CC BY
137
9. Сорокин О.Д. Прикладная статистика на компьютере. — Краснообск: ГУП РПО СО РАСХН, 2009. — 222 с.
References
1. Chulkina V.A., Toropova E.Yu., Ste-tsov G.Ya. Ekologicheskie osnovy integrirovan-noi zashchity rastenii / Pod red. M.S. Sokolova i V.A. Chulkinoi. — M.: Kolos, 2007. — 568 s.
2. Kryukova E.A., Malanina Z.I., Kolmuki-di S.V. Rol' sornoi travyanistoi i drevesno-kustarnokovoi rastitel'nosti v infektsionnykh protsessakh agrarnykh i agrolesnykh landshaftov // Zashchita i karantin rastenii. — 2011. — № 4. — S. 20-23.
3. Toropova E.Yu., Zakharov A.F., Se-lyuk M.P. Vredonosnost' i rasprostranennost' zlakovykh sornyakov v posevakh yarovoi pshe-nitsy v Novosibirskoi oblasti // Agrotekhni-cheskii metod zashchity rastenii ot vrednykh organizmov. Mater. V Mezhdunar. nauchn.-prakt. konf. 13-16 iyunya 2011 g. Kubanskii GAU. — Krasnodar, 2011. — S. 238-241.
4. Blackshaw R.E. Tillage intensity affects weed communities in agroecosystems // Invasive Plants: Ecological and Agricultural Aspects.
— Switzerland: Burkhauser Verlag, 2005. — P. 209-221.
5. Toropova E.Yu., Kazakova O.A., Vo-rob'eva I.G., Selyuk M.P. Fuzarioznye kornevye gnili zernovykh kul'tur v Zapadnoi Sibiri i Zau-ral'e // Zashchita i karantin rastenii. — № 9. — 2013. — S. 23-26.
6. Schroeder K.L., Paulitz T.C. Root Diseases of Wheat and Barley During the Transition from Conventional Tillage to Direct Seeding // Plant Disease. — September, 2006. — P.1247-1253.
7. Pridannikova E.B., Toropova E.Yu. Rol' sornykh rastenii kak rezervatorov vozbuditelei kornevykh gnilei // Nasledie N.I. Vavilova v razvitii biologicheskikh i sel'skokhozyaistvennykh nauk: Mater. mezhdunar. nauch.-praktich. konf.
— Kurgan, 2012. — S. 220-223.
8. Chulkina V.A., Toropova E.Yu., Stetsov G.Ya. Integrirovannaya zashchita rastenii: fitosa-nitarnye sistemy i tekhnologii / Pod red. M.S. Sokolova i V.A. Chulkinoi. — M.: Kolos, 2009. — 670 s.
9. Sorokin O.D. Prikladnaya statistika na komp'yutere. — Krasnoobsk, GUP RPO SO RASKhN, 2009. — 222 s.
+ + +
УДК 631.847.211:633.34
Д.В. Крутило
D.V. Krutilo
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ШТАММОВ BRADYRHIZOBIUM JAPONCUM НА ФОНЕ МЕСТНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ РИЗОБИЙ СОИ
EFFECTIVENESS OF BRADYRHIZOBIUM JAPONCUM STRAINS AGAINST THE BACKGROUND OF LOCAL POPULATIONS OF SOYBEAN RHIZOBIA
Ключевые слова: B. japonicum 46, B. japo-nicum М8, биопрепарат, клубеньковые бактерии, конкурентоспособность, эффективный штамм, Ризобофит, соя.
Важную роль в формировании высоких урожаев сои играют специфические клубеньковые бактерии, вступающие в симбиоз с растением. Представлены результаты исследований по применению активных штаммов Bradyrhizobium japonicum для инокуляции сои на фоне местных популяций ризобий сои. Объектами исследования служили штаммы B. japonicum 46 и B. japonicum М8, антисыворотки 46, М8, 634б и КВ11, а также растения сои сорта Устя. Симбиотические свойства и конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои изучали в вегетационных и полевом опытах на фоне различных популяций специфических ризобий. Нами изучены особенности взаимодействия активных штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8 с соей на фоне местных
популяций специфических ризобий. Показано, что абсолютное доминирование в клубеньках интро-дуцируемого штамма не всегда имеет принципиальное значение для увеличения урожайности. На фоне почвенных популяций клубеньковых бактерий наиболее эффективные симбиотические системы сои формируются не с одним, а с несколькими комплементарными, хотя и серологически отличными штаммами ризобий одного вида. Установлено, что наиболее активным симбиотическим азотфиксатором является штамм B. japonicum 46. Как биоагент препарата «Ризобофит» этот штамм способен выдерживать конкуренцию с представителями моно- и полиштаммовых популяций местных ризобий сои, обеспечивая стабильное увеличение надземной массы растений на 12,9-18,5% и повышение урожая зерна — на 17,0% относительно контроля. На штамм B. japonicum 46 получен патент Украины, который предложено использовать в производстве биопрепаратов для повышения урожайности сои.
