CC BY
101
Химия растительного сырья. 2002. № 1. C. 57-62.
УДК 547.913:543.544.45
ЭКДИСТЕРОИДЫ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК SERRTULA CORONATA И AJUGA REPTANS
© В.Н. Филиппова3*, С.О. Володинаа, И.Н. Смоленская5, С.Э. Зоринянцб, В.В. Володина
а Институт биологии Коми Научного центра УрО РАН, ул. Коммунистическая, 28, Сыктывкар, 167610 (Россия) e-mail: [email protected]
б Институт физиологии растений РАН, ул. Ботаническая, 35, Москва (Россия)
Получены высокопродуктивные суспензионные культуры S. coronata и A. reptans - продуценты экдистероидов. Исследована динамика роста по числу клеток, сырой и сухой биомассе. Определена продолжительность основных фаз ростового цикла. Выявлены изменения ростовых характеристик каллусов при длительном культивировании. Количественное определение содержания 20-гидроксиэкдизона проводили на стадии замедления роста. Суспензионные культуры характеризуются большей продуктивностью по сравнению с исходными каллусными культурами за счет интенсификации роста и сокращения цикла выращивания.
Введение
Фитоэкдистероиды - большая группа полигидроксилированных стероидных соединений, идентичных или структурно близких гормонам линьки и метаморфоза насекомых [1]. Однако до настоящего времени физиологическая роль этих соединений в растениях не выяснена. Согласно одной из наиболее обоснованных гипотез фитоэкдистероиды являются аллелохимическими токсинами и антифидантами для неадаптированных видов насекомых-фитофагов [2]. На млекопитающих и человека эти соединения оказывают анаболическое и ранозаживляющее действие [3]. Многие экдистероидсодержащие растения используются в медицинских целях. В частности, серпуха венценосная (Serratula coronata L., Asteraceae) - лекарственное растение, используемое в народной медицине Сибири [4], настои живучки ползучей (Ajuga reptans L., Lamiaceae) издавна применяются в народной медицине как противовоспалительное, ранозаживляющее, антисептическое и гемостатическое средство [5]. S. coronata содержит 20-гидроксиэкдизон (20Е), инокостерон, экдизон макистероны А и С [6, 7]. Основным экдистероидом в интактных растениях серпухи венценосной является 20Е. В имматурной фазе развития его содержание в среднем составляет 1% [8]. Из растений A. reptans L., произрастающих в средней тайге Республики Коми, были выделены следующие фитоэкдистероиды: 20-гидроксиэкдизон (20Е), 5,20-дигидроксиэкдизон, 29-норциастерон, 29-норсенгостерон, сенгостерон, аюгалактон и аюгастерон Б [9]. Доминирующими соединениями являются 29-норциастерон, 29-норсенгостерон и 20Е. Максимальное содержание экдистероидов зафиксировано в листьях розеток еще не укоренившихся молодых плагиотропных побегов. В зависимости от фазы развития и органа растения общее содержание экдистероидов варьировало от 0,07 до 0,4% [10]. Поскольку экдистероиды живучки ползучей отличаются большим разнообразием химических структур, это растение представляет интерес как уникальный модельный объект для изучения особенностей биосинтеза и биогенетических связей в ряду экдистероидов. В связи с этим интересным объектом исследования являются культуры
Автор, с которым следует вести переписку.
растительных клеток, которые, с одной стороны, могут служить модельными системами для изучения метаболических процессов вне организменного контроля, а с другой стороны, могут составить альтернативу природному источнику получения практически ценных соединений. Настоящая работа посвящена сравнительному изучению ростовых и биосинтетических характеристик длительно культивируемых каллусных и суспензионных культур S. coronata и A. reptans.
