CC BY
184
УДК 634.723:631.527
ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДОВ СЕЛЕКЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ СМОРОДИНЫ ЧЕРНОЙ (RIBES NIGRUM L.)
Князев С.Д., доктор сельскохозяйственных наук, директор Пикунова А.В., кандидат биологических наук Бахотская А.Ю., Шавыркина М.А., аспиранты Янчук Т.В., кандидат сельскохозяйственных наук Научно-исследовательский институт селекции плодовых культур, Орловская область, Россия *E-mail: ksd [email protected]
Чекалин Е.И., кандидат сельскохозяйственных наук, начальник НИЧ Орловский государственный аграрный университет, Орел, Россия E-mail: nichogau@yandex. ru
АННОТАЦИЯ
В статье рассматриваются направления исследований черной смородины во ВНИИСПК, дается анализ методов, применяемых в селекции черной смородины, позволяющих повысить их эффективность при достижении поставленных задач. Наиболее подробно приводится анализ исследований, направленных на создание сортов, устойчивых к болезням и вредителям с использованием доноров олигогенной устойчивости, и их совмещения в одном генотипе. Рассматриваются селекционные особенности повышения урожайности создаваемых сортов путем совмещения основных компонентов продуктивности. Также приведены данные по адаптации современных экспресс - методов определения фотосинтетического потенциала применительно к смородине черной. Показана перспективность использования ПЦР анализа в селекции черной смородины на устойчивость к почковому клещу, оценке генетического разнообразия генофонда чёрной смородины, в разработке методов идентификации и паспортизации различных сортов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Черная смородина, селекция, методы исследований, внутривидовая и отдаленная гибридизация, ДНК-маркирование.
Научная селекция смородины черной ведется более ста лет, и к настоящему времени достигнуты определенные успехи, позволившие ей занять достойное место среди ягодных культур.
В селекции черной смородины в той или иной степени использовались все известные на сегодняшний день методы и приемы селекции. Наиболее результативным было использование комбинативной селекции и отдаленной гибридизации. При решении некоторых задач имели значение и самоопыление, и мутагенез, и полиплоидия, хотя данные методы не оказали существенного влияния на селекцию культуры и использовались фрагментарно.
Возможность использования индуцированного мутагенеза в селекции черной смородины наиболее широко была изучена А. С. Равкиным, результатом которой явилось создание ряда ценных форм для использования в селекции.
Искусственно полученные полипоиды смородины черной, как правило, уступают диплоидным аналогам по комплексу признаков, включая урожайность, зимостойкость, а также устойчивость к болезням и вредителям [14]. Однако полиплоидия имеет большое значение для преодоления бесплодности межвидовых гибридов, например, при создании смородино-крыжовниковых гибридов, которые на диплоидном уровне бесплодны, а на тетраплоидном фертильны.
Основным методом создания гибридного материала черной смородины являются межсортовые скрещивания, что вполне оправдано, так как сорта концентрируют в себе лучшие качества культуры и тем самым являются донорами тех или иных признаков. При этом необходимо отметить, что на начальных этапах селекции межсортовые скрещивания проводились в пределах европейского подвида смородины черной, что позволило значительно обновить сортимент культуры. Но данный метод быстро исчерпал себя, так как в большинстве случаев гибридное потомство не выходило за пределы изменчивости родительских форм, и для серьезного улучшения основных признаков у создаваемых сортов требовались иные методы создания гибридного материала [9].
В 40-60 годы прошлого столетия проделана большая работа по изучению видового разнообразия рода Ribes L, систематизации и классификации собранного материала и выделению ценных форм для селекции [9,19]. Вовлечение в скрещивания диких сородичей смородины черной, то есть применение метода отдаленной гибридизации, стало переломным этапом в селекции культуры. Данный метод позволил получать генетически разнообразный материал и на его основе решать многие селекционные задачи, в том числе создание экологически пластичных, устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды, скороплодных, крупноплодных, стабильно плодоносящих сортов. К настоящему времени известны гибриды смородины чёрной с 28 видами и разновидностями в роде Ribes L., а современные сорта по генетическому происхождению можно отнести к 29 группам.
При тщательном изучении дикорастущих видов были выделены потенциальные доноры и источники устойчивости: к мучнистой росе - смородина клейкая (R. glutinosum Benth.), к столбчатой ржавчине - смородина уссурийская (R. ussuriensis Jancz.), к почковому клещу - сибирский подвид смородины черной [18,21]. Проведение насыщающих скрещиваний и целенаправленный отбор через несколько беккроссных поколений позволили избавиться от нежелательных признаков, присущих диким видам, выделить эффективные доноры иммунитета и создать на их основе сорта [8].
При этом наиболее значимым для селекции культуры было объединение российскими (советскими) селекционерам геномов европейского, сибирского подвидов смородины черной и смородины дикуши (R. dikuscha Fisch), ставшие основой практически всех современных сортов. Проводимые в настоящее время межсортовые скрещивания по сути своей являются гибридизацией сложных отдаленных гибридов, включающих до пяти таксонов.
Поскольку селекция черной смородины, как и других культур, основана на генетических принципах, также проводились исследования по генетике, хотя они не были систематическими и носили случайный характер. К настоящему времени идентифицировано более 30 генов, в основном это гены, контролирующие устойчивость к болезням и вредителям, определены некоторые группы сцепления генов. Уровень генетических исследований значительно отстал от решаемых селекционных задач.
В селекционные исследования смородины черной как за рубежом, так и в России широко внедряются различные молекулярные методы диагностики, позволяющие выявить филогенетические отношения, повысить эффективность отбора необходимых генотипов на ранних стадиях селекционного процесса.
