CC BY
70
Egorova Darya Vasilievna, postgraduate student, laboratory of microbiology, IGEB SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str., 6, tel. 8 (3012) 43-49-02, fax: 8 (3012) 43-30-34, e-mail: daria ego@mail.ru
Kozyreva Ludmila Pavlovna, candidate of biology, senior researcher, laboratory of microbiology, Instituter of General and Experimental Biology, SB RAS, 670047, Ulan-Ude,. Sakhyanova str., 6, tel. 8 (3012) 43-45-75, fax: 8 (3012) 43-30-34, e-mail: l-kozyr@mail.ru
УДК 579.841.41
С.В.Зайцева
ЭКОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ*
*Работа поддержана грантами РФФИ-Монголия 10-04-93169, РНП 2.1.1/2165.
Для коллекционных культур аэробных термофильных микроорганизмов, выделенных из гидротерм Байкальского региона, были рассчитаны температурные параметры роста. Экспериментально температурный диапазон развития бактерий составлял 30-75°С с оптимумом от 45 до 610С.
Ключевые слова: термофильные бактерии, математические модели роста микроорганизмов, температурный оптимум.
S.V. Zaitseva ECOPHYSIOLOGICAL FEATURES OF COLLECTIVE CULTURES OF THERMOPHILE BACTIRIA
The temperature parameters of growth for the collective cultures of aerobic thermoplilic microorganisms, separated from hot springs of Baikal region, were calculated. Experimentally the temperature range of development of bacteria was 30-75° С with an optimum from 45 to 61°С. The aim of the work was to research the ability of collective thermophilic aerobic organotrophic cultures to grow at temperatures, near to maximum and minimum possible.
Keywords: thermophilic bacteriua, mathematical patterns of growth of microorganisms, temperature optimum.
Аэробные термофильные алкалотолерантные и алкалофильные бактерии, выделенные из щелочных гидротерм, описаны как представители рода Bacillus (B. pallidus, B. thermocloaceae, B. thermoaerophilus), рода Meiothermus (M. chliaro-philus, M. rosaceus, M. silvanus), Geobacillus cal-dotenax, рода Thermus (T. antranikianus, T. ig-niterrae, T. oshimai, T. thermophilus), Sphaerobac-ter thermophilus, Thermoaerobacter subterraneus, Thermomicrobium roseum, Isosphaera pallida, Rubrobacter xylanophilus [2, 3, 7, 8]. Оптимальная температура роста для термофилов составляет 50-750С, а для экстремально-термофильных и гипертермофильных бактерий и архей оптимальная температура роста находится в диапазоне 75-1050С, максимальная температура достигает значений 1000С и выше [8]. Хотя большинство микроорганизмов развивается в сравнительно небольшом температурном диапазоне, разница между минимальной и максимальной
температурами составляет 20-35 С, описаны бактерии с разницей предельных температур более 350С. Значительный интерес к экстремо-филам обусловлен их способностью развиваться в пограничных условиях существования жизни и высоким биотехнологическим потенциалом ферментных систем, устойчивых к действию высоких температур и рН.
Материалы и методы исследования
В работе были использованы коллекционные культуры термофильных аэробных органотроф-ных микроорганизмов, выделенных из проб горячих источников Бурятии и Монголии.
Культивирование проводили на жидкой модифицированной среде Пфеннига при температурах 30, 35, 40, 45, 50, 60 и 70 0С. Рост культур оценивали по изменению оптической плотности при 600 нм. Удельную скорость роста бактериальных культур рассчитывали по формуле:
где X и X0 - значения оптической плотности культуры в моменты времени t и t0.
Для оценки оптимальных и максимально/минимально возможных температур роста культур термофильных органотрофных бактерий экспериментальные данные аппроксимировали в соответствии с моделью Россо [6], кото-
рая связывает оптимальную удельную скорость роста Цор1 при температуре ТорЬ а также минимальную, оптимальную и максимальную температуры (Ттт, ТорЬ Ттах) с максимальной удельной скоростью роста цтах при температуре Т:
Т = -
0, Т<Ттт
Цтах(Т) = MoptX(T), Tmm<T<Tm
0, T>Tmax (T - T )(T - T ■ )2
V ma^ ^ min /
где
(Topt - Tmin )[(Topt - Tmin )(T - Topt ) - (Topt - Tmax )(Topt + Tmin - 2T)]
opt
opt
opt
max / V opt
Для вычисления Tmin, Topt и Tm
использовал-
ся метод наименьших квадратов, при этом минимизировали сумму квадратов отклонений
0тт. Для оценки точности аппроксимации вычисляли стандартное квадратичное отклонение о, выраженное в процентах:
а
S =
n - p
100%
ßopt
где n - количество экспериментальных точек, p - количество параметров.