Экспериментальная часть
Каллусные культуры S. coronata и A. reptans были получены в 1993 г. в Институте биологии Коми НЦ УрО РАН [11]. Культуры S. coronata выращивались на модифицированной среде Мурасиге и Скуга с добавлением сахарозы - 30 г/л, инозитола - 100 мг/л, и витаминов по Стаба, мг/л: фолиевой кислоты -
0,5; рибофлавина (В2) - 0,5; биотина - 1; Са-пантотената - 1; пиридоксина (В6) - 1; тиамина хлорида (В1) - 1; никотинамида (РР) - 2; кобаламина (В12) - 0,0015. Ростовая среда каллусной культуры A. reptans имела аналогичный состав, с добавлением НУК - 1 мг/л и поливинилпиролидона - 2 г/л. Агар -8 г/л. рН до автоклавирования 5,8.
Суспензионные культуры клеток этих видов растений были получены нами в 1998 г. из каллусных культур гипокотильного происхождения для S. coronata и корневого происхождения для A. reptans. Суспензионные культуры выращивали на средах аналогичного состава с исключением агара. Культивирование проводили в темноте при температуре 25°С и влажности 65-70%, в колбах объемом 500 мл на качалке (100 об/мин, радиус вращения 6-8 мм). Объем суспензии в колбе - 80 мл.
В течение цикла выращивания определяли следующие параметры: сырую и сухую массу, плотность, жизнеспособность клеток, содержание 20-гидроксиэкдизона в конце цикла выращивания. Для определения сырой и сухой массы клетки отделяли от питательной среды и взвешивали до и после высушивания при температуре 60°С до постоянной массы. Индекс роста рассчитывали по формуле: I=mo/(mmax-mo), где mo и mmax - масса каллусов в начале и в конце цикла выращивания. Число клеток определяли ежедневно, в течение всего пассажа, в камере Фукса-Розенталя. Для этого суспензионную культуру клеток предварительно мацерировали 10%-ным раствором хромовой кислоты при 60оС в течение 15 мин. Жизнеспособность клеток определяли после окрашивания 0,1%-ным раствором эозина. Живыми считали клетки, цитоплазма которых не прокрашивалась в течение 2 мин.
Анализ 20-гидроксиэкдизона проводили в средних пробах образцов воздушно-сухой биомассы, полученных на 20-й день при поверхностном культивировании, и на 14-й день при глубинном культивировании для клеточных культур S. coronata, а также на 11-й день при обоих типах культивирования для A. reptans. Экстрагированные и очищенные образцы анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) [12].
Подготовка проб к ВЭЖХ-анализу. Экдистероиды определяли в экстрактах из разных органов интактных растений, биомассе каллусных и суспензионных культур, а также в питательной среде. Растительные образцы и биомассу клеточных культур (для суспензий предварительно отфильтрованную) сушили при 60°С в течение 24 ч, 50-80 мг высушенной измельченной пробы экстрагировали метанолом в течение 16-18 ч. После центрифугирования аликвоту 1 мл разбавляли дистилированной водой (1 : 4) и пропускали через концентрирующий патрон Диапак С16 («БиоХимМак», Россия). Аликвоты питательной среды также пропускали через концентрирующий патрон Диапак С16 («БиоХимМак», Россия). Сорбированные на С16-матриксе экдистероиды элюировали 3 мл 60%-ного метанола и анализировали ВЭЖХ.
Оборудование и условия хроматографии. Анализ экдистероидов в интактных растениях и клеточных культурах проводили методом ВЭЖХ на хроматографической системе Varian, Pro Star (США). Колонка Diasorb CJ6 /Т (150х4мм) («БиоХимМак», Россия), размер частиц 7 мкм; состав элюента: ацетонитрил-вода (100:20, по объему); скорость элюции - 1.5 мл/мин. Детектирование проводили при X = 242 нм (система 1).
Анализ молодых каллусных культур был проведен в 1994 г. ВЭЖХ-анализ выполняли в изократическом режиме на приборе фирмы «KOVO» (Чехия). Колонка Diasorb CJ6 /Т (150х4мм), размеры частиц 5 мкм. Состав элюента: вода - ацетонитрил - тетрагидрофуран (100 : 16 : 4, по объему). Скорость элюции - 0,7 мл/мин. Детктирование проводили при X = 254 нм (система 2) [11].
