CC BY
38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ГИПОГЛИКЕМИИЕСКИХ СОСТОЯНИЙ
ЦЕНТРАЛЬНОГО ГЕНЕЗА
И.И.БАБИЧЕНКО
Кафедра патологической анатомии, Российский университет дружбы народов Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая, д. 8. Медицинский факультет
Д. И.МЕДВЕДЕВ
НИИ общей и клинической патологии, Российский университет дружбы народов Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая, 8
Исследования на взрослых крысах линии Вистар показали, что введение в боковые желудочки мозга I ЕД инсулина в 10 мкл раствора вызывает снижение уровня Глюкозы в крови на 53% по сравнению с контрольными животными, которым вводили физиологический раствор. Данный гипогликемический эффект может быть связан либо с повышенным потреблением глюкозы и снижением ее синтеза гепатоцитами, либо с усиленной секрецией инсулина клетками поджелудочной железы. Иммуногистохимические исследования печени экспериментальных животных выявили морфологические признаки интернализацни инсулиновых рецепторов с поверхности гепатоцитов. Таким образом, гипогликемический эффект центрального генеза связан с повышенной секрецией эндогенного инсулина клетками поджелудочной железы.
В головном мозге хорошо известны центры, которые ответственны за регуляцию углеводного обмена. Эти структурные образования принимают участие в регуляции уровня инсулина и глюкагона в плазме крови, а также метаболизма глюкозы при голодании, ожирении, стрессе, сахарном диабете и других состояниях организма.
Центральным рецепторным звеном в ЦНС, регулирующим углеводный обмен, являются нейроны в вентромедиапьном (ВМГ) и вентролатеральном (ВЛГ) гипоталамических ядрах, в них описаны глюкозо-чувствительные нейроны [5]. Подобные нейроны функционально относятся к глюкорецепторам, однако морфологически их до настоящего времени определить не удалось.
В свою очередь в мозге выявлены рецепторы к инсулину в областях, лишенных гематоэнцефалического барьера. К таким образованиям относятся медиобазальный гипоталамус, срединное возвышение и area postrema [9].
Данные рецепторные образования влияют на интегративную деятельность ЦНС, что в конечном итоге модулирует периферическую инсулиновую секрецию. Введение глюкозы, или инсулина в спинномозговую жидкость или каротидную артерию изменяет деятельность инсулинчувствительных отделов мозга. Инсулин, введенный в желудочки мозга, существенно изменяет метаболизм углеводов в организме, что приводит к периферической гипогликемии [10].
Гипогликемические эффекты введенного в вентромедиальный гипоталамус инсулина можно блокировать с помощью ваготомии либо введением атропина. ВМГ является инсулинчувствительным глюкорегуляторным центром, который действует через холинергические волокна вагуса на печень [6].
Кроме этого, в ЦНС ■ описана особая биохимическая система, связанная с метаболизмом окиси азота, которая через посредство симпатической адреналовой системы также регулирует содержание глюкозы в крови. Введение стимуляторов данной системы в мозговые желудочки приводит к гипергликемическим эффектам на фоне неизменного уровня инсулина в сыворотке крови [1,8].
Таким образом, в ЦНС должны существовать определенные рецепторные образования, чувствительные к инсулину и глюкозе, которые активируют парасимпатическую или симпатическую нервную систему и приводят к последующей
гипо- либо гипергликемии. Однако остается не решенным вопрос - связана ли гипогликемий* наблюдаемая после введения инсулина в спиномозговую жидкость, с увеличением секреции эндогенного инсулина, либо с повышением метаболизма и утилизации глюкозы в печени [5].
Для решения данного вопроса в настоящей работе было проведено исследование морфофункциональных особенностей инсулиновых рецепторов печени в норме и после введения инсулина интраперитонеально и в желудочки мозга.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Внутрижелудочковое введение инсулина производили под нембуталовым наркозом на 10 взрослых самцах линии Вистар, массой тела 350-370 г. 5 опытным животным стереотаксически в правый боковой желудочек мозга вводили 1 ЕД инсулина (НишаНп Я и-100) в объеме 10 мкл; 5 контрольным животным в правый боковой желудочек мозга вводили 10 мкл физиологического раствора. Через 0,5 часа животных декапитировали и определяли содержание глюкозы в сыворотке крови калориметрическим методом.