В Шотландии проведены исследования по изучению и разработке микросателлитных и SNP праймеров для создания генетической карты чёрной смородины, объединяющей фенотипические данные и данные ДНК-маркеров; разработан, протестирован и рекомендован для маркерной помощи селекции ПЦР-основанный маркер, связанный с геном Се устойчивости к почковому клещу [16].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В селекционные исследования по созданию высокоустойчивых к болезням и вредителям сортов черной смородины, проводимые во ВНИИСПК, наиболее широко
вовлечены доноры олигогенной устойчивости: производные смородины клейкой, являющиеся донорами гена Sph3, контролирующего устойчивость к мучнистой росе [20], и гена Се, контролирующего устойчивость к почковому клещу. Ген Се в результате сложных скрещиваний на разных уровнях плоидности, при создании смородино-крыжовниковых гибридов, был передан смородине от крыжовника [21]. При этом растения, имеющие данный ген, не поражаются очень опасным микоплазменным заболеванием - реверсией (махровость). Другим эффективным донором иммунитета к мучнистой росе (ген R), также широко задействованным в наших селекционных исследованиях, является скандинавский сорт Сундербюн-II [24].
В изучении для определения генотипов нами был отобран 81 донор иммунитета к мучнистой росе, из которых: 29 - потомки смородины клейкой, предположительно, с генами устойчивости к мучнистой росе Sph3 и почковому клещу Се- 3017-4-9, 3190-4472, 3206-47-52, 762-5-82, сорта Кипиана, Гамма, Грация и др.; 8 - потомки сорта Сундербюн II, предположительно, с геном устойчивости к мучнистой росе R -2833-9199, 3269-42-184 и др.; 44-потомки смородины клейкой и сорта Сундербюн II-предположительно, совмещают гены устойчивости к мучнистой росе Sph3, R и почковому клещу Се-3330-49-131,3280-4-159, 3114-40-159,3007-3-199, 3007-3-188, 3038-5-139, 3007-2-154, 3184-11-15,3145-23-81, сорт Арапка и др.
Для идентификации генотипов, несущих гены R и Sph3, нами проводились анализирующие скрещивания, где в качестве рекуррентных родителей привлекались восприимчивые к мучнистой росе сорта с высоким уровнем хозяйственных признаков -Сокровище, Экзотика, Катюша, Ядреная.
С целью изучения наследования устойчивости к мучнистой росе и столбчатой ржавчине за годы исследований выполнено 207 комбинаций скрещивания и изучено 7,3 тыс. штук гибридных сеянцев.
Основная часть наблюдений за сортами и отборными формами по самоплодности, крупноплодности, урожайности, устойчивости к болезням и вредителям была выполнена согласно общепринятым методикам селекции и сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур [7,12, 13].
В своих исследованиях по конструированию высокоурожайных генотипов мы использовали метод отбора по компонентам продуктивности с последующим их совмещением в одном генотипе [4].
Для преодоления отрицательной корреляционной зависимости между массой ягоды и содержанием аскорбиновой кислоты предлагается подбор комбинаций скрещивания с включением высоковитаминных и крупноплодных сеянцев [8], а также использование инбредной депрессии [1].
Молекулярно-генетический анализ. ДНК выделяли из молодых листьев СТАВ-методом [17,22]. RAPD маркеры. 47 сортообразцов из коллекции задействованы в анализе (таблица 1). Для PCR использовали праймеры серий OPA, OPD, OPE, OPH, OPK, OPN («Operon Technologies», США). Реакцию амплификации проводили в реакционной смеси объемом 15 мкл, содержащей 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP; 0,5 мкМ праймера; 0,3 единицы Taq полимеразы, 1x буфер из соответствующего набора («Диалат ЛТД», Москва), и 100 нг геномной ДНК, в термоциклере GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США) в режиме: денатурация — 30 сек. при 94 °С; отжиг праймера — 45 сек. при 37 °С; синтез ДНК — 1 мин при 72 °С с числом циклов — 36 и предварительной денатурацией — 5 мин (94 °С). Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 1,7% агарозном геле в 1хТВЕ буфере, с последующим окрашиванием бромистым этидием. При разделении фрагментов на геле использовали GeneRulerTM 100bp DNK Ladder Plus (Fermentas, Литва) маркер молекулярных масс. Статистическую обработку данных, расчет генетических расстояний (GD) с использованием коэффициента различий и кластерный UPGMA анализ проводили с использованием программ STATISTICA-6.0 и TREECON RAPD, анализ представителей рода Ribes L. был проведён в ходе научной стажировки в Центре «Биоинженерия» РАН, Москва, в группе молекулярных методов анализа генома, руководитель группы д.б.н. Кочиева Е.З.
Таблица 1 - Взятые в РАРй анализ сортообразцы рода Ribes, их таксономическая принадлежность (основана на классификации Rehder А., 1954 [23])
№ в анализе Название образца Вид/разновидность Подрод Секция Виды и формы, присутствующие в родословной
1 2 3 4 5 6
крыжовники
2 258 R. grossularia L. Grossularia Rich. Eugrossularia
3 250
4 Гроссуляр R. grossularia L.
5 13-15-3
смородинно-крыжовниковые гибриды
6 Josta (Иошта) гибрид Grossularia Rich. X Ribesia Berl. Eugrossularia X Eucoreosma Jancz. R. nigrum
Ribes divaricatum
7 203029-61
чёрная смородина
8 В1613/17 Комплексный гибрид, включает:
Grossularia Rich. Eugrossularia Engh R.oxyacanthoides
Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum
R.braсteosum Dough
Calobotrya Spach R^M^sum Benth
9 29 35 Кипиана Гамма Грация Комплексный гибрид, включает:
Grossularia Rich. Eugrossularia Engh R.oxyacanthoides
Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum subsp. sibiricum Wolf E. R. nigrum subsp. scandinavicum R. nigrum subsp. europaeum
R.dikuscha Fisch. ex Turcz.