В качестве стандартов веществ для идентификации пиков на хроматограммах исследуемых экстрактов использовали эталонные образцы экдистероидов, полученные в лаборатории биохимии и биотехнологи растений (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН). Количество экдистероидов рассчитывали методом абсолютной калибровки.
Достоверность различия средних арифметических трех серий экспериментов определяли по критерию Фишера-Стьюдента, рассчитывая нормированное отклонение (t) и сравнивая его с табличной величиной при заданном уровне значимости (Р).
Обсуждение результатов
Культуры клеток Serratula coronata
На первом этапе работы нами был охарактеризован рост каллусных культур, которые находились в условиях in vitro в течение четырех лет. Культуры тканей характеризовались активным ростом. Определение весовых характеристик тканей, проводимое на протяжении 6 лет, показало, что индекс роста сухой биомассы увеличился почти в 1,7 раза (8,3±0,7 - 1994-1995 гг, 13,8±0,3 - 1998-2000 гг.), а сырой биомассы - в три раза (7,7±0,7 - 1994-1995 гг., 21,5±0,6 - 1998-2000 гг.). непропорциональное увеличение индексов роста по сырой и сухой биомассе говорит о том, что с увеличением продолжительности культивирования произошло значительное обводнение ткани.
Ростовые кривые каллусной культуры имеют стандартную S-образную форму (рис. 1).
Прироста сухой биомассы в первые двое суток не наблюдалось (лаг-фаза), затем, на третьи сутки, клетки вступали в фазу экспоненциального роста, а на 20-е сутки - в стационарную фазу. Из графика, на котором показан прирост сухой биомассы, видно, что экспоненциальная фаза начиналась на третьи сутки и продолжалась в течение 17-ти дней, увеличение сырой биомассы продолжалось до 22-х суток культивирования. В стационарную фазу клетки вступали на 23-е сутки, т.е. после прекращения увеличения сухой массы клетки продолжали поглощать воду из среды еще в течение трех дней.
Основным критерием при выборе исходного материала для получения суспензионных культур была наибольшая способность каллусных культур к синтезу 20Е. Получение суспензионной культуры из рыхлого и обводненного каллуса произошло достаточно легко. Динамика роста суспензионной культуры по числу клеток показана на рисунке 2. После лаг-периода, который длится трое суток, клетки вступают в фазу экспоненциального роста, продолжающуюся семь суток. Затем наступает стационарная фаза, и на 16-е сутки начинается фаза деградации клеток. За период субкультивирования число клеток увеличивается почти в восемь раз. Индекс роста по сырой и сухой биомассе составил 8,9±0,1 и 11,9±0,5 соответственно. Подсчет числа живых и мертвых клеток суспензионной культуры S. coronata показал, что в цикле культивирования этот параметр варьирует от 61 до 86%. Наибольшая жизнеспособность клеток приходится на экспоненциальную фазу роста.
Количественное определение 20Е проводили на стадии замедления роста для обеих культур. Содержание 20Е практически не отличается при поверхностном и глубинном типе культивирования. В обоих случаях оно составило около 0,5%. Таким образом, смена типа культивирования не сказывается на уровне биосинтеза 20Е в данных клеточных культурах. Однако за счет сокращения цикла выращивания и увеличения удельной скорости роста полученные суспензионные культуры характеризуются большим выходом 20Е по сравнению с каллусными. По накоплению сырой биомассы при переходе к глубинному типу культивирования удельная скорость роста увеличилась в два раза: 0,22 сут.-1 и 0,43 сут.-1, а по сухой биомассе в 1,5 раза: 0,20 сут.-1 и 0,35 сут.-1 соответственно. В полученных нами штаммах содержание 20Е выше по сравнению с данными других авторов.