Результаты и обсуждение
Исследованные культуры микроорганизмов изолированы из гидротерм с различным температурным режимом и различной - слабощелочной до сильно-щелочной - реакцией среды. Морфологически клетки бактерий представляли собой разные спорообразующие граммпо-ложительные палочки, размеры которых варьировали в пределах от 0,9-2,3 до 1,9-8,4 мкм. На питательном агаре бактерии образовывали колонии кремового цвета. Наиболее активный рост культур был отмечен при рН 8,0-8,5; диапазон pH составлял от 6,0 до 9,5, что позволило отнести их к группе алкалотолерантных организмов. По культуральным признакам, морфофизиологическим и биохимическим свойствам все исследованные культуры были близки к представителям родов Bacillus и Anoxybacillus [3, 11]. Анализ гена 16S рРНК штаммов Al-9-1, Se-1, Ga-1-1 и Ga-9-2 показал, что они являются представителями рода Anoxybacillus. Ближайшими гомологами штаммов Al-9-1, Se-1, Ga-1-1 является Anoxybacillus pushchinoensis AT-2 (AB234214), штамма Ga-9-2 - A. flavithermus DSM 2641 (Z26932), однако сходство между ними не превышает 95-96%.
Анализ гена 16S рРНК штаммов Ur-6, Br-2-2 и А2 показал, что они относятся к представителям рода Bacillus. Наибольшее сходство у культуры Ur-6 выявлено с Bacillus hemicellulosolyti-
cum C-11 (99%). Штаммы Br-2-2 и А2 на 97 и 99% соответственно близки к B. licheniformis BBDC6. Все исследованные термофильные культуры из щелочных гидротерм Бурятии (Гар-га, Гусиха, Алла, Уро, Сея, Большая Речка) развивались при температурах от 30 до 70 0С. Для культур Ga-1-1 и Gu-1 оптимальная температура роста составляла 45 и 49 0С, соответственно максимальной температурой роста для этих культур была температура 67 0С. Для культур Ga-6 и Gu-2 оптимум температуры составил 60 0С, для Ga-9-2 - оптимальная температура роста
57 0С, диапазон развития 37-75 0С.
Для штаммов, выделенных из Аллинских источников, диапазон роста определен в пределах 35-67 0С. Оптимальная температура роста для культур A2, А3, А4, А5 и Al-9-1 равна 49-500, а для культуры А1 оптимум температуры составил 450С.
Все культуры, выделенные из Уринского и Большереченского источников, являются умеренными термофилами с диапазоном развития 35-70 0С и оптимумом развития при 45-50 0С. Несмотря на наличие общих черт, температурные характеристики Сеюйских штаммов имеют ряд отличий. Культуры Se-3, Se-4 и Se-6-2 имеют оптимум роста 50-52 0С, Se-5 имеет оптимум роста при 45 0С, Se-1 - при 49 0С.
Диапазон роста всех штаммов из низкоминерализованных щелочных гидротерм Монголии
(Хужирт, Шиверт и Цэнхэр) варьировал от 37 до 750С. Ниже 370С и выше 750С рост культур не наблюдался. Оптимум развития штаммов был от
58 до 610С.
Экспериментально температурный диапазон развития бактерий был от 30-35 до 70-75 0С, с оптимумом от 45 до 610С. Термофильные бациллы, составляющие "группу 5" по классификации Эша с соавторами [1], характеризуются более высокими температурными характеристиками: минимум - 35-48 0С, максимум - 65-78 0С, оптимум - 55-65 0С.
Визуальный анализ кривых роста свидетельствует, что культуры различаются по температурам роста и могут быть разделены на несколько групп. В первую группу можно отнести штаммы, выделенные из Сеюйского, Аллинско-го, Уринского и Большереченского источников, которые характеризуются сходными значениями минимальных и максимальных температур, отсутствием выраженных пиков роста и наличием плато в области температур 40-600С. Иначе ведут себя культуры Оа-1-1, Оа-9-2 и Ои-2, у которых наблюдался пик роста, соответствующий оптимальным температурам 45 0С (для Оа-1-1) и 60 0С (для Оа-9-2 и Ои-2). В эту же группу входят культуры, выделенные из гидротерм Монголии: Т4, 84 и Н5, на их кривых роста также отмечается выраженный оптимум при 60 0С. Нас интересовало, как ведут себя культуры при более высоких температурах: 70 0С и выше.