Keywords: B. japonicum 46, B. japonicum M8, biological fertilizer, nodule bacteria, competitiveness, efficient strain, Rizobofit, soybean.
Specific nodule bacteria that establish a symbiotic relationship with plants play a significant role in achieving high soybeans yields. The paper presents the results of investigations concerning the application of Bradyrhizobium japonicum active strains for soybean inoculation against the background of local populations of soybean rhizobia. The following was investigated: B. japonicum strains 46 and M8; antisera 46, M8, 634b and KV11; and soybean plants of Ustya variety. Symbiotic properties and competitive ability of strains of soybean nodule bacteria were studied under the conditions of greenhouse and field trials within different populations of specific rhizobia. We studied the peculiarities of interaction of B. japonicum active strains 46 and B. japonicum
active strains M8 with soybeans against the background of local populations of specific rhizobia. It is shown that the absolute domination of introduced strain in nodules is not always crucial for increasing crop yields. Against the background of soil populations of nodule bacteria the most effective symbiotic soybean systems are formed not by one, but by several complementary parts although serologically different rhizobia strains of one species. It is found that the B. japonicum 46 is the most active symbiotic nitrogen fixer. As a biological agent of Rizobofit this strain is able to stand competition with mono-and multi-strain local populations of soybean rhizobia and to provide constant increase of above-ground plant herbage by 12.9%-18.5% and bean harvest by 17.0% as compared to the control. A patent of Ukraine for B. japonicum 46 was obtained and it is proposed to be used in the production of biological fertilizers to increase soybean yields.
Крутило Дмитрий Валериевич - к.б.н., с.н.с., зав. сектором биологического азота, лаб. растительно-микробных взаимодействий, Институт сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН Украины, г. Чернигов, Украина. Тел. 067-359-3515. E-mail: krutilod@mail.ru.
Krutilo Dmitriy Valeriyevich, Cand. Agr. Sci., Senior Staff Scientist, Lab. of Plant-Microbial Interactions, Institute of Agricultural Microbiology and Agricultural Industry Production of Natl. Acad. of Agr. Sci., Chernigov, Ukraine. Ph.: 067-359-3515. E-mail: kruti-lod@mail.ru.
\
Введение
На сегодняшний день самой распространенной зернобобовой культурой мирового земледелия является соя (Glycine max (L.) Merr.). Важную роль в формировании высоких урожаев этой культуры играют клубеньковые бактерии (ризобии), вступающие в симбиоз с растением и обеспечивающие его биологическим азотом [1]. В современных технологиях выращивания сои широко используются биопрепараты на основе высокоэффективных штаммов специфических ризо-бий. Одним из таких биопрепаратов, предназначенных для повышения урожайности сои, является разработанный в Украине препарат «Ризобофит» (ТУ У 319.00494456-006:2002).
Известно, что обработка семян бобовых культур микробными препаратами способствует формированию в почвах местных популяций клубеньковых бактерий. Однако представители этих популяций, утратив способность к азотфиксации, могут выступать одним из лимитирующих факторов эффективного применения биопрепаратов [2, 3]. Встречающиеся в литературе данные по изучению эффективности инокуляции бобовых растений на фоне почвенных популяций ри-зобий достаточно противоречивы.
Учитывая вышесказанное, цель наших исследований — изучить особенности взаимодействия активных штаммов Bradyrhizobium japonicum с соей на фоне местных популяций специфических ризобий.
Объекты и методы исследований
Объекты исследования: штаммы
В. japonicum 46, В. japonicum М8; антисыворотки к штаммам В. japonicum 46, М8, 634б и КВ11, а также растения сои сорта Устя. Исследуемые штаммы хранятся в Коллекции полезных почвенных микроорганизмов Института сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН (ИСМАП НААН, Украина, г. Чернигов).
