CC BY
54
УДК 618.19-006.66-085.277.3/849.19-092.9
ЭФФЕКТЫ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ С ПРЕПАРАТОМ РАДАХЛОРИНОМ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА МЫШАХ С ПЕРЕВИТОЙ АДЕНОКАРЦИНОМОЙ ЭРЛИХА
Э.Н. Бикбов, В.А. Привалов, ЕЛ. Куренное ЧГМА, г. Челябинск
На основании данных, полученных в эксперименте на лабораторных мышах с перевитой опухолью Эрлиха, оценены клинические эффекты фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором радахлорином. Целью исследования явилось создание экспериментальной модели злокачественной опухоли на мышах, проведение фотодинамической терапии опухоли и оценка эффективности данного лечения. Критериями оценки послужили следующие показатели: боль (беспокойство животных), бледность, цианоз, отек и развитие некроза. На основании эксперимента авторы пришли к выводам: аденокарцинома Эрлиха является хорошей моделью злокачественной опухоли, в эксперименте оценены эффекты фотодинамической терапии с препаратом радахлорином с перспективой оценки эффективности на морфологическом и тканевом уровне, что и планируется авторами в будущем.
Ключевые слова: фотодинамическая терапия, экспериментальная опухоль, фотосенсибилизатор, радахлорин.
Введение. Фотодинамическая терапия (ФДТ) -принципиально новый метод лечения злокачественных новообразований, основанный на использовании фотодинамического повреждения опухолевых клеток в ходе фотохимических реакций. ФДТ - двухкомпонентный метод лечения. Одним компонентом является фотосенсибилизатор (ФС), избирательно накапливающийся в опухоли и задерживающийся в ней дольше, чем в нормальных тканях. Другим компонентом ФДТ является световое воздействие. При локальном облучении опухоли светом определенной длины волны, соответствующей пику поглощения ФС, в опухоли начинается фотохимическая реакция с образованием синглетного кислорода и кислородных свободных радикалов, оказывающих токсическое воздействие на опухолевые клетки. Опухоль резорбируется и постепенно замешается соединительной тканью.
Фотодинамическая терапия как метод противоопухолевой терапии прочно завоевал свою нишу в арсенале онкологов, а при некоторых патологиях, таких как базально-клеточный рак кожи, он является методом выбора.
В настоящее время перспективными фотосенсибилизаторами считаются производные хлорина Е-6 [2,4].
Несмотря на большое количество экспериментальных данных, посвященных различным аспектам фотодинамического воздействия на биологические объекты, механизмы этого воздействия на различных уровнях - молекулярном, клеточном, тканевом - остаются неясными. В частности весьма противоречивы данные о первичных ми-
шенях фотодинамического поражения при использовании различных фотосенсибилизаторов.
Существует несколько теорий, объясняющих механизм повреждающего действия ФДТ. Наибольший интерес представляют следующие из них:
1. Воздействие активных форм кислорода, образующихся в результате фотохимических реакций в тканях, на структуры клетки ведет к ее гибели.
2. Точкой приложения ФДТ является эндотелий сосудов опухоли, в результате чего происходит его повреждение, а также спазм и тромбоз кровеносных сосудов в микроциркуляторном русле опухоли.
В качестве первичного объекта поражения на тканевом уровне многие авторы [3, 5] считают эндотелий сосудов. Клиницисты придают этому факту большое значение, справедливо полагая, что возникающий стаз, а затем тромбоз как первичная сосудистая реакция при фотодинамической терапии могут препятствовать развитию метастатического процесса, являющегося реальной угрозой при любом лечебном воздействии на опухоль [1,2].
Какие же процессы происходят на тканевом уровне в опухоли при ФДТ? Этот вопрос остается открытым. Были исследованы в экспериментах процессы фармакодинамики и фармакокинетики различных фотосенсибилизаторов, селективность и скорость их накопления в опухоли по сравнению со здоровой тканью, клинические эффекты в зависимости от дозы и времени экспозиции ФС и светового излучения и т.д. Однако, несмотря на явный клинический эффект, механизмы развития некроза опухоли после ФДТ не изучены.
