CC BY
13УДК [615.917:623.459].015:614.77
С.А.Демидова*, Е.Ю.Максимова, А.А.Масленников, Е.В.Юдина
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ТОКСИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ КОЖНО-НАРЫВНОГО И НЕРВНО-ПАРАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА МИКРОБОЦЕНОЗ ПОЧВЫ
«Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии», Волгоград
В экспериментальных исследованиях определены подпороговые уровни воздействия ипритно-люизитной смеси (3 мг/кг) и зарина (0,005 мг/кг) на микробоценоз почвы.
Ключевые слова: ипритно-люизитная смесь, зарин, почва, микробоценоз, подпороговый уровень.
Введение. Утвердившаяся в России концепция безопасности процесса химического разоружения предусматривает создание научно и технически обоснованной системы мониторинга уничтожаемых отравляющих веществ (ОВ) в различных объектах окружающей среды, включая почву
После попадания в почву ОВ начинается сложная цепь физико-химических, химических и микробиологических превращений. Все это не может не сказаться на биологических свойствах почвы.
В этой связи особый как научный, так и практический интерес представляет оценка токсического воздействия на почву веществ кожно-нарывного (ипритно-люизитная смесь — ИЛС) и нервно-паралитического действия (зарин).
Данные исследования являлись составной частью работ по обоснованию гигиенических нормативов содержания указанных соединений в почве.
Материалы и методы исследования. Токсичное влияние ИЛС и зарина на почвенный микробо-ценоз оценивали по общей численности микроорганизмов двух основных физиологических групп: бактерий и почвенных грибов [3, 4].
При проведении исследований в качестве бактериальных тест — объектов выбраны: сапрофитные и Escherichia coli. Сапрофитные бактерии представляют наиболее многочисленную и активную группу почвенного микробоценоза, играющую важную роль в любых процессах самоочищения почвы (разложение органических соединений синтетического, растительного и животного происхождения). Е. coli как патогенная микрофлора является индикатором загрязнения. Возрастание количества колоний данных бактерий свидетельствует о торможении процесса самоочищения почвы.
Целесообразность включения в исследования почвенных грибов, участвующих в минерализа-
* Фрагмент диссертационной работы
ции органических веществ и образовании гумуса, обусловлена тем, что последние, как известно, являются высокочувствительной группой почвенной микрофлоры к воздействию ксенобиотиков [5-7].
Для соблюдения принципа экстремальности эксперименты выполнены с использованием смеси модельного почвенного эталона (МПЭ) и образцов почв при температуре 20-25°С и влажности 60% от полной влагоёмко-сти (ПВ). Модельный почвенный эталон — предварительно подготовленный карьерный среднемелкозернистый песок, отобранный с глубины 3-х метров от поверхности почвы [3]. Образцы почв по составу были идентичны почвам районов размещения объектов уничтожения фосфорорганических (лесной чернозем) и кожно-нарывных (степная подзолистая почва) ОВ.
В течение всего периода исследований (14 суток) сосуды с модельной почвой (загрязненной и незагрязнённой веществами) выдерживались при комнатной температуре (20-25°С) в темноте и постоянной влажности (60% от ПВ), которая поддерживалась на указанном уровне путем ежедневного добавления 10 мл/кг дехлорированной водопроводной воды. Показатели рН-среды водных вытяжек из почвы, приготовленных при соотношении МПЭ: вода — 1:10, были нейтральными (рН 7-8) [3-5].
В почвенных образцах, загрязненных ИЛС и зарином определяли общую численность:
- почвенных грибов на среде Чапека;
- сапрофитных бактерий на почвенном агаре;
- колоний Escherichia coli на среде Эндо.
С целью исключения роста патогенных бактерий рН среды Чапека предварительно доводили до 4,0-4,5, добавляя концентрированную молочную кислоту в количестве 4 мл/л [4, 6-11].
Влияние представленных в эксперименте ОВ на сапрофитную микрофлору оценивали по из-
менению численности данного вида бактерий, выращиваемых на почвенном агаре.
В сосуды, содержащие модельную почву, загрязненную и незагрязненную веществами, вносили приготовленную суспензию культуры E. coli, плотность которой по стандарту мутности равна 10 ед. [3], в количестве 1 мл исходной взвеси на 1 кг почвы.
Внесение в чашки Петри с питательными средами тестируемых культур микрофлоры осуществляли капельным методом, почвенных грибов — поверхностным методом [3, 4].