Calobotrya Spach R.glutinosum Benth
10 Бурая сладкая R. nigrum subsp. sibiricum Wolf E. Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz.
11 Памяти Правика R. nigrum subsp. sibiricum Wolf E. R. nigrum subsp. europaeum Jancz. Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz.
12 Ртищевская R. nigrum subsp. europaeum Jancz. Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz.
16 Веллингтон ХХХ
13 Отелло R. nigrum subsp. europaeum Jancz.Х 'P* Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz..
14 Северянка
15 Силго
17 Бен Сарек R. nigrum subsp. europaeum R. nigrum subsp. scandinavicum Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz.
18 Бен Ломонд гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum subsp. europaeum R. nigrum subsp. scandinavicum
R.ussuriense
19 Оджебин R. nigrum subsp. scandinavicum Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz.
20 Титания гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum subsp. sibiricum Wolf E. R. nigrum subsp. scandinavicum R. nigrum subsp. europaeum
R.ussuriense
1 2 3 4 5 6
21 Сластёна гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum subsp. sibiricum Wolf E. R. nigrum subsp. scandinavicum R. nigrum subsp. Europaeum R.dikuscha Fisch. ex Turcz.
22 Памятная
25 Ажурная
24 Орловская серенада
27 Ладушка
28 Очарование
30 Чёрная вуаль
31 Блакестон
32 Монисто
33 Искушение
26 Дачница
23 R.hudsonianum Bourg. ex S.Wats. гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz.. R.hudsonianum Bourg. ex S.Wats.
R.dikuscha Fisch. ex Turcz.
34 Чудное мгновение гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum subsp. sibiricum Wolf E. R. nigrum subsp. scandinavicum R. nigrum subsp. europaeum
R.dikuscha Fisch. ex Turcz.
R.pauciflorum Turcz
36 Уссури R.ussuriense Jancz.. Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz.
37 3864-46-62 гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum subsp. sibiricum Wolf E. R. nigrum subsp. europaeum
R. procumbens Pall.
смородина кроваво-красная
38 Кроваво-красная R. sanguineum Pursh Ribesia Berl. Calobotrya Spach
красная смородина
39 Приморская форма R.multiflorum Kit.. или R.mandshuricum** Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz.
40 1002-17-110 гибрид Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz. R.multiflorum Kit.
R.sativum Syme subsp. macrocarpum Jancz.
R. petraeum subsp. atropurpureum
41 Смородина Тёмно- пурпуровая R. petraeum subsp. atropurpureum Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz.
42 970-18-41 Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz. R.sativum Syme
R.rubrum Z.
R. petraeum subsp. atropurpureum
43 Виктория R.rubrum L. Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz.
44 Голландская белая R.sativum Syme Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz.
45 Файя плодородная R.sativum Syme subsp. macrocarpum Jancz. Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz.
46 Красная Виксне R. warszewiczii Jancz. Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz.
47 Скороспелая R.palczewskii (Jancz.) Pojark Ribesia Berl. Ribesia Berl., emend Jancz.
смородина золотистая
48 Ляйсан R. aureum Pursh Ribesia Berl. Symphocalyx Berl.
*- родословную некоторых сортов невозможно установить точно, данные утеряны **-дикая форма, к какому именно виду принадлежит, не установлено
SCAR маркер гена Ce. Были протестированы: 31 сортообразец чёрной смородины, 1 сортообразец смородины кроваво-красной, 3 сортообразца крыжовника и 2 смородинно-крыжовниковых гибрида (см. таблицу 5). Реакцию амплификации проводили в реакционной смеси конечным объемом 20 мкл, содержащей 1,6 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP; 0,17 мкМ обоих праймеров (GMresaF 5' TTACCGCAGATACAAGGTGAAG 3' и GMresaR 5' GGACTAGGCCTTCTTATGAC 3'[16].; 0,3 единицы Gold DNA polimerase, 1x ПЦР буфер, и 10 нг геномной ДНК, в термоциклере GeneAmp PCR System2700 («Applied Biosystems», США). Режим амплификции: денатурация - 30 сек. при 94°С; отжиг праймера - 30 сек. при 58°С; синтез ДНК - 30 сек при 72°С (числом циклов - 30); предварительная денатурацией -15 мин (94°С) и завершающая элонгация - 10 мин при 72°С. Описанный режим амплификации был подобран экспериментальным путём. Продукты амплификации разделяли путём горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в 1хТВЕ буфере c окрашиванием бромидом этидия. При разделении фрагментов на геле использовали GeneRulerTM Express DNA Ladder (Fermentas) маркер молекулярных масс.