Проблемы здравоохранения
Актуальным и по сей день остается вопрос патоморфологических изменений, происходящих в опухолевой ткани под действием ФДТ. Ответ на этот вопрос позволит понять механизмы фотоди-намического повреждения опухоли с современным фотосенсебилизатором хлоринового ряда радахлорином.
Цели и задачи планируемого исследования
Целью настоящего исследования явилось определение клинической эффективности ФДТ с фотосенсебилизатором радахлорином в эксперименте на животных с привитой опухолью.
Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:
1. Воспроизвести экспериментальную модель опухоли у мышей путем прививки штамма аденокарциномы молочной железы Эрлиха.
2. Провести фотодинамическую терапию с фотосенсебилизатором радахлорином на экспериментальных животных с привитой опухолью.
3. Провести анализ клинических эффектов ФДТ у экспериментальных животных с привитой опухолью как первый этап исследования эффектов ФДТ.
Материалы и методы. Работа выполнена на базе центральной научно-исследовательской лаборатории ЧГМА. В работе использовались фотосенсибилизатор радахлорин и лазерный диодный модуль «МЬ662-8Р».
Радахлорин содержит композицию из трех циклических тетрапирролов хлориновой природы (с гидрированным кольцом), основным из которых (80-90 %) является хлорин е6. В работе (использовалась лекарственная форма - 0,35 %-ный раствор радахлорина для внутривенного введения. Данный препарат запатентован и производится ООО «РА-ДА-ФАРМА» (Москва, Россия).
В качестве источника света для ФДТ использовался лазерный диодный модуль «МЬ662-8Р» с излучением на длине волны 662 нм. Перед облучением всем животным проводилась депиляция кожи в зоне засветки методом выщипывания.
В работе использовались беспородные лабораторные мыши весом 20-25 г. Материал для подкожной прививки опухоли получали от мышей после внутрибрюшинного введения штамма аденокарциномы молочной железы Эрлиха. Спустя 10 дней у данных особей («доноров опухоли») развивался канцероматоз брюшины с накоплением в брюшной полости асцитической жидкости, которая и служила источником опухолевых клеток для воспроизведения подкожной опухоли у мышей. Размер опухоли варьировал на момент ФДТ (10 дней с момента перевивки) от 1 до 1,5 см. В эксперимент включены 24 мыши, которые распределены по 4 группам.
В основную группу включены 9 мышей, которым проведено лечение перевитой опухоли Эрлиха методом ФДТ. После внутрибрюшинного введения радахлорина в дозе 40 мг/кг веса через 2
часа проводили облучение опухоли лазером длиной волны 662 нм со световой дозой 200 Дж/см2.
В первую контрольную группу включены 6 мышей, которым радахлорин вводился в тех же дозах, что и в первой группе, но облучение не проводилось; во вторую контрольную группу - 6 мышей, ФС не вводился, а облучение проводилось в точности, как в первой группе. Три мыши составили третью контрольную группу - «интактная опухоль». Все животные содержались в одинаковых условиях вивария.
Проведение ФДТ не требовало наркотизации животного, облучение проводилось дистанционно лазером красного диапазона с длиной волны 662 нм и продолжалось, в зависимости от размеров опухоли, в течение 1,5-2,5 минут с мощностью излучения лазера 1 Вт, общей световой дозой 200 Дж/см2. Зона лазерного облучения захватывала всю опухоль и часть окружающей ткани по периметру опухоли шириной до 0,5 см.
Результаты собственных исследований. На 10-е сутки после подкожной перевивки у мышей развилась плотная подвижная опухоль до 1-1,5 см в диаметре, которая морфологически соответствовала штамму аденокарциномы Эрлиха.
Нами анализированы клинические изменения в ходе ФДТ у мышей. Уже во время процедуры лазерного облучения в ходе ФДТ с радахлорином начиналась фотохимическая реакция, которая характеризовалась беспокойством животных, о чем свидетельствует появление локальных болей.