Для оценки влияния температуры на рост бактерий сравнивали средние удельные скорости роста культур (тср), рассчитанные на отрезках экспоненциальных фаз роста культур при всех исследованных температурах. Однако, учитывая, что подобный подход не гарантирует из-
бежания субъективных ошибок, а значения не могут быть использованы в расчетах оптимальных удельных скоростей роста (^р), мы попытались апробировать полученные экспериментальные данные на существующих математических моделях зависимости роста микроорганизмов от температуры. Модели микробного роста обычно описывают изменения максимальной удельной скорости роста, которая отображает метаболическую активность конкретного микроорганизма в данных условиях среды. Существует несколько моделей для описания эффекта температуры на максимальную удельную скорость роста (цтах) [5, 6, 9].
Модель Ратковского [5], записанная в виде ¥(х) = /(х)е8(> , служит основой для большинства моделей, описывающих зависимости удельных скоростей роста бактерий от температуры и рН. При этом возможны корреляции между параметрами и возрастает вероятность ошибки. Кроме того, некоторые параметры не имеют ясного биологического значения, что затрудняет их вычисление.
Модель Вицеса [9] описывает рост микроорганизмов при температурах, близких к оптимальным, и во всем диапазоне значений рН, при которых наблюдается рост:
Цтх = М(РН - рНтШ)[1 - е^ - РНтаХ)](Т -Ттт)}2, где рНтах и рНщт - значения рН, при которых рост микроорганизмов уже не наблюдался, Т (0С) - исследуемое значение температуры, Ттт - нижняя граница роста организма, ^(час-1 0С-2) и с1 - коэффициенты регрессии.
Звитеринг с соавторами [10] предложил другую модель для всего диапазона значений температуры и рН, при которых наблюдается рост:
Дтах тр у (рИ)у (Т),
у рН) _ [(pH - pH тіп)[1- еС2( рН - рН тах)] I2 Г (Т - Т тіп)[1 - еС3(Т-Т тах)]
у(рН ) ^ _ сгірнорі-рнтах)] | у(Т ) _ ^
(рНорі - pH тіп)[1-еС2(рНор*-рНтах)]/V / | (Тор - Т тіп)[1 - ес 3(Торг-Т тах)]
В данной модели используется девять параметров: рНор1 и ТорЬ при которых значение цтах наибольшее; рНтт, рНтах, Ттт, Ттах - предельные значения рН и температуры для роста микроорганизма; цор1 -Цт^ при оптимальных значениях температуры и рН; С2 и С3 - коэффициенты регрессии.
В нашем случае наиболее удобной оказалась модель Россо, так как ее параметры не имеют значительных структурных корреляций, а зна-
чения Ттіп, Тор1 и Ттах можно оценить исходя из реально возможных свойств микроорганизмов. Модель Россо описывает характерный ход кривой ц(Т) с оптимумом, сдвинутым в сторону максимальной температуры, при которой рост еще возможен. По результатам экстраполяции исследованные термофильные микроорганизмы можно разделить на две группы - с оптимумом температур в пределах 50-53 и 62 0С (табл. 1).
В группе 1 можно дополнительно выделить культуру Оа-1-1, которая отличается более низкими температурными характеристиками роста.
В целом построенная аппроксимация хорошо описывает экспериментальные данные. По результатам расчетов максимальные температуры роста культур на 5-100С превышали данные экс-
Все полученные аппроксимации симметричны относительно оптимальной температуры, в то время как модель Россо предсказывает асимметричную кривую с более крутым спадом в районе максимальных температур. Подобные симметричные кривые были получены ранее при расчете температурных характеристик для аэробных культур алкалотермофильных бактерий из гидротерм Бурятии [12]. По-видимому, такое поведение является характерным для термофильных органотрофных бактерий, способных развиваться в достаточно широком температурном диапазоне. Анализ зависимости максимальных удельных скоростей роста от температуры у культур, выделенных из источников Сеюйский, Уринский, Большереченский и Ал-линский, показывает наличие плато в области температур 40-60 0С, что является характерной чертой видов, толерантных по отношению к температуре.
Литература
1. Ash C., Farrow J.A.E., Wallbanks S., Collins M.D. Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small-subunit-ribosomal RNA sequences// Lett. Appl. Microbiol.-1991. -V.13. - P.202-206.
2. Chen Ch. Meiothermus rosaceus sp. nov. isolated from Tengchong hot spring in Yunnan, China // FEMS Microb. Lett. - 2002. - V.216. - P. 263-268.