Генотипирование по микросателлитным локусам. Объектом исследования были 27 сортов черной смородины из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур (ВНИИСПК), в том числе 16 сортов селекции ВНИИСПК — Ажурная, Грация, Гамма, Дачница, Орловский вальс, Монисто, Орловия, Искушение, Чудное мгновение, Очарование, Сластена, Черная вуаль, Экзотика, Блакестон, Зуша, Кипиана, а также сорта других оригинаторов — Оджебин, Титания, Шаровидная, Селеченская, Минай Шмырев, Ртищевская, Консорт, Бинар, Говтва, Канахама, Ядреная. Всего были проанализированы 14 микросателлитных локусов — e1-001, e1-O21, e3-B02, e4-D03, g1-B02, g1-E03, g1-K04, g1-M07, g2-B20, g2-H21, g2-J08, g2-L17, g2-G12, MS06g03 (http://www.fruitbreeding.co.uk/RibesGenomicsSSRs.asp). ПЦР анализ проводили в реакционной смеси объёмом 20 мкл, содержащей 1х ПЦР буфер, 200мкМ нуклеотидов, 2 мкМ прямого праймера, 2мкМ обратного прай-мера, 0,3 ед Taq ДНК полимеразы и 10 нг ДНК в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («AppliedBiosystems», США). При анализе полиморфизма микросателлитных локусов использовали электрофоретическое разделение в 6% денатурирующем ПААГ в камере Sequi-Gen GT System, 38x50 см (Био-Рад, США) с последующим окрашиванием нитратом серебра (Маниатис,1984) на базе лаборатории генетики растений ИОГЕН РАН. Размеры фрагментов определяли, сравнивая с маркером молекулярных масс 10 bp DNA Ladder («Invitrogen™», США).
Анализ функциональной активности фотосинтетических систем растений изучался по показателям скорости фотосинтеза листьев по оригинальной методике LiCor на приборе Li-6400. А в основу исследований легла методика оценки фотосинтетической деятельности смородины черной [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Использование доноров с различными генами устойчивости позволило нам в короткий срок создать иммунный к мучнистой росе гибридный фонд и на его основе вести всю селекционную работу по черной смородине. К настоящему времени практически весь гибридный фонд состоит из гибридных сеянцев, полученных на их основе. Очень эффективным оказалось вовлечение в селекцию производных смородины клейкой, которые, кроме того что являются донорами иммунитета к мучнистой росе, проявляют также иммунитет к почковому клещу и столбчатой ржавчине.
На основании расщепления гибридного потомства нами установлена неаллельность генов R, Sph3, при этом они имеют различный механизм устойчивости. Нами впервые в селекции черной смородины были проведены целенаправленные исследования по созданию дигенного (гены R и Sph3) и гомозиготного по доминантным аллелям генов R и Sph3 гибридного фонда, иммунного к мучнистой росе, что позволяет
повысить эффективность селекционного процесса и обеспечить более длительное сохранение невосприимчивости к патогену.
В результате анализирующих скрещиваний для дальнейших селекционных исследований нами выделены доноры 3017-4-9, 3190-44-72, гомозиготные по доминантной аллели гена ЭрЬ3 и 3007-2-154, гомозиготный по доминантным аллелям генов Я и Эр1п3 (таблица 2).
Таблица 2 - Расщепление по устойчивости к мучнистой росе доноров, гомозиготных по доминантной аллели гена БрЬ3 и совмещающих гены БрЬ3 и Я.
Комбинация скрещивания Количество сеянцев (шт.) Ожидаемое расщепление х2
всего устойчивых восприимчивых
3017-4-9 х Сокровище 52 35 17 3:1 1,61
3190-44-72 х Ядреная 134 94 40 3:1 1,6
3007-2-154 х Сокровище 46 46 0 4:0 0
3007-2-154 х Экзотика 51 36 15 3:1 0,52
Оценка устойчивости к столбчатой ржавчине генофонда смородины черной показала, что невосприимчивость к болезни проявляют потомки смородины клейкой. На основании расщепления гибридного потомства (таблица 3) установлено, что их устойчивость к столбчатой ржавчине на высоком стабильном уровне передается гибридному потомству, имеет моногенный характер наследования и контролируется доминантной аллелью гена, которому был присвоен символ Ре [5].
Таблица 3 - Расщепление по устойчивости к столбчатой ржавчине в гибридном потомстве
смородины клейкой
Комбинация скрещивания Количество сеянцев, шт. Ожидаемое расщепление х2
всего устойчивых восприимчивых
762-5-82 х Экзотика 56 35 21 1 1 2,8
762-5-82 х Катюша 25 13 12 1 1 0,04
Гамма х 3018-6-163 45 29 16 1 1 3,74
Гамма х 2083-32-158 82 49 33 1 1 3,12
Сокровище х Кипиана 28 17 11 1 1 1,2
Кипиана х Сокровище 54 30 25 1 1 0,66
Полусибскрещивания
2780-20-23 х 3038-5-11 21 18 3 3 1 1,27
Гамма х 3038-5-11 19 15 4 3 1 0,17
2746-7-40 х Кипиана 38 33 5 3 1 2,86
Самоопыление
3038-5-11 х 3038-5-11 32 28 4 3:1 2,6
3038-5-145 х 3038-5-145 63 46 17 3:1 0,12
Поскольку отбор устойчивых к столбчатой ржавчине генотипов проводился на иммунном к мучнистой росе гибридном фонде, то многие отобранные нами гибридные сеянцы совмещают невосприимчивость сразу к двум болезням, а одна форма - сорт Арапка передана в ГСИ.
Наиболее интенсивно ведутся селекционные исследования по созданию сортов, невосприимчивых к наиболее опасному и малоуязвимому из вредителей - почковому клещу.
К настоящему времени идентифицировано два гена устойчивости к почковому клещу: ген Р - у потомков сибирского подвида смородины черной [15], и ген Се, который передан смородине от крыжовника [21](таблица 4).
Высокий процент устойчивых сеянцев в гибридных семьях и семьях, полученных от самоопыления, подтверждает предположение, что устойчивость к почковому клещу у потомков смородины клейкой контролируется олигогеном Се.
На основании многолетних наблюдений расщепления гибридного потомства нами установлено, что наследование устойчивости к мучнистой росе, столбчатой ржавчине и почковому клещу имеет независимый характер, что позволяет нам вести отбор
генотипов на очень высоком уровне.