Посев бактерий, почвенных грибов проводили при разведении модельной почвы в стерильной водопроводной воде в интервале от 1:10 до 1:10000 [4].
Руководствуясь требованиями методических рекомендаций, общую численность бактерий и почвенных грибов на 1 г абсолютно сухой почвы учитывали через 1, 3, 7, 10 и 14 суток после посева [3].
Микробиологические отборы проб и посевы из почвы проводили следующим образом: а) в день загрязнения почвы только из сосудов, не содержащих вещество (контроль); б) через 1-, 3-, 7- ,10- и 14-е сутки, с момента внесения вещества в смесь, из сосудов с загрязненной и незагрязнённой почвой.
В соответствии с общеустановленными требованиями подсчёт численности микроорганизмов проводили в чашках Петри, содержащих не менее 50 и не более 200 колоний, и констатировали количество клеток в 1 г абсолютной сухой почвы, рассчитанное по формуле [4]
n-a-100%
N =-
100 - c
где: N — количество клеток в 1 г абсолютной сухой почвы; n - общая численность колоний, выросших на поверхности чашки Петри; a — степень десятикратного разведения; c — влажность почвы, %.
За критериально-значимую величину принимали выход показателей в опыте за пределы 50% отклонений от таковых в контроле [3, 12].
Результаты и обсуждение. Оценку однократного токсического влияния ИЛС на почвенный микробоценоз проводили при её испытании в концентрациях 6, 3 и 1 мг/кг.
В процессе выполнения исследований установлено достоверное замедление роста колоний бактерий E. coli (50,9%) при внесении вещества в почву концентрации 6 мг/кг только через первые сутки (табл. 1).
Снижение уровня воздействия зарина (3 и 1 мг/кг) не вызывало статистически значимых из-
Таблица 1
Динамика численности микроорганизмов почвы, загрязнённой ипритно-люизитной смесью
Объект исследования Период наблюдения, сутки Контроль Содержание ИЛС в почве, мг/кг
6,0 3,0 1,0
M±m M±m Эффект воздействия, % M±m Эффект воздействия, % M±m Эффект воздействия, %
E. coli 0 191,80+14,36
1 694,70+62,98 341,40+13,98 50,90 + 463,50+13,67 33,30 + 688,20+50,87 0,90+
7 630,90+51,40 507,30+30,83 19,60+ 624,70+61,18 1,00 + 629,80+59,39 0,20+
10 450,50+32,62 376,90+31,67 16,30+ 444,50+31,10 1,30 + 447,00+41,29 0,80+
14 77,70+5,45 76,00+6,66 2,19 + 76,20+7,70 1,93 + 76,90+5,45 1,03 +
Грибы 0 144,30+12,87
1 261,70+21,26 248,45+14,85 5,06 + 257,80+21,39 1,50 + 258,20+19,22 1,34 +
3 371,90+34,71 456,71+35,67 22,81 + 424,00+41,62 14,01 + 377,30+31,58 1,45 +
7 305,80+31,86 321,07+29,11 5,00- 319,90+31,93 4,60 + 301,70+28,70 1,30+
10 248,20+21,82 254,23+19,42 2,43- 260,30+21,52 5,00 + 249,80+21,52 0,70+
14 76,70+6,34 80,11+7,01 4,45 + 77,60+6,35 1,20 + 76,80+6,34 0,20+
Сапрофитные бактерии 0 179,70+15,85
1 155,20+14,52 171,08+15,11 10,23+ 169,90+16,64 9,47 + 157,10+14,63 1,20+
3 596,70+60,02 653,41+56,34 9,50 + 649,40+60,41 8,80 + 602,90+60,61 1,00 +
7 362,50+30,56 384,29+29,43 6,01 + 376,80+36,43 4,00 + 364,00+26,39 0,40+
10 292,70+20,56 297,04+20,70 1,50 + 293,90+25,38 0,40 + 292,20+21,37 0,20+
14 139,80+10,40 147,02+10,47 5,16 + 138,90+12,30 0,70 + 139,20+13,60 0,50+
Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: н — направленность изменения показателей относительно контроля
менений численности колоний патогенной микрофлоры.
При учёте численности сапрофитных бактерий и почвенных грибов, подвергнутых воздействию ксенобиотика в указанных концентрациях, межгрупповых отличий не выявлено.