3. Namsarasev Z.B., Babasanova O.B., Dunaevsky Y.E., Akimov V.N., Barkhutova D.D., Gorlenko V.M., Namsaraev
перимента. Косвенно подтверждают эти расчеты данные по температурным оптимумам протеаз-ных ферментов, выделенных из исследуемых культур. По данным Бабасановой [11], выделенные ферменты сохраняли до 45% активности при температурах до 75 0С, с оптимумом около 65 0С.
Таблица 1
B.B. Anoxibacillus mongoliensis sp. nov., a novel thermophilic proteinase producing bacterium isolated from alkaline hot spring, Central Mongolia // Microbiology. - 2010. - V. 79, № 4. - Р. 516-523.
4. Nobre M.F., Trueper H.G., Da Costa M.S. Transfer of Thermus ruber, Thermus silvanus and Themus chiarophilus to Meiothermus gen. nov. as Meiothermus ruber comb. nov., Mei-othermus silvanus comb. nov. and Meiothermus chiarophilus comb. nov., respecttively //Int. J. Syst. Bacteriol. - 1996. - V. 46. - P. 604-606.
5. Ratkowsky D.A., Lowry R.K., Meekin T.A., Stokes A.N., Chandler R.E. Model for bacterial culture growth rate throughout the entire biokinetic temperature rang. // J. Bacteriol. - 1983. - V.154. - P. 1222-1226.
6. Rosso L., Lobry J.K., Bajard S., Flandrois J.P. Convenient model to describe the combined effects of temperature and pH on microbial growth // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. -V.61. - P.610-616.
7. Ward D.M., Ferris M.J., Nold S.C., Bateson M.M. A natural view of microbial biodiversity within hot spring cyano-bacterial mat communities // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. -V. 62. - P.1353-1370.
8. Wiegel J. Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles //Extremophiles. 1998. - V.2. - P. 257-267.
9. Wijetzes T., McClure P.J., Zwietering M.H., Roberts T.A. Modelling bacterial growth of Listeria monocytogenes as a function of water activity, pH and temperature // Int. J. Microbiol. - 1993. - V.18. - P. 139-149.
10. ZwieteringM.H., De Koos J.T., HasenackB.E., De Witt J. C., VAN, T Riet K. Modelling of bacterial growth as function of temperature // Appl. Environ. Microbiol. - 1991. - V. 57. -P. 1094-1101.
11. Бабасанова О.Б., Бархутова Д.Д. Внеклеточная протеазная активность термофильных бактерий из щелочных термальных источников Бурятии и Монголии // Сборник научных трудов. Серия: Химия и биологически
Рассчитанные температурные параметры роста коллекционных культур микроорганизмов
Культуры о <N СЛ О 43 О Gu-1 Gu-2 < A2 A3 A4 A5 Al-9-1 Ur-4 Ur-5 43 i- £ Br-2-1 Br-2-2 Se-1 Se-3 Se-4 Se-5 Se-6-1 2- -e S T4 S4 H5
Т 1 mi n 2 5 3 4 3 4 3 1 3 5 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 2 3 5 3 5 3 5
Т о t 5 0 6 2 6 2 5 2 6 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 3 5 3 5 3 6 0 6 0 6 0
Т ma x 7 0 8 5 8 5 7 4 8 5 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 7 4 8 5 8 5 8 5
о, % 1 4, 0 1 7, 5 1 5, 4 1 6, 2 1 2, 8 1 8, 0 2 4, 4 2 4, 3 1 8, 3 1 8, 3 2 2, 1 2 1, 5 1 9, 5 1 9, 8 1 9, 4 1 9, 0 2 3, 9 2 0, 5 1 9, 7 1 7, 8 1 9, 5 1 9, 5 1 7, 5 1 6, 4 2 0, 0
активные вещества.- Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. - фильных бактерий гидротерм Бурятии // Микробиология. Вып. 10 . - С. 83-90. - 2004. - V. 73, № 4. - С. 443-448.
12. Зайцева С.В., Козырева Л.П., Намсараев Б.Б. Влияние температуры и рН на рост аэробных алкалотермо-
Зайцева Светлана Викторовна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. 670047 г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, тел. 434902, e-mail: svet zait@mail.ru
Zaitseva Svetlana Victorovna, candidate of biology, researcher, laboratory of microbiology, Institute of General and Experimental Biology, SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str., 6, tel. 434902
Рис. 1. Зависимость средних удельных скоростей роста культур от температуры
Рис.2. Аппроксимированные кривые зависимости максимальных удельных скоростей роста от температуры