Использование производных смородины клейкой в качестве основы для отбора устойчивых к мучнистой росе, столбчатой ржавчине, листовым пятнистостям и почковому клещу гибридов позволило значительно ускорить получение доноров, а на их основе сортов (Кипиана, Арапка, Гамма, Оазис) с олигогенной устойчивостью к болезням и почковому клещу.
Таблица 4 - Наследование устойчивости к почковому клещу в гибридном потомстве
смородины клейкой (доноров гена Се)
Комбинация скрещивания Количество сеянцев, шт. х2
всего в семье устойчивых восприимчивых
Ожидаемое расщепление 1:1
762-5-82 х 589-1-41 67 34 33 0,1
762-5-82 х 425-16-114 61 21 40 5,9*
762-11-82 х 377-18-79 19 10 9 0,05
1284-22-147 х Грация 121 73 48 5,6*
Ожидаемое расщепление 1:3
1511-4-89 х 1511-4-89 35 31 4 3,43
1497-3-105 х 1497-3-105 17 15 2 1,58
1930-64-68 х 1930-64-68 24 21 3 2,0
1448-14-49 х 1448-14-49 88 71 17 1,51
*- фактическое расщепление не соответствует теоретически ожидаемому.
Для повышения эффективности селекционных исследований нами проводятся молекулярно - генетические исследования с привлечением различных типов ДНК-маркеров. Проведенный RAPD анализ представителей различных видов рода Ribes I.. из коллекции ВНИИСПК [10,11] выявил достаточно высокий уровень полиморфизма (в среднем на праймер 98,5%), позволяющий различить даже близкородственные сорта (рис.1).
го то со
ОР1М19 ОРЕ1 ОРГШ
Рисунок 1 - Полиморфизм близкородственных сортов: полиморфные фрагменты указаны стрелками; внизу названия праймеров, вверху - сортов.
На основании РДРй данных установлено, что образцы крыжовников генетически ближе к образцам секции чёрных смородин, чем к образцам красных смородин, а смородино-крыжовниковые гибриды генетически ближе к представителям смородины чёрной, чем к крыжовникам. Смородина кроваво-красная ближе к кластеру смородин и крыжовников, чем к образцам красных смородин, а смородина золотистая является наиболее генетически отдалённой от всех исследованных представителей рода. Полученные нами данные (рис. 2) свидетельствуют в пользу классификации [23], выделяющей смородину красную, смородину чёрную и крыжовник в отдельные подроды рода Я1Ьев I..
0.7
ч-
0.6
15
—I-
0.4 —I-
о.э
—I-
0.2
—Ь-
0.1
—I-
57
73
S3
100
4_R, uva-crispa 5_R, uva-cris pa (13-15-3) 2_R, uva-cris pa(2 58) 3_ R, uva-cris pa(2 50) 6_R, uva-cris pavR, nigrum (Йо шта) 7 R. ura-cris pa¿Rnigruin{2 0-30-29-61) 13_R. nigrum y? (Отелло) 14_R. i) is ru in at? (С e в e p я h na) ^комплексный гиорид (Гамма) 35_комплекснын гибрид (Грация) 32 R.nigruin,R.dikus b а (Mo н н с то ] Экимплекснын гнбрнд(Е 1613/17) 9_комплекснын гиорид (Кип на на) 24_R.itigruiii,R. dikus ||а(Орлов екая серенада) 15_R. i) ig ru in y? (С и лт о) ITILnigrnm/mikn s 11 a (Л адушк a) 2SJL nignun/R. dikus |1а(Очаро ванне) 31_R.nigruiii..R. dikus ||а(Блакестон) 33_R. nignun/R. dikus I) a (lie кушенн e) 25_R.uigruni..R.dikuslia(A%ypKaj[) 21_R. nignun/R. dikus Ка(Сластёна) 2 J R.nignun/R.dikus li а (Па з i я тн а я) 11_R. nigrum (Памяти Правнку)
1 S_R. i) is ru in (В еллн нтто н-3 0)
34_R.nigruiii/R. dikus ha/R.paucifloruui(4v^Hoe мгновение) 26_R. uigruin;R.dikusliap;a4HHua) 30_Чёрнал вуаль 1D_R. nigrum (Б урая сладкая]
2 0_R. nignun/R. us s urieus e(T нтання ] 12_R. nigrum (Ртнш ев екая) 17_R. nigrum (Бен Capee) 18_R. nignun/R. us s urieus е(Бен Л омонд) 19_R. nigrum (ОджеЗнн)
3 c¡_R, us s urieus e (Уссури) 3 7_R. li is ru in -R. procunibens (3 86 4-46-6 2) 23_R. hudzo ii ia и и m vR. dikus Ka(D ikXHud 3 8) 3&_R.sauguiiieuui(Кроваво красная)
3 9_R. ni uitiClo гиш(Прнморская форма) 42_R. s itimm/R. rubruni/R, petreum (9 70 -18-41) 43_R. rulj ru m (В н кто p н я) 44_R. s ativum (Голландская белая) 4s_R. sativum (Файл Плодородная) 47_R. [i a le: eivs kiifC ко [i о с п е л а я ] 41_R.petreuui(IeMHO пурпуров ая)
4 О R. m uitiДо гиш R. sativui» R. реггеиш (1002-17-110) 46_R.warszeiviczii(KpaFHaH е икс не) 4 8_R. аигеиш(Лян сан)
- l_outgroup
Рисунок 2 - Филогенетическое дерево генетического сходства 47 образцов рода Ribes, построенное на основании данных RAPD анализа
se
Л» г
»
S3r
67
Высокую эффективность и существенную помощь данный метод исследований, основанный на ПЦР анализе, может оказать при создании сортов, устойчивых к почковому клещу. При проведении нами SCAR маркирования маркером, разработанным в Шотландском институте[16], было правильно определено наличие или отсутствие гена Се у всех 37 изученных сортообразцов, что позволяет данный маркер использовать для отбора устойчивых к почковому клещу генотипов на ранних стадиях онтогенеза (рис. 3, таблица 5).