Симбиотические свойства штаммов клубеньковых бактерий сои изучали в вегетационных и полевом опытах на фоне моно- и полиштаммовых популяций специфических ризобий. Вегетационные опыты проводили на дерново-подзолистой супесчаной почве. Семена обрабатывали ризобофитом (жидкая форма) на основе штаммов В. japonicum 46 и В. japonicum М8 из расчета 200-300 бактериальных клеток на 1 семя. Повторность опытов 5-8-кратная. Полевой опыт проводили на темно-серой почве опытного участка ИСМАП НААН. Повторность опыта 4-кратная. Площадь учетной делянки — 6 м2. Размещение делянок рендомизированное.
Конкурентоспособность штаммов (отношение количества образованных штаммом клубеньков к общему количеству клубеньков, выраженное в процентах) определяли в реакции агглютинации методом Груббера-Видаля [4]. В качестве антигена использовали гомогенаты клубеньков (50 шт. из каждого варианта). Поликлональные О-антисыворотки к штаммам ризобий сои получали по методике ВНИИСХМ в нашей модификации [5].
Активность азотфиксации определяли ацетиленовым методом на газовом хроматографе С^от-4. Математическую обработку данных осуществляли по методике Б.О. Доспехова [6], а также использовали программу Statistica 7.0.
Результаты и их обсуждение
В вегетационном опыте изучали эффективность биопрепарата «Ризобофит» на основе активных штаммов В. japonicum 46 и В. japonicum М8. Опыт проводили на дерново-подзолистой почве, отобранной через год после выращивания сои, инокулированной стандартным штаммом В. japonicum 634б.
Анализ полученных данных свидетельствует, что на корнях контрольных растений (без инокуляции) сформировалось значительное количество клубеньков (32 шт/раст.) (табл. 1). Серологический анализ гомогена-тов этих клубеньков показал, что все они образованы одним, ранее интродуцированным в почву, штаммом В. japonicum 634б (рис. 1).
Обработка семян сои Ризобофитом способствовала увеличению количества клубеньков в 1,2-1,5 раза. Максимальным этот показатель был в варианте с инокуляцией штаммом В. japonicum 46 (48 шт/раст.). Сероло-
гическая идентификация клубеньков показала, что на фоне моноштаммовой почвенной популяции ризобий сои наиболее конкурентоспособным оказался штамм В. japonicum 46. Он обнаружен в 79,2% клубеньков, тогда как штамм В. japonicum М8 выявлен в 62,5% клубеньков (рис. 1). Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что при инокуляции сои активными штаммами наблюдаются существенные изменения в «клубеньковой» популяции ризобий. В результате этих изменений снижается количество клубеньков, образованных местными ризобиями, а ин-тродуцированные штаммы занимают доминирующее положение, что служит критерием их высокой конкурентоспособности.
В вариантах с инокуляцией также отмечено существенное увеличение массы клубеньков (в 1,2-1,3 раза) и их нитрогеназной активности (в 1,2-2,0 раза) относительно контроля. Сравнительный анализ всех симбиоти-ческих показателей показал, что наиболее активным симбионтом сои на фоне моно-штаммовой популяции местных ризобий оказался штамм В. japonicum 46. В этом варианте отмечено достоверное увеличение продуктивности растений на 18,5% в сравнении с контролем и на 3,7% в сравнении со штаммом В. japonicum М8.
Таблица 1
Влияние инокуляции семян биопрепаратом «Ризобофит» на симбиотические показатели сои сорта Устя (вегетационный опыт)
Варианты опыта Количество клубеньков, шт/раст. Масса клубеньков, г/раст. Активность азотфиксации, мкг ^/раст/ч Содержание сухого вещества в надземной массе растений, г/раст.
Без инокуляции (контроль) 32,00 0,22 3,65 1,19
Ризобофит (В. japonicum М8) 37,07 0,27 4,51 1,36
Ризобофит (В. japonicum 46) 48,07 0,29 7,23 1,41
НСР05 4,02 0,02 0,61 0,05
Без инокуляции (контроль)
Ризобофит (В. japonicum М8)
Ризобофит (В. japonicum 46)
Рис. 1. Конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои — биоагентов препарата «Ризобофит» (вегетационный опыт)
Следующим этапом наших исследований было оценить эффективность штаммов В. japonicum 46 и В. japonicum М8 на фоне многочисленной популяции микросимбионтов сои, присутствующей в почве. Эта популяция была сформирована при периодическом (в течение 10 лет) выращивании сои, инокули-рованной различными штаммами.