При анализе результатов ФДТ злокачественных опухолей учитывали наличие следующих местных клинических симптомов, возникших как во время самой процедуры, так и после ФДТ: боль (беспокойство животных), отек, бледность, цианоз и постепенное развитие некроза опухоли в зоне облучения. Динамика клинических симптомов, возникших в результате ФДТ с радахлорином, изучена у 9 мышей.
Болевой синдром оценивали по беспокойству животных. В связи с чем у 2 мышей (22,2 %) во время процедуры приходилось приостанавливать облучение на несколько секунд.
У большей части мышей отек развивался спустя несколько часов после ФДТ, у 6 мышей (66,7 %) начало его отмечено в первые 1-2 часа с постепенным достижением максимума к концу 1-х -началу 2-х суток. У остальных 3 мышей (33,3 %) отек развивался спустя 3-4 часа. К концу 2-х суток он был наиболее выражен.
Объективно измерить и оценить отек, развивающийся после ФДТ, было трудно. Поэтому о выраженности отека мы судили субъективно. Наиболее сильный перифокальный отек после ФДТ отмечен у 4 животных (44,4 %) (рис. 1). Слабо выраженный отек (в зоне «засветки» опухоли выходящий за ее пределы не более чем на 1,0 см) после ФДТ отмечен у 5 мышей (55,5 %).
Независимо от степени выраженности отек
полностью разрешился спустя 3 суток после ФДТ у 2 мышей (22,2 %), через 4-5 суток у 4 мышей (44,5 %), через 6-7 суток у 3 мышей (33,3 %).
Таким образом, степень выраженности отека зависела от локализации, размеров опухоли и индивидуальных особенностей.
Рис. 1. Перифокальный отек в зоне опухоли (2 суток после ФДТ)
В конце сеанса ФДТ поверхность опухоли, как правило, становилась бледной (анемичной), за счет нарушения кровообращения вследствие тромбообразования в сосудах опухоли, подвергнутой ФДТ.
Через 2-3 часа после лазерного облучения бледная окраска опухоли сменялась цианозом. У 6 мышей (66,6 %) отмечен выраженный цианоз поверхности опухоли через 1-2 часа после ФДТ. У 3 мышей (33,3 %) цианоз развился значительно позже, спустя 4-5 часов после облучения, и был слабо выраженным. Таким образом, бледность и развитие цианоза облученной опухоли отмечены у всех мышей.
Как правило, спустя 3-4 часа после ФДТ, на облученной лазером поверхности опухоли появлялись участки темного цвета, которые увеличивались в размерах, сливались между собой и зона «засветки» приобретала фиолетовый или черный цвет, что было связано с формированием геморрагического некроза. У 2 мышей после ФДТ отмече-
но появление обильной лимфореи с поверхности опухоли.
После ФДТ наиболее выраженная фотохимическая реакция отмечалась в самой опухоли (в конечном счете в виде некроза), неизменные окружающие ткани по периферии опухоли в зоне «засветки» также реагировали умеренным отеком, изменением цвета кожи (по типу гиперемии), но, как правило, даже при увеличении световой дозы до 400 Дж/см2, реакция окружающих тканей была менее выраженной, чем в опухоли, обратимой, по типу ожога I ст. При этом не происходило формирования некрозов.
Через 7-14 дней локальные изменения отмечались только в облученной опухоли, представляя собой плотный струп черного цвета с четкой демаркационной линией между окружающей кожей и некротизированной тканью новообразования. Окружающие ткани полностью восстанавливали свой первоначальный вид (рис. 2).
После проведения ФДТ и образования некроза заживление ран происходило под струпом. Сроки отторжения некроза и эпителизации зависели от размеров поля облучения и распространенности очага.
Начало краевой эпителизации под струпом, как правило, отмечалось на 3-4 неделе. Отторжение некроза у всех животных отмечено на 5-6 неделе с последующим формированием рубца (рис. 3).