- аппроксимирующая кривая
Рис. 1. Динамика роста сырой и сухой биомассы в каллусной культуре S. coronata
Рис. 2. Динамика роста суспензионной культуры S. coronata по числу клеток
Культуры клеток Ajuga reptans
Культуры тканей A. reptans характеризовались активным ростом. Определение весовых характеристик тканей, так же, как и в случае каллусных культур S. coronata, показало, что при длительном культивировании происходит увеличение индексов роста по сухой биомассе почти в 1,2 раза (10,2±0,8 1994-1995 гг, 12,4±0,4 - 1998-2000 гг.) и в 1,4 раза по сырой биомассе (11,1± 0,9 1994-1995 гг. и 15,9±0,4 1998-2000 гг). Увеличение скорости роста характерно при длительном выращивании клеточных культур, поскольку в системе in vitro, как правило, происходит отбор клеток по максимальной и/или устойчивой пролиферации [13].
Ростовые кривые каллусной культуры имеют стандартную S-образную форму (рис. 3). После непродолжительной лаг-фазы (одни сутки) клетки вступали в фазу экспоненциального роста, продолжающуюся 10-12 дней.
Получение суспензионной культуры из рыхлого и обводненного каллуса произошло достаточно легко. Динамика роста суспензионной культуры по числу клеток показана на рисунке 4. Прироста биомассы в первые двое суток не наблюдалось (лаг-фаза), затем клетки вступали в фазу экспоненциального роста, а на 12-е сутки - в стационарную фазу. Индексы роста по сырой и сухой биомассе для данной культуры составляли 1ср=13,0 ±0,3 и 1сх =12,7±0,8 соответственно.
Рис. 3. Динамика роста каллусной культуры A. reptans по Рис. 4. Динамика роста суспензионной культуры A. сырой и сухой биомассе reptans по числу клеток
Некротические процессы в суспензионной культуре A. reptans незначительны и сохраняются на одном уровне, в пределах 10%, в течение всего пассажа.
Количественное определение 20Е проводили на стадии замедления роста для обоих типов культур. При переходе к глубинному типу культивирования происходит незначительное снижение содержания 20Е: 0,68±0,02 и 0,55±0,02% в каллусных и суспензионных культурах соответственно. Вероятно, причина этого заключается в лучшем межклеточном контакте и дифференциации, более ярко выраженной в каллусных культурах. Однако за счет изменения удельной скорости, которая при переходе к глубинному типу культивирования увеличилась в 1,3 раза, разница в продуктивности суспензионных и каллусных культур становится недостоверной.
Заключение
Таким образом, нами получены высокопродуктивные и активно растущие суспензионные культуры двух видов экдистероидсодержащих растений. Литературные данные в большинстве случаев свидетельствуют о невысоком уровне синтеза экдистероидов в недифференцированных культурах клеток растений этих видов. Так, по данным Саад [14, 15] суммарное содержание экдистероидов в сухой биомассе клеточных культур S. coronata - каллусах и суспензиях - составляет 0,007% и 0,074% соответственно.
По данным бельгийских исследователей [16], каллусные ткани Ajuga reptans на среде, содержащей 2,4-Д, продуцировали следовые количества 20Е и неидентифицированный метаболит. Времена удерживания этого метаболита и 20Е в ВЭЖХ-анализе были близкими. По данным японских исследователей, в каллусных тканях Ajuga reptans var. atropurpurea обнаружены следовые количества экдистероидов, тогда как содержание 20Е в культурах hairy root в 4 раза превышало его концентрацию в корнях интактных растений [17]. Испанские авторы получили каллусную культуру Ajuga reptans, в которой, несмотря на очень высокий уровень чувствительности ВЭЖХ-анализа (0,0005 м.д.), биосинтез экдистероидов не установлен [18]. Авторы сделали вывод о неспособности недифференцированных клеток живучки ползучей продуцировать экдистероиды. В полученных нами штаммах содержание 20Е относительно высоко по сравнению с данными других авторов.
Содержание 20Е в полученных нами суспензионных культурах S. coronata приближено к его
концентрации в корнях интактных растений, а в культуре клеток A. reptans - почти в 10 раз превышает
его концентрацию в розетках еще неукоренившихся молодых плагиотропных побегов, в которых было отмечено максимальное содержание, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований биосинтеза экдистероидов в культурах растительных клеток с точки зрения возможности биотехнологического получения 20-гидроксиэкдизона.