Анализ в реакции агглютинации гомогена-тов клубеньков контрольного варианта показал, что местная популяция ризобий сои представлена бактериями, относящимися к серогруппам 46, М8 и КВ11 в соотношении 14,6; 2,1 и 68,7% соответственно (рис. 2). Кроме того, в почве выявлены ризобии, не реагирующие с использованными антисыворотками, которые отнесены к серогруппе Х (14,6%).
На фоне такой полиштаммовой популяции клубеньковых бактерий инокуляция сои Ризо-бофитом способствовала увеличению количества клубеньков на 26,3-27,6% в сравнении с контролем (табл. 2). Причем штаммы-инокулянты существенно влияли на процесс инфицирования растений местными ризобия-ми (рис. 2). Так, при обработке сои штаммами В. japonicum 46 и В. japonicum М8 число клубеньков, образованных доминирующими в почве бактериями серогруппы КВ11, уменьшалось с 68,7% в контроле до 42,256,3% в вариантах с инокуляцией. Следует
отметить, что штамм В. japonicum 46 оказался более конкурентоспособным и при наличии в почве многочисленной популяции местных ризобий, формируя значительное количество клубеньков (42,2%). Штамм В. japonicum М8 обнаружен только в 22,9% клубеньков.
Кроме того, использование штамма В. japonicum 46 способствовало достоверному увеличению массы клубеньков (с 0,30 в контроле до 0,36 г/раст. в варианте с инокуляцией).
Проведенные исследования показали, что в вариантах с инокуляцией сои ризобофитом уровень азотфиксирующей активности был выше в 1,2-1,4 раза, чем в контроле (табл. 2). Лучшим азотфиксатором оказался штамм В. japonicum 46. Количество фиксированного азота при инокуляции этим штаммом составило 42,38 мкг N/раст/ч.
Как результат эффективного взаимодействия исследуемых штаммов с растением в вариантах с инокуляцией отмечено увеличение надземной массы сои на 8,6-12,9% по сравнению с контролем (табл. 2). Максимальным этот показатель (1,58 г/раст.) был при инокуляции сои штаммом В. japonicum 46, более низким (1,52 г/раст.) — при использовании штамма В. japonicum М8.
Без инокуляции (контроль)
Ризобофит (В. japonicum М8)
Ризобофит (В. japonicum 46)
Рис. 2. Конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои — биоагентов препарата «Ризобофит» (вегетационный опыт)
Влияние инокуляции семян биопрепаратом «Ризобофит» на симбиотические показатели сои сорта Устя (вегетационный опыт)
Таблица 2
Варианты опыта Количество клубеньков, шт/раст. Масса клубеньков, г/раст. Активность азотфиксации, мкг Ы2/раст/ч Содержание сухого вещества в надземной массе растений, г/раст.
Без инокуляции (контроль) 36,79 0,30 30,68 1,40
Ризобофит (В. japonicum М8) 46,96 0,32 36,42 1,52
Ризобофит (В. japonicum 46) 46,46 0,36 42,38 1,58
НСР05 3,43 0,03 3,33 0,06
Анализ результатов серологического исследования клубеньков и данных по продуктивности растений позволяет предположить, что абсолютное доминирование в клубеньках интродуцируемого штамма не всегда имеет принципиальное значение для увеличения урожайности. Возможно, что штамм-ино-кулянт не только сам активно инфицирует растение, но и является своеобразным активатором местной популяции клубеньковых бактерий, что способствует формированию эффективной симбиотической системы сои с несколькими комплементарными, хотя и серологически отличными штаммами ризобий одного вида.
Следующим этапом нашей работы было изучить конкурентоспособность и симбиоти-ческие свойства штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8 в полевых условиях.
В течение вегетационного периода на корнях контрольных растений количество клубеньков не превышало 2-3 шт/раст., что свидетельствует о наличии в почве немногочисленной популяции ризобий сои (табл. 3). Серологический анализ гомогенатов клубеньков показал, что они образованы клубеньковыми бактериями сои, относящимися к одной серогруппе М8 (рис. 3).
На фоне моноштаммовой почвенной популяции штаммы B. japonicum 46 и B. japoni-cum М8 способствовали значительному увеличению количества клубеньков в сравнении с вариантом без инокуляции (табл. 3). Оба штамма формировали одинаковое количество клубеньков с одинаковой массой.