Рисунок 3 - Электрофореграмма ПЦР продуктов с парой праймеров GMresa к гену Се; 2,3,4 -сортообразцы крыжовника, 5,6 -смородинно-крыжовниковые гибриды, 7-12 - сортообразцы черной смородины, 7 - В1613/17, 8 - Кипиана, 9 - Монисто, 10 - Искушение, 11 - Чудное мгновение, 12 - Грация, М-маркер молекулярного веса, -К - отрицательный контроль. Надпись «Се» указывает присутствие гена Се у образца чёрной смородины по данным селекционных наблюдений.
Таблица 5 - Скрининг присутствия маркера гена Се, контролирующего устойчивост чёрной смородины к почковому клещу
№ Название сортообразца Ген SCAR маркер Оригинатор
Се 1 Р
Крыжовник
2 250 + - + ВНИИСПК, Орёл
3 Гроссуляр + - + ВНИИСПК, Орёл
4 13-15-3 + - + ВНИИСПК, Орёл
Смородинно-крыжовниковые гибриды
5 Josta (Иошта) + - + Германия
6 2030-29-61 + - + Россия
Смородина
7 В1613/17 + - + Великобритания
8 Кипиана + - + ВНИИСПК, Орёл
9 Монисто - + - ВНИИСПК, Орёл
10 Искушение - + - ВНИИСПК, Орёл
11 Чудное мгновение - + - ВНИИСПК, Орёл
12 Грация + - + ВНИИСПК, Орёл
13 1448-14-24 + - + ВНИИСПК, Орёл
14 Ojebyn (Оджебин) - - - Северная Швеция
15 Кроваво-красная ? - - Дикая форма
16 Чёрная вуаль - - - ВНИИСПК, Орёл
17 3864-46-62 - - - ВНИИСПК, Орёл
18 Бурая сладкая - - - Россия, Бакчар
19 Памяти Правика - - - Украина
20 Ртищевская - - - Россия, Саратовская оп.ст.с.
21 Otelo (Отело) - - - Словакия, Бойнице
22 Северянка - - - Россия, Киров
23 Silgo (Силго) - - - Германия, Кельн
24 Wellington XXX (Веллингтон ХХХ) - - - Великобритания
25 Ben Sarek (Бен Сарек) - - - Шотландия
26 Ben Lomond (Бен Ломонд) - - - Шотландия
27 Titania (Титания) - - - Швеция
28 Сластёна - - - ВНИИСПК, Орёл
29 Памятная - - - Украина
30 R.hudsonianum x R. dikuscha - - - Литва, Вильнюс
31 Орловская серенада - - - ВНИИСПК, Орёл
32 Ажурная - - - ВНИИСПК, Орёл
33 Дачница - - - ВНИИСПК, Орёл
34 Ладушка - - - ВНИИСПК, Орёл
35 Очарование - - - ВНИИСПК, Орёл
36 Гамма - - - ВНИИСПК, Орёл
37 Блакестон - - - ВНИИСПК, Орёл
38 Уссури - - - Россия, Дальневосточная стан. ВИР
Впервые в России, на основе анализа 14 микросателлитных локусов нами проведено генотипирование 27 сортообразцов чёрной смородины, в том числе 16 сортов селекции ВНИИСПК (рис. 4).
290
280
Рисунок 4 - Электрофореграмма амплификации локуса д1-К04 на ДНК 27 сортообразцов (вверху - названия сортообразцов, м.м. - маркер молекулярного веса 10 Ьр, справа указаны размеры фрагментов м.м. в п.н., под рисунком условно пронумерованы типы генотипов, выделенные в этом локусе).
Минимальный набор из четырёх (е4-й03, д1-Мо7, д1-Е03, д2-Ь20) микросателлитных локусов позволил отличить все протестированные сортообразцы друг от друга. Полученные данные в дальнейшем могут быть использованы для ДНК-паспортизации изученных сортообразцов.
Несмотря на важность многих селекционных признаков, основной задачей при создании сортов, определяющих их конкурентоспособность, является величина и качество урожая. Задача селекционера при создании новых сортов для достижения высокой, стабильной урожайности объединить все составляющие морфоструктурных компонентов продуктивности на оптимально высоком уровне в одном генотипе.
Анализ совершенствования сортимента черной смородины показывает, что основной прирост урожайности обеспечивался за счет увеличения массы ягоды, которая у современных сортов в 2-3 раза выше, чем у ранее возделываемых, и повышения самоплодности, уровень которой у большинства современных сортов 50% и более. В то же время отбор на остальные компоненты продуктивности или не велся, или не было достигнуто существенных успехов. Например, длина кисти современных сортов варьирует в пределах 5-10 ягод, хотя максимальный уровень признака у доноров достигает 80.
Проведение целенаправленного отбора по компонентам продуктивности в течение двух генераций позволили отбирать формы с потенциальной урожайностью более 6 кг/куст, или более 40 т/га. Такой высокий потенциал продуктивности возможен у форм, имеющих 20 и более плодоносящих побегов на куст, 70 и более процентов плодоносящих узлов, не менее 6 ягод в кисти со средней массой 1,2 г и более, самоплодность не менее 60% (таблица 6).