Список литературы
1. Koolman J. Ecdysteroids. Review // Zool. Sci. 1990. V. 7. P. 563-580.
2. Дайнан Л. Стратегия оценки роли фитоэкдистероидов как детеррентов по отношению к беспозвоночным
фитофагам // Физиология растений. 1998. Т. 45. №3. С. 247-359.
3. Slama K., Lafont R. Insect hormones - ecdysteroids: their presence and actions in vartebrates // Eur. J. Entomol. 1995. V. 2. №1. Р. 355-377.
4. Махов А.А. Зеленая аптека. Красноярск, 1993. 246 с.
5. Растительные ресурсы СССР. Т. 6: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hyppuridaceae. СПб., 1991. 198 с.
6. Володин В.В., Лукша В.Г., Дайнан Л., Пунегов В.В., Алексеева Л.И., Колегова Н.А., Тюкавин Ю.А., Ребров А.И. Инокостерон и макистерон А из Serratula coronata // Физиология растений. 1998. Т. 45. №3. С. 378-381.
7. Volodin V., Alexeeva L., Kolegova N., Sarker S., Sik V., Lafont R., Dinan L. Further ecdysteroids from Serratula coronata L. (Asteraceae) // Biochemical Systematics and Ecology. 1998. V. 6. P. 459-461.
8. Ануфриева Э.Н., Володин В.В., Носов А.М., Гарсиа М., Лафон Р. Состав и содержание экдистероидов в растениях и в культуре ткани Serratula coronata // Физиология растений. 1998. Т. 45. №3. С. 382-389.
9. Алексеева Л.И., Лафон Р., Володин В.В., Лукша В.Г. Экдистероиды Ajuga reptans L. // Физиология растений. 1998. Т. 45. №3. С. 372-377.
10. Алексеева Л.И., Тетерюк Л.В., Володин В.В., Колегова Н.А. Динамика содержания экдистероидов у Ajuga reptans L. на северной границе ее ареала (респ. Коми) // Растительные ресурсы. 1998. Т. 34. Вып. 4. С. 56-62.
11. Ануфриева Э.Н. Ростовые и биосинтетические характеристики культур клеток Serratula coronata и Ajuga reptans - продуцентов экдистероидов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1997. 26 с.
12. Колегова Н.А., Володин В.В. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография экдистероидов в системах, содержащих электронодонорные добавки // Журнал аналитической химии. 1999. Т. 54. №12. С. 1-4.
13. Носов А.М. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений. 1999. Т. 46. №6. С. 837-844.
14. Саад М.Л., Коваленко П.Г., Медведева Т.В., Корниец Г.В., Шуман Н.В., Холодова Ю.Д., Галкин А.П. Культура изолированных клеток и тканей серпухи венценосной как источник биологически активных фитоэкдистероидов // Физиология и биохимия культурных растений. 1992. Т. 24. №6. С. 611-615.
15. Саад М.Л., Коваленко П.Г., Заец В.Н., Корниец Г.В., Шатурский Я.П., Холодова Ю.Д., Галкин А.П. Сравнительный анализ белков клеточной культуры и полевых растений продуцента экдистероидов Serratula coronata L. // Укр. биохим. журнал. 1992. Т. 64. Вып. 6. С. 84-87.
16. Matsumoto T., Tanaka N. Production of ecdysteroid by hairy root cultures of Ajuga reptans var. atropurpurea // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. №4. P. 1019-1025.
17. Mboma N.D., Callebaut A., Motte J.C. Phytoecdysones in Ajuga reptans plants, callus and cell suspension cultures // Acta Botanica Neerlandica. 1986. V. 35. №1. P. 48.
18. Tomas J., Camps F., Coll J., Mele E., Messeguer J. Phytoecdysteroid production by Ajuga reptans tissue cultures // Phytochemistry. 1993. V. 32. №2. P. 317-324.
Поступило в редакцию 19 июля 2001 г.
После переработки 27марта 2002 г.