Таким образом, в результате ФДТ с радахло-рином во всех случаях отмечено развитие местной фотохимической реакции, включающей болевой синдром, перифокальный отек с последующей бледностью, цианозом поверхности опухоли с переходом в некроз. Отек купировался через 3-4 суток после облучения самостоятельно. К концу первой недели после процедуры ФДТ на поверхности опухоли (кожи) формировался сухой коагуляционный некроз. При этом локальные изменения были отмечены только в облучаемой зоне, окружающие ткани полностью восстанавливали свой первоначальный вид. Сроки отторжения некроза зависели от размеров поля облучения, чаще всего составляя 5-8 недель. После отторжения
Проблемы здравоохранения
Количество экспериментальных животных, погибших в п-е сутки
Сроки гибели животных от генерализации процесса Контрольная группа после введения радахлорина п = 6 Контрольная группа после облучения лазером п = 6 Контрольная группа (интактная опухоль) п = 3
9 сутки - 1 —
10 сутки - - 1
12 сутки - 1 -
14 сутки 3 2 1
15 сутки 2 1 1
18 сутки - 1 -
22 сутки 1 - -
некротизированной ткани поверхностных опухолей во всех случаях формировался рубец.
Перечисленные клинические проявления не наблюдались ни в одной из контрольных групп, мыши во 2-й контрольной группе легко перенесли лазерное облучение, а введение радахлорина в 1-й контрольной группе не сопровождалось какими-либо побочными явлениями. Кроме того, ни одно животное из контрольных групп с опухолью не дожило до 28-дневной отметки эксперимента, все они погибли от генерализации процесса в разные сроки (см. таблицу), максимальная выживаемость - 22 суток со дня эксперимента и 32 дня с момента перевивки опухоли. То же самое наблюдалось в контрольной группе - «интактная опухоль». У жи-
вотных всех трех контрольных групп рост опухоли прогрессировал, на 10-15-е сутки развивался односторонний, а затем двусторонний паралич задних лап (рис. 4).
Выживаемость животных основной группы в сроки «свыше 28 суток» составила 100 %, и она более чем два раза (44 дня) превысила сроки выживаемости по сравнению с контрольными животными.
При заборе материала у контрольных животных наблюдалась картина прогрессирования и прорастания опухоли в позвоночник (рис. 5) (подтверждено морфологически), чем и объясняется наблюдаемая нами неврологическая картина (см. рис. 4) и гибель животных в указанные сроки.
При гистологическом исследовании в основной группе после ФДТ в зоне облучения опухоли формировались очаги некроза, которые прогрессировали. В окружающей ткани по периферии наблюдались очаги кровоизлияния и полнокровия сосудов с формированием геморрагического венчика.
Таким образом, аденокарцинома Эрлиха является хорошо воспроизводимой экспериментальной моделью злокачественной опухоли у мышей и может быть использована для оценки эффективности ФДТ на клеточном и тканевом уровне в эксперименте с морфологическим и электронно-микроскопическим исследованием, что и планируется на 2-м этапе работы.
Литература
1. Бойко В.В. Экспериментальная и клиническая апробация метода фотодинамической терапии опухолей / В.В. Бойко, Л.А. Бойко // Экспериментальная онкология. -2000.- Т. 22. - С. 351-352.
2. Каплан, М.А. Фотодинамическая терапия: Обзор /М.А. Каплан, Ю.С. Романко // Физиотерапия, бальнеология и реабилитация. - 2004. -№ 1. - С. 43-48.
3. Коган, Е.А Морфо- и патогенез повреждений злокачественных опухолей при фотодинамической терапии / Е.А. Коган, А.А. Невольских, Н.Н. Жаркова и др. //Архив патологии. - 1993. -№6.- С. 73-76.
4. Решетников, А.В. Оценка биологических свойств новых фотосенсибилизаторов хлориново-го ряда / А.В. Решетников, А.В. Иванов, О.Ю. Абакумова и др. / Использование лазеров для диагностики и лечения заболеваний // Научно-информационный сборник. -2001. - Вып. 3. - С. 34-40.
5. Странадко, Е.Ф. Механизм действия фотодинамической терапии /Е.Ф. Странадко //Российский онкологический оюурнал. — 2000. - № 4. -С. 52-56.
Поступила в редакцию 11 декабря 2008 г.