Значительный прогресс достигнут в селекции черной смородины на крупноплодность, максимальная масса некоторых сортов достигает 8 и более грамм, что связывают с отдаленной гибридизацией: объединением геномов европейского и сибирского, скандинавского подвидов смородины черной и некоторых форм смородины дикуши [2]. Однако такие сорта, как Купалинка, Софья, Нестор Козин, превосходящие по массе ягоды родительские сорта, получены с использованием инбридинга, что не исключает использование данного метода в селекции на крупноплодность [1].
Перспективным в селекции черной смородины, но пока мало используемым из-за трудоемкости методом, позволяющим значительно повысить потенциал продуктивности (до 12 т/га) создаваемых сортов, является направленное улучшение их фотосинтетической активности [3].
Таблица 6 - Характеристика лучших сортов и отборных форм по сочетанию компонентов
продуктивности
Сорт, форма Плодоносящих Длина междоузлий, см % много-кистных узлов Число ягод в кисти, шт. Само-пло-дность,% Средняя масса ягоды, г Потенциальная продуктивность кг/куст
побегов, шт узлов на побеге, шт.
2780-20-23 21 20 3,3 0 6 72 2,3 5,8
3335-42189 20 19 4,0 6 8 82 1,9 5,7
3330-49114 18 21 3,1 5 7 79 1,8 4,7
3226-47-52 20 18 3,4 2 6 75 2,1 4,5
3006-14-88 32 16 3,4 21 7 1,2 45,0 4,3
Орловская серенада 26 18 3,9 1 7 67 1,0 3,2
Севчанка 19 17 4,2 7 6 72 1,0 2,5
Пигмей 20 15 4,5 - 7 64 1,1 2,3
Проведенные нами совместно с Орел ГАУ исследования по оценке фотосинтетической активности гибридных растений черной смородины показали, что основную нагрузку по обеспечению растений продуктами ассимиляции выполняют листья побегов продолжения и замещения (таблица 7), а примордиальные участвуют в активном фотосинтезе только в период цветения и начале формирования плодов [6].
Таблица 7 - Оценка сортов черной смородины по интенсивности фотосинтеза и транспирации
в фазу созревания ягод
Сорт ИФ* ИТ**
Чудное мгновение 4,46 1,29
Дачница 6,80 2,46
Загляденье 4,62 1,93
Ажурная 6,00 3,70
* ИФ - интенсивность фотосинтеза, ¡jmol C02/m2s. ** ИТ - интенсивность транспирации, mmol Н2О/т s.
Ягоды черной смородины характеризуются высоким содержанием биологически активных веществ, особенно витамина С (аскорбиновой кислоты - АК) и Р-активных веществ, между которыми отмечен синергизм, т. е. взаимное усиление действия при совместном их употреблении. Р-активные вещества также способствуют лучшей сохранности витамина С при переработке.
Для преодоления отрицательной корреляционной зависимости между массой ягоды и содержанием аскорбиновой кислоты нами разработана методика подбор комбинаций скрещивания с включением высоковитаминных и крупноплодных сеянцев [8]. Использование данных методов позволило создавать сорта, сочетающие высокую С-витаминность с крупноплодностью (таблица 8).
Таблица 8 - Биохимическая оценка лучших по комплексу признаков сортообразцов
смородины черной
Сорт, отборная форма Масса, г АК, мг/100 г Сумма Органические кислоты,%
сахаров,% Р-активных в-в, мг/100 г
Десертная Огольцовой 1,3 233,8 11,60 417,4 2,34
Ладушка 1,5 155,5 10,40 685,7 2,53
Надежа 1,2 184,2 12,27 510,3 3,05
2083-32-153 1,4 165,4 10,63 543,3 2,64
3808-43-23 1,3 230,6 11,6 - -
2150-33-164 1,1 223,7 10,69 792,0 2,30
3007-2-154 1,0 271,9 10,31 807,9 2,78
3014-15-233 1,0 195,4 10,68 902,2 1,97
3017-4-9 0,9 163,7 10,51 1188,6 2,77
3045-16-68 1,1 165,0 11,72 687,6 2,91
3059-48-69 1,0 196,5 10,73 391,6 2,82
Вестник ОрелГАУ, 5(50), Октябрь 2014 ВЫВОДЫ
Одним из факторов успеха и эффективности селекционных исследований является выбор их направления и методов, позволяющих в максимально сжатые сроки, а в некоторых случаях и с более низкими затратами достичь поставленной цели. В селекции черной смородины использование методов межсортовой и отдаленной гибридизации, насыщающих скрещиваний позволило решить такие задачи, как устойчивость к болезням и вредителям, самоплодность, крупноплодность, высокий уровень биохимического состава.
В то же время в селекции на устойчивость к таким опасным заболеваниям, как антракноз и септориоз, не достигнуто таких успехов, что прежде всего, связано с отсутствием эффективных доноров олигогенной устойчивости признака. А использование доноров с полигенным контролем признака менее эффективно, но, как показывают наши исследования, при правильном подборе пар скрещивания выщепляется достаточно большое количество генотипов с высоким уровнем устойчивости.
Необходимо отметить, что используемые в настоящее время методы не позволяют создавать сорта черной смородины, сочетающие длиннокистность и крупноплодность. Требуют совершенствования и адаптации методики массового отбора по признакам максимальной продуктивности и стабильности плодоношения; иммунитета и высокой устойчивости к вредителям и болезням и их сочетание; устойчивости к заморозкам в период цветения. Недостаточно изучен и ограниченно используется в селекции потенциал рода №Ьвв Ц, несовершенны методы преодоления нескрещиваемости видов; не разработана методика компьютерного моделирования селекционного процесса. Ни в методическом, ни в селекционном плане не разработаны методы отбора растений с ярко выраженной продуктивной (секреторной) функцией корней, позволяющие значительно повысить мобилизацию естественных почвенных ресурсов.