Основываясь на полученных данных, в качестве пороговой концентрации ИЛС по воздействию на микробоценоз почвы принята величина 6 мг/кг, подпороговой — 3 мг/кг.
С целью сопоставления степени токсического воздействия производных метилфторфосфоновой кислоты при проведении экспериментов по оценке негативного воздействия зарина на микробоце-ноз почвы вещество испытывали в концентрации 8 мг/кг, определённой в ранее выполненных исследованиях, в качестве пороговой по общесанитарному показателю вредности зомана [13].
Кроме того, в данной серии опытов изучали возможное влияние зарина на микрофлору почвы в концентрациях 2 и 0,2 мг/кг.
В процессе проведения исследований установлено токсическое воздействие зарина на рост всех тестируемых биообъектов (табл. 2). Так, при оценке численности клеток культуры E. coli в течение первых трёх суток после внесения вещест-
ва в почву во всех концентрациях зарегистрировано статистически значимое их увеличение (на 94,1-142,9%).
Аналогичный повышенный достоверный рост (на 82,3-781,1%) отмечен и у сапрофитных бактерий на первые сутки. Однако на третьи сутки количество клеток сапрофитной микрофлоры достоверно понизилось (на 72,2-78,8%).
При характеристике почвенных грибов установлено критериально значимое угнетение роста клеток на третьи сутки при воздействии вещества в концентрации 8 мг/кг.
Результаты проведённых исследований согласуются с общеизвестными сведениями о том, что минерализацию органического фосфора осуществляют преимущественно почвенные бактерии. Внесение органического вещества стимулирует рост этой физиологической группы микроорганизмов. При этом увеличение численности сапрофитных бактерий не ограничивает роста культуры Escherichia coli, что свидетельствует об отсутствии антагонизма между этими представителями [5, 9].
При проведении второй серии опытов вещество испытывали в концентрациях 0,025, 0,01 и 0,005 мг/кг (табл. 3).
Таблица 2
Воздействие зарина на общую численность почвенных микроорганизмов (колонообразующие единицы / 1 г почвы с учетом влажности)
Объект исследования Период наблюдения, сутки Контроль Содержание зарина в почве, мг/кг
8,0 2,0 0,2
M±m M±m эффект воздействия, % M±m эффект воздействия, % M±m эффект воздействия, %
E. coli 0 27,5±0,4
1 110±0,3 213,8+10,9 94,08- 253,9+15,9 130,9- 254,3+12,9 131,1-
3 101,4+8,3 202,3+9,21 99,51- 246,3+10,5 142,9- 218,6+12,2 115,7-
7 100,9+9,82 135,90+8,44 34,67- 126,37+11,47 25,23- 111,29+10,08 10,29-
10 95,89+6,47 121,41+13,53 26,61- 93,85+7,46 2,13- 84,38+7,45 12,00-
14 83,43+5,48 94,73+8,15 13,54- 81,49+6,32 2,33- 82,94+3,44 0,59-
Сапрофитные бактерии 0 847+110,6
1 357,7+17,2 3151,8+26,5 781,13- 3302,5+11,5 82,32- 1042,0+114,4 191,3-
3 9380,0+212,4 1986,6+93,6 78,82- 5060,2+90,7 46,1- 2606,7+124,9 72,2-
7 8324,91+485,6 7210,43+399,20 13,39- 6702,31+452,83 19,50- 4434,27+494,35 46,73-
10 7864,72+543,2 7053,91+647,20 10,31- 5499,71+501,91 30,07- 6290,01+602,29 20,02-
14 5025,24+441,2 3499,81+247,90 30,36- 4726,34+428,41 5,95- 4320,24+396,43 14,03-
Грибы 0 40,81+3,08
1 45,27+3,52 37,46+2,65 17,25- 39,51+2,95 12,72- 48,22+3,82 6,52-
3 29,95+2,98 13,86+0,95 53,72- 30,05+2,71 0,33- 26,14+1,69 12,72-
7 25,41+3,47 19,91+5,01 21,65- 21,63+8,52 14,88- 24,49+7,95 4,78-
10 15,38+6,83 12,43+3,43 19,18- 11,44+5,32 25,62- 9,83+1,29 36,08-
14 10,25+1,48 9,35+1,32 8,78- 8,33+2,04 18,73- 9,01+1,74 12,10-
Таблица 3
Изменение численности микроорганизмов почвы, загрязнённой зарином