Иммуногистохимическую локализацию инсулиновых рецепторов печени проводили на 12 крысах линии Вистар. В первой серии экспериментов 6 крысам внутрибрюшинно вводили инсулин в дозе 1 ЕД в 200 мкл, либо физиологический раствор. Во второй серии 6 крысам стереотаксически в правые боковые желудочки мозга вводили инсулин в дозе 1 ЕД в объеме 10 мкл либо 10 мкл физиологического раствора. В каждой серии экспериментов было по 3 контрольных животных, получавших внутрижелудочковые инъекции.
В иммуногистохимической серии исследований инсулиновых рецепторов основными реагентами были сыворотки, полученные при иммунизации кроликов синтетическими пептидами с последовательностью аминокислот, соответствующей определенным участкам а-субъединицы и Р-субъединицы в предшественнике инсулинового рецептора человека, реконструированного на основе нуклеотидной последовательности ДНК, комплементарной к м-РНК плаценты (2). Сыворотки были получены и любезно предоставлены для настоящих исследований проф. Н. Янаихара (Институт фармакологии, г Сизуока, Япония). В настоящем исследовании эти сыворотки использовали в разведении 1: 400. 6 качестве контроля служила неиммунная кроличья сыворотка.
Световая микроскопия проводилась на криостатных срезах печени. Анестезированных контрольных и экспериментальных животных перфузировали 4% раствором параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере. Небольшие кусочки ткани фиксировали в течение ночи, промывали в 10%, 15% и 20% забуференных растворах сахарозы и быстро замораживали при -80°С. Из кусочков готовили криостатные срезы толщиной 6 мкм, на которых проводили реакцию непрямым иммуногистохимическим методом |4].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В экспериментальной серии исследований через 0,5 часа после внутрижелудочковых инъекций в правый боковой желудочек мозга инсулина либо физиологического раствора у опытных и контрольных животных в сыворотке крови определяли содержание глюкозы. После подобного экспериментального воздействия содержание глюкозы в плазме крови подопытных животных составляло 0,767+0,043 г/л, в то время как у контрольных животных оно соответствовало значениям - 1,633 ±0,073 г/л.
Таким образом, внутрижелудочковое введение 1 ЕД инсулина через 0,5 часа приводит к снижению уровня глюкозы в плазме крови на 53%, что подтверждает
эффективность применяемого воздействия. Данный эффект может быть связан как с увеличением секреции эндогенного инсулина, так и со снижением синтеза глюкозы в печени. Для решения этого вопроса было проведено иммуногистохимическое исследование инсулиновых рецепторов печени после интраперитонеапьного и внутрижелудочкового введения инсулина.
Механизм действия инсулина на печень в первой экспериментальной серии связан с его взаимодействием с инсулиновыми рецепторами, результатом которого является их интернализация и гипогликемия. С помощью светооптического иммуногистохимического исследования было показано, что при обработке срезов антисыворотками кроликов, иммунизированных синтетическими пептидами с аминокислотной последовательностью, соответствующей определенным участкам инсулинового рецептора плаценты, в отличие от неиммунной сыворотки в печени всех групп экспериментальных животных, удалось выявить распределение нерастворимых продуктов диаминобензидиновой реакции (ДАБ), что свидетельствует об адекватности используемых сывороток для определения инсулиновых рецепторов. У контрольных животных распределение продуктов иммуногистохимической реакции наблюдалось вдоль цитоплазматических мембран гепатоцитов, прилегающих к синусоидным капиллярам.
Через 0,5 часа после интраперитонеальной инъекции I ЕД инсулина у экспериментальных животных обнаруживалось увеличение иммунопероксидазной реакции. На светооптическом уровне это характеризовалось появлением в цитоплазме гепатоцитов крупных гранулярных скоплений, которые скорее всего характеризуют процесс интернализации инсулиновых рецепторов печени в цитоплазму гепатоцитов. Подобный процесс наблюдается после взаимодействия рецепторов с инсулином, в нашем случае введенном экзогенно.