Учитывая современный уровень и тенденции развития исследований, применяемых в работе с растениями, в ближайшие годы наиболее эффективным путем совершенствования сортов черной смородины будет освоение методов, позволяющих конструировать генотипы с заданными свойствами. Для этого необходимо усилить генетические исследования для построения генетических карт культуры, отработать систему генетического маркирования, адаптировать методы генной инженерии применительно к культуре и отбора генотипов с заданными свойствами.
Таким образом, в настоящее время и ближайшей перспективе, селекционные программы по черной смородине будут базироваться на сочетании классических, с адаптированными применительно к культуре современными генетическими, биохимическими и физиологическими методами исследований, позволяющими значительно интенсифицировать создание сортов с заданными свойствами.
Исследования выполнены за счет гранта Российского Научного Фонда (проект №14-16-00127).
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Астахов, А. И. Методы отбора по комплексу признаков и подбора родительских форм в селекции плодовых и ягодных культур / А. И. Астахов // Сельскохозяйственная биология - 2006. - № 3.- С.89-96.
2. Волузнев, А. Г. Селекция чёрной смородины на широкой генетической основе / А. Г. Волузнев // Культура чёрной смородины в СССР: докл. симпозиума. - Москва, 1972. - С. 399-404.
3. Жидехина, Т. В. Перспективные направления селекции черной смородины / Т. В. Жидехина // Садоводство и виноградарство. - 2001. - № 3. - С. 29-30.
4. Князев, С. Д. Селекция черной смородины на современном этапе / С.Д. Князев, Т.П. Огольцова. - Орел: Изд-во Орел ГАУ, 2004. - 238 с .
5. Князев, С. Д. Наследование устойчивости к столбчатой ржавчине и создание доноров и сортов с олигогенным контролем признака / С. Д. Князев, А. В. Николаев // Доклады РАСХН. - 2007. - №6. - С.17-20.
6. Князев, С. Д. Оценка фотосинтетической деятельности сортов смородины черной / С. Д. Князев, Е.А Чекалин, А.Ю. Андрианова // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. работ ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии. Т. XXXII. Ч.1 - М., 2012.- С. 207-214.
7. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир,1984. - 479 с.
8. Огольцова, Т. П. Селекция чёрной смородины - прошлое, настоящее, будущее / Т. П. Огольцова. - Тула: Приок. кн. изд-во, 1992. - 384 с.
9. Павлова, Н. М. Чёрная смородина / Н. М Павлова - М.-Л.: Сельхозгиз, 1955. - 277 с.
10. Пикунова, А. В. Применение RAPD-анализа для изучения полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Ribes L. / А.В. Пикунова [ и др.] // Экологическая генетика. Т. IX. - 2011. - №2. - С. 34-44.
11. Пикунова, А. В. Молекулярные маркеры хозяйственно ценных признаков ягодных культур / А. В. Пикунова, С. Д. Князев, Н. Е. Павловская // XII молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», 2012, С.51-53.
12. Седов, Е. Н. Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур / Ред. Седов Е.Н.; - Орел: Изд-во ВНИИСПК, 1995. - 502 с.
13. Седов Е.Н. Программа и методика сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур / Ред. Седов Е.Н.; - Орел: Изд-во ВНИИСПК, 1999. - 608 с.
14. Чувашина, Н. П. Цитогенетика и селекция отдаленных гибридов и полиплоидов смородины / Н. П. Чувашина. - Л.: Наука, 1980. - 120 с.
15. Anderson, M. M. Resistance to gall mite (Phytoptus ribes Nal.) in the Eucorcosma section of Ribes / M. M. Anderson // Euphytica. - 1971. - N. 20.- P. 422-426.
16. Brennan, R. The development of a PCR-based marker linked to resistance to the blackcurrant gall mite ( Cecidophyopsis ribis Acari: Eriophyidae) / R. Brennan [et al.] // Teoretical and Applied Genetics. - 2009. - Vol. 118. - P. 205-211.
17. Doyle, J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / J .J. Doyle, J. L. Doyle // Phytochemical bulletin. - 1987. - Vol. 19 - P.11-15. http://irc.igd.cornell.edu/Protocols/DoyleProtocol.pdf
18. Hanter, A.W. Black currants // Prog. Rpt. Cent. Exp. Fm. - Ottawa, 1949- 1955. - P. 2829.
19. Keep, E. Interspecific hybridization in Ribes genetic / E. Keep // Euphytica 33. - 1962. -№ 1. - P.1-24.
20. Keep, E. Black currant breeding using related species as donors / E. Keep, J. Parker, V. Knight // A R S Res. Rev. - 1977. - Vol. 3. - №3. - P. 86-88.
21. Knight, R. L. Transference of resistance to black currant gall mite Cecidophyopsis ribis from gooseberry to black currant / R .L. Knight [et al.] // Ann. Appl. Biol. -1974.- N.76. - P. 123-130.
22. Puchooa ,D. A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchinensis Sonn) / D. Puchooa // African Jornal of Biotechnology.April.- 2004 -Vol. 3. - N. 4. - P. 253-255.
23. Rehder, А. Manual of cultivated trees and shrubs / А. Rehder. // 2nd ed. New York: Macmillan,1954. - 996 p.
24. Trajkovski, V. Resistance to Sphaerotheca mors - uvae ( Schw. ) Berk. in Ribes nigrum L. 5. Studies on breeding black currants for resistance to Sphaerotheca mors - uvae ( Schw. ) Berk / V. Trajkovski, R. Paasuke // Sweed. J. Agr. Res. - 1976. - 6. - 3. - P. 201-214.