Объект исследования Период наблюдения, сутки Контроль Содержание зарина в почве, мг/кг
0,025 0,01 0,005
M±m M±m эффект воздействия, % M±m эффект воздействия, % M±m эффект воздействия, %
E. coli 0 50,05+3,26
1 56,00+1,97 31,30+1,03 44,1- 34,90+2,87 37,7- 54,54+4,95 2,6-
3 19,92+1,21 3,25+0,23 83,7- 6,92+0,63 65,26- 19,60+1,88 1,6-
7 41,87+3,98 22,06+1,88 47,3- 26,30+1,96 37,17- 32,53+3,99 22,3-
10 36,71+2,57 23,60+2,85 35,7- 26,80+2,81 26,9- 31,46+3,02 14,3-
14 63,50+5,53 48,50+3,96 23,6- 56,20+4,83 11,5- 58,80+5,99 7,4-
Сапрофитные бактерии 0 15520,08+541,21
1 5716,7+547,65 3008,30+293,83 47,4- 3425,00+349,25 40,1- 5562,35+505,17 2,7-
3 10416,7+966,83 4087,51+307,52 60,8- 7141,7+803,17 31,4- 9281,28+888,28 10,9-
7 21900,00+2101,67 17812,50+1500,21 18,7- 19633,3+1807,3 10,4- 21440,1+1897,33 2,1-
10 8670,81+606,02 8550,00+781,31 1,4- 7570,80+783,08 12,7- 7500,25+901,25 13,5-
14 3500,30+389,45 3350,00+299,04 4,8- 3458,30+201,83 1,2- 3222,25+301,08 7,95-
С учётом того, что в предыдущих исследованиях установлены недействующие концентрации зарина на почвенные грибы, данный биообъект был исключён из дальнейших опытов.
В ходе проведения экспериментов выявлено, что воздействие вещества в большем уровне сопровождалось достоверным снижением на третьи сутки численности патогенной и сапрофитной микрофлоры. Кроме того, у E. coli на 1 и 7 сутки и у сапрофитных бактерий на 1 сутки зарегистрировано близкое к критериально значимым (44,1-47,4%) уменьшение количества клеток.
Поступление зарина в почву в концентрации 0,01 мг/кг приводило к существенному снижению на третьи сутки только численности клеток E. соН.
Ещё большее снижение уровня воздействия зарина до концентрации 0,005 мг/кг не изменяло численности почвенных бактерий, что характеризует данную концентрацию зарина как недействующую.
Следует отметить, что установленное в вышеприведённых исследованиях первичное возрастание и последующее уменьшение численности тестерных бактерий свидетельствует об окончании переработки микробами внесенного в почву соединения [9].
В результате проведённых исследований установлены следующие пороговые концентрации зарина по воздействию на различные группы мик-робоценоза почвы: для почвенных грибов — 8,0 мг/кг; для сапрофитных бактерий — 0,025 мг/кг; для бактерий Escherichia coli — 0,01 мг/кг.
Основываясь на представленных данных, можно заключить, что наиболее чувствительным видом исследуемой микрофлоры почвы при поступлении тестируемого ксенобиотика являются бактерии E. coli. С учётом этого в качестве порога токсического воздействия зарина на микробо-ценоз почвы принято значение 0,01 мг/кг. Уровень зарина — 0,005 мг/кг определён как подпо-роговый.
Выводы. 1. Поступление в почву ипритно-люизитной смеси и зарина сопровождается токсическим влиянием на микробоценоз данной экосистемы.
2. Наиболее чувствительным тест-объектом при воздействии оцениваемых ксенобиотиков оказались бактерии Escherichia coli.
3. Зарин в концентрации 0,005 мг/кг и иприт-но-люизитная смесь на уровне 3,0 мг/кг не оказывают отрицательного воздействия на микро-боценоз почвы.
Список литературы
1. Конвенция о запрещении химического оружия. Проблемы ратификации (Доклад экспертов службы внешней разведки РФ в мае 1996 года) // Химическое оружие и проблемы его уничтожения, 1996. — № 2. — С. 5-9.
2. Минеев В.Г., Ремпе Е.Х. Агрохимия, биология и экология почвы. — М.: Росагропромиздат, 1990. — 206 с.