Решение вопроса о механизме гипогликемии после введения инсулина в желудочки мозга проводилось во второй экспериментальной серии. Иммуногистохимические исследования с помощью антител к различным участкам молекулы инсулинового рецептора плаценты человека в экспериментах с интравентрикулярным введением 1 ЕД инсулина позволии установить сходные закономерности в распределении продуктов ДАБ реакции по сравнению с первой экспериментальной серией. На светооптическом уровне введение инсулина в желудочки мозга также вызывало увеличение интенсивности иммуногистохимической реакции на мембранах и в цитоплазме гепатоцитов по сравнению с контролем, что указывает на наличие процессов интернализации инсулиновых рецепторов.
Таким образом, гипогликемическое состояние, связанное с введением инсулина в желудочки мозга вызвано не центральными влияниями на метаболизм глюкозы в печени, как предполагалось ранее (3,7), а усилением секреции эндогенного инсулина поджелудочной железой. Данный феномен может быть использован в дальнейшем для изучения центральных рецепторных и эфферентных механизмов, участвующих в процессах регуляции секреции инсулина поджелудочной железой, а также для разработки методов стимулирования секреции инсулина поджелудочной железой при сахарном диабете.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ähren В. Involvement of nitric oxide in neuroglycopenia-induced insulin and glucagon secretion in the mouse // Eur. J. Pharmacol. 1995. 280. №1. P.27-35.
2. Ebina Y„ Ellis L., Jomagin K. et all. The human insulin receptor cDNA: the structural basis for hormone-activated transinembrain signaling //Cell. 1985. 40 . №4. P.747-758.
3. Iguchi Д.. Burleson P.D., SzaboA.J. Decrease in plasma glucose concentration after microinjection of insulin into VMH//Am. .1. Physiol. 1981. 240 №2 P. E95-EI00.
4. Nakane P.K.. Recent progress in the peroxidas- labeled antibody method // Ann. New York Acad. Sci. 1975.254. P.203-211.
5. Storlein L.H. Localization of CNS glucoregulatory insulin receptors within the ventromedial hypothalamus//Brain Research. 1975''96. №1. P.156-160.
6. Szabo A.J., Iguchi A. et al. Vagotomy or atropine blocks hypoglycemic effect of insulin injected into ventromedial hypothalamic nucleus // Am. J. Physiol. 1983. 244. №5. P. E467-E471.
7. Szabo A.J., Szabo O. Influence of the insulin sensitive central nervous system glucoregulator receptor on hepatic glucose metabolism Hi. Physiol (Lond.)1975. 253. № i. P.121-133.
8.‘ Uermira K„ Tamagawa T.‘ t:t- al. NG-methyl-L-arginine, an inhibitor of nitric oxide synthase, affects
the central nervous system to produce peripheral hyperglycemia in conscious rats // Neuroendocrinology. 1997. 66. №2. P. 136-144. .
9. Van Houten M.. Posner B.l. Cellular basis of direct insulin action in the central nervous system // Diabetologia. 1981. 20. Suppl. P .255-267.
10. Woods S.C., Porte D.Jr. Effect of intracistemal insulin on plasma glucose and insulin in the dog // Diabetes. 1975. 24. №10. P.905-909.
THE CENTRAL ORIGIN OF THE HYPOGLYCEMIA MODEL
I.I.BAHICHENKO
Department of Pathological Anatomy. Medical Faculty, Russian Peoples' Friendship University iMoscow, 117198, Miklukho-Maklaya st, 8. Medical faculty
1)1 MI DVI DI V
Scientific Research Institute of General and Clinical Pathology, Russian Peoples' Friendship University Moscow, 117198. Mikliikho-Maklaya St., 8
The researches on adult Wistar rats have shown that the injection of the 1U insulin in І Оці of a solution causes reduction of a blood glucose level on 53% in comparison with control animals, entered a physiological solution. Given effect can be connected either with increased glucose consumption by hepatocytes or with amplified insulin secretion by pancreas.
Immunohistochemical investigations of livers of ail experimental animal have revealed the morphological attributes of insulin receptors internalization from the hepatocytes surface. Being based this data, is judged that the hypoglycemia has central origin and is connected with increased secretion of endogenous insulin by pancreas.
