления взаимосвязи признаков был проведен корреляционный анализ по Пирсону (при нормальном распределении). Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты и обсуждение У всех зараженных животных установлена общая тенденция: максимальное накопление тест-микроба в исследуемых органах ретикуло-эндотелиальной системы наблюдалось через 1 час после инфицирования, через 3 часа - резкое снижение содержания микроба, а далее постепенное, но неуклонное его уменьшение, вплоть до полной элиминации. Такая картина объясняется тем, что микробы из брюшной полости попадают преимущественно в лимфатиче-
ское русло, вероятно размножаются в лимфатических узлах и с рециркулирующими лимфоцитами возвращаются в лимфоидные органы [5]. Однако концентрация микроба и сроки освобождения органов от микроба у разных животных существенно различались: у одних животных тест-микроб длительно и в большом количестве обнаруживался в исследуемых органах 1-я группа, другие же освобождались от микроба быстрее и содержание стафилококка в органах было меньшим - (2-я группа (табл. 1). В контрольной группе животных S. Aureus не высевался.
Поскольку в основе процесса взаимодействия макро- и микроорганизма лежит запуск цитокинового каскада, который включает, с одной стороны, про-воспалительные цитокины, а с другой - противовоспалительные медиаторы, то баланс между этими ними во многом определяет характер течения и исход такого взаимодействия [3,4].
Цитокиновый профиль у животных 1-й и 2-й групп характеризовался некоторыми общими закономерностями. Так, концентрация ИЛ-1Р характеризовалась волнообразным изменением в обеих группах. Но уровень ИЛ-1Р в сыворотке крови животных 1-й группы был, в основном, выше или на уровне контроля (27,4-22,8 пг/мл), животные 2-й группы характеризовались, наоборот, низкими значениями ИЛ-1Р (19,7-10,9 пг/мл). Уровень ИЛ-4 в сыворотке крови животных 1-й группы был выше контрольных значений только через 3 часа после инфицирования (12,7 и 9,8 пг/мл соответственно), в остальное время он был достоверно ниже контрольных значений и только к 14 суткам эксперимента ИЛ-4 достиг контрольных значений. Животные 2-й группы характеризовались низкими значениями ИЛ-4 от 4,7 до 2,1 г/мл, которые достоверно отличались от контроля.
В такой ситуации показательным, на наш взгляд, является коэффициент, представляющий собой соотношение концентрации про- и противовоспалительных цитокинов у животных, который будет свидетельствовать об изменении баланса интерлейкинов и сдвигах в иммунном реагировании [6]. Динамика соотношения ИЛ-1 р/ИЛ-4 в сыворотке крови крыс имела двухфазный характер
(рис. 1): подъем в ранние сроки инфекционного процесса (через 6 часов от начала исследования коэффициент превышал контроль в 2-2,4 раза), снижение на 3 сутки и повторный подъем на 7 сутки исследования (коэффициент превышал контроль в 2,5 раза), возвращаясь к 14 суткам к контрольным значениям. Причем наибольшим коэффициент был в первые 3 суток во 2-й группе. Следовательно, у экспериментальных животных имеется значительное повышение коэффициента ИЛ-^/ИЛ-4, что свидетельствует о преобладающем влиянии про-воспалительных цитокинов над противовоспалительными в динамике инфекционного процесса.