3. Методические рекомендации по обоснованию ПДК химических веществ в почве. — изд. 2-е Гос. № 2609-82. — М, 1982. — 57с.
4. Методические указания по санитарно-мик-робиологическому исследованию почвы. МУ № 1446-76. — М, 1977. — 47с.
5. Гончарук Е.И., Сидоренко Г.И. Гигиеническое нормирование химических веществ в почве: Руководство. — М.: Медицина, 1986. — 132 с.
6. Практикум по почвоведению / Под ред. И.С.Кауричева. — М.: Колос, 1990. — 279 с.
7. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г.Звягинцева. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. — 224 с.
8. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии: Учеб. пособ. / Под ред. Н.П. Елино-ва. — М.: Медицина, 1988. — 208 с.
9. Мишустин Е.Н., Перцовская М.И., Горбов В.А. Санитарная микробиология почвы. — М.: Наука, 1979. — 304 с.
10. Методы санитарно-микробиологического исследования объектов окружающей среды / Под ред. Г.И.Сидоренко. — М.:Медицина, 1978. — 228с.
11. Разумовская З.Г., Чижик Г.Я., Громов Б.В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии. — Л.: Издательство Ленинградского университета, 1960. — 184 с.
12. Елисеева И.И., Юзбашев Н.Н. Общая теория статистики. — М.: Статистика, 1991. — С. 118-121.
13. Шкодич П.Е.; Максимова Е.Ю., Демидова С.А.и др. Экспериментальное обоснование предельно допустимой концентрации зомана в почве: отчет о НИР. — Волгоград: НИИГТП, 2003. — 45 с.
Материал поступил в редакцию 20.10.05.
S.A.Demidova, Ye.Yu.Maksimova, A.A.Maslennikov, Ye.V.Yudina
EXPERIMENTAL EVALUATION OF TOXIC EFFECT POSED BY TOXIC AGENTS PRODUCING DERMATOVESICAL AND NEUROPARALYTIC ACTION ON SOIL MICROBOCENOSIS
Research Institute of Hygiene, Toxicology, Occupational Pathology, Volgograd Experimental investigations allowed to establish sub-threshold levels of exposure of soil microbocenosis to mustard gas and lewisite mixture (3 mg/kg) and zarine (0.005 mg/kg).
УДК 615.216:595.324:547.854
В.В.Зобов*, А.В.Ланцова, В.С.Резник, В.Д.Акамсин, И.В.Галяметдинова
РОЛЬ ОСОБЕННОСТЕЙ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ТЕТРААЛКИЛАММОНИЕВЫХ ^ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ИЗБИРАТЕЛЬНОСТИ ИХ ВЛИЯНИЯ НА ЛОКОМОТОРНЫЕ МЫШЦЫ
Институт органической и физической химии им. А.ЕАрбузова Казанского научного центра
Российской академии наук, Казань
Показано, что сочетание высоких уровней миорелаксантной активности и широты эффективного действия характерно для соединений с плоским ^гетероароматическим циклом, содержащим метадиазиновый 2,4-диоксо-фрагмент и для веществ с существенным доминированием в спектре активности чрезвычайно высокой антихолин-эстеразной над более слабой Н-холиноблокирующей компонентой.
Ключевые слова: ингибиторы ацетилхолинэстеразы, тетраалкиламмониевые производные И-гетероциклов, миоре-лаксантная активность, широта эффективного действия.
Введение. Ранее нами было показано, что некоторые аммониопентильные производные 6-метилурацила являются высокоизбирательными и необратимыми ингибиторами ацетилхолинэстеразы (АХЭ; КФ 3.1.1.7) [1, 2], избирательно влияюшими на работу локомоторных мышц ^Е50 — 0,03 мкМ/кг) и проявляющими высокую «фармакологическую безопасность» (широта эффективного действия DL50/DE50 >
* Фрагмент диссертационной работы
50,0) в тестах с функциональной нагрузкой [3]. Соединения также демонстрируют до 8 порядков более высокие уровни «экологической безопасности» (^50>10,0 мкМ/л, дафнии), нежели фос-форилированные урацилы [4].
В развитие этих исследований мы синтезировали и изучили тетраалкиламмониевые производные других ^гетероциклов, содержащих ме-тадиазиновые 2,4-диоксофрагменты (рис.): хи-назолиндиона (соединения 1-7), ксантина (соединения 8-11), аллоксазина (соединения 12-