При изучении клеточного состава инфильтратов печени у животных 1-й группы получение следующие результаты. Через 3 часа после введения микроба количество нейтрофилов составило 5,6±1,5%, а через 12 часов увеличилось до 12,8±1,05 %, что значительно превышало показатели контрольной группы (0,4±0,14). Затем их число постепенно уменьшалось и на 9 сутки эксперимента составило 0,8±0,12 %. Количество эозинофильных лейкоцитов через 3 часа от начала исследования составило 11,7±1,17% (в группе контроля - 8,2±1,0%). Начиная с 6 часов исследования, наблюдалось их снижение, составив к 9 суткам 2,8±0,42%. Количество плазматических клеток через 3 часа после введения стафилококка составило 2,2±0,6%, максимальное их содержание было через 12 часов - 11,6±1,17%, а затем происходило постепенное снижение - на 2 сутки до 5,5±1,6, на 3 сутки - до 1,7±0,28%. Количество плазматических клеток на 9 день исследования составило 0,75±0,18%. В контрольной группе животных количество плазмоцитов составило 0,52±0,1%. Количество макрофагов в 1 группе животных в сравнении с контрольными показателями (57,9±1,5%) через 3 часа после введения тест-микроба составило 36,4±3,5%, через 12 часов эксперимента снизилось до 27,7±1,4%. Через 1 сутки наблюдалось их постепенное увеличение (39,8±3,05%) и к 9 суткам количество макрофагов составило 40,3±4,05%. Процент лимфоцитов, напротив, был выше контроля в начале исследования -41,2±1,83% (в контроле - 32,9±1,0%) и продолжал нарастать в ходе экспери-
мента, достигнув максимума на 7 сутки - 58,3±2,6% и сохраняя высокий уровень до конца исследования.
Клеточный состав инфильтратов печени 2-й группы животных характеризовался максимальной концентрацией нейтрофилов через 6 часов после заражения - 5,9±1,53%, далее их количество постепенно снижалось и к 9 суткам составило 0,4±0,14%. В этой группе животных также отмечено высокое содержание эозинофилов к 12 часам (21,0±0,60%) в отличие от 1-й группы (5,9±1,67%), где число эозинофилов было максимальным только в первые 3 часа опыта. Количество плазматических клеток через 3 и 6 часов было в 2,3-2,5 раза больше, чем в 1-й группе. Доля макрофагов и лимфоцитов в инфильтратах печени животных 2-й группы, в сравнении с 1-й группой, существенно не различалась.
Анализируя элиминацию тест-микроба из организма инфицированных животных, изменение количества клеточных элементов в печеночной ткани, а также концентрацию про- и противовоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови, можно сделать вывод, что, развиваясь по гуморальному типу, ответная реакция со стороны клеток иммунной системы на бактериальную агрессию носит двухвариантный характер. Несмотря на интенсивную миграцию нейтрофилов, тест-микроб длительно циркулировал в организме животных 1-й группы. Большое количество плазматических клеток на ранней стадии инфекции, преобладание ИЛ-1Р обеспечило более раннюю элиминацию инфекционного агента из организма животных 2-й группы.
EXPERIMENTAL STAPHYLOCOCCAL INFECTION: MICROBIOLOGICAL AND IMMUNOLOGICAL ASPECTS
L.N. Zaharova, A.K. Baltabaeva, Y.A. Pimenova, T.A. Ageeva, A.N. Evstropov
Novosibirsk State Medical University
Abstract. During the experimental staphylococcus infection in rats there were revealed two response types differentiated by duration of microbe staying in the organism. The dynamics of IL-1B/IL-4 had double phase character with dominant influence of proinflammatory cytokine. Changes in immunocytes content in liver cell infiltrates allow humoral mechanism of immune reaction to infection.
Key words: staphylococcal infection, cytokines, neutrophils, macrophages, lymphocytes.
Литература
1. Белобородов В.Б. Стафилококковые инфекции // Инфекции и антимикробная терапия. - 2003. - Т.5, №1. - С. 12-18.
2. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова О.Л. Биология патогенных кокков. - М., Медицина, 2002. - 252 с.
3. Останин А.А., Петлина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Цитокин-опосредованные механизмы развития системной иммуносупрессии у больных с гнойно-хирургической патологией // Цитокины и воспаление. -2002. - Т.1, №1. - С.38-45.
4. Симбирцев А.С. Цитокины: классификация и биологические свойства // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т.3, №2. - С.16-22.
5. Хорошаев В.А., Ворожейкин В.М., Байбеков И.М. Маршруты резорбции перитонеальной жидкости в диафрагме при циррозе печени (морфологическое изучение) // Бюлл. эксперим. биологии и медицины -1991. - Т.111, №4. - С.430-432.
6. Takeshi U., Sadar M.D., Suzuki H. et al. Interleukin-4 in patients with prostate cancer // Anticancer Res. - 2005. - Vol. 25, № 6. - P. 4595-4598.