Установлено, что интродукция штамма B. japonicum 46 заметно влияет на процесс формирования клубеньков местными ризо-биями (табл. 3). В этом варианте отмечено существенное уменьшение (до 14,6 %) количества клубеньков, образованных штаммом B. japonicum М8, сапрофитно существующим в почве. То есть при наличии в почве немногочисленной популяции ризобий сои интроду-цированный штамм доминировал в клубеньках (85,4%), что подтверждает его способность конкурировать с местными клубеньковыми бактериями.
Показано, что во всех вариантах с инокуляцией активность азотфиксации была значительно выше (в 1,7-2,5 раза) в сравнении с контролем. Максимальный уровень азотфик-сирующей активности наблюдался в варианте с применением ризобофита на основе штамма B. japonicum 46 (10,65 мкг N/раст/ч).
Влияние инокуляции семян биопрепаратом «Ризобофит» на симбиотические показатели сои сорта Устя (полевой опыт, 2013 г.)
Таблица 3
Варианты опыта Количество клубеньков, шт/раст. Масса клубеньков, г/раст. Активность азотфиксации, мкг Ы2/раст/ч
Фаза роста
цветение налив бобов цветение налив бобов цветение налив бобов
Без инокуляции (контроль) 1,58 2,75 0,05 0,15 1,09 4,34
Ризобофит (B. japonicum М8) 5,42 9,50 0,12 0,25 6,04 7,44
Ризобофит (B. japonicum 46) 5,33 9,33 0,14 0,25 5,26 10,65
НСР05 1,12 2,20 Fm < F05 0,07 1,46 2,26
MS
100° о
□MS
Без инокуляции (контроль)
MS
100° о
□MS
Ризобофит (B. japonicum М8)
■46 QMS
Ризобофит (B. japonicum 46)
Рис. 3. Конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои — биоагентов препарата «Ризобофит» (полевой опыт, 2013 г.)
Таблица 4
Влияние инокуляции клубеньковыми бактериями на семенную продуктивность сои сорта Устя (полевой опыт, 2013 г.)
Варианты опыта Урожайность, т/га Прирост урожая, %
Без инокуляции (контроль) 2,23 100,0
Ризобофит (B. japonicum М8) 2,53 13,4
Ризобофит (B. japonicum 46) 2,61 17,0
НСР05 0,16
При инокуляции семян сои активными штаммами клубеньковых бактерий урожайность культуры увеличивалась на 13,4-17,0% (табл. 4). Следует отметить, что, несмотря на наличие в почве местных клубеньковых бактерий серогруппы М8, интродукция активного штамма этой же серогруппы (B. japonicum М8) способствовала формированию более активной симбиотической системы и существенному увеличению урожайности сои. Максимальный прирост урожая к контролю (17,0%) получен при использовании высокоэффективного штамма B. japonicum 46. На этот штамм получен патент Украины на изобретение [7].
Выводы
Таким образом, нами изучены симбиотические свойства штаммов B. japonicum 46 и
B. japonicum М8 как биоагентов препарата «Ризобофит». Показано, что абсолютное доминирование в клубеньках интродуцируемого штамма не всегда имеет принципиальное значение для увеличения урожайности. На фоне почвенных популяций клубеньковых бактерий наиболее эффективные симбиоти-ческие системы сои формируются не с одним, а с несколькими комплементарными, хотя и серологически отличными штаммами ризобий одного вида.
Установлено, что наиболее активным сим-биотическим азотфиксатором является штамм B. japonicum 46. Он способен выдерживать конкуренцию с представителями моно- и полиштаммовых популяций местных ризобий сои, обеспечивая стабильное увеличение надземной массы растений на 12,918,5% и повышение урожая зерна — на 17,0% относительно контроля.
На штамм B. japonicum 46 получен патент Украины, который предложено использовать в производстве биопрепаратов для повышения урожайности сои.
Библиографический список
1. Бабич А.О. Сучасне виробництво i вико-ристання соУ. — КиУв: Урожай, 1993. — 432 с.
2. Толкачев Н.З. Потенциальные возможности симбиотической азотфиксации при выращивании сои на юге Украины // М^робюл. журн. — 1997. — Т. 59. — № 4. —
C. 34—41.
3. Патика В.П., Крутило Д.В., Ковалевсь-ка Т.М. Вплив аборигенних популя^й буль-
бочкових бактер^ соУ на симбютичну активысть Ытродукованого штаму
Bradyrhizobium japonicum 634б // М^робюл. журн. — 2004. — Т. 66. — № 3. — С. 14—21.
4. Кэбот Э., Мейер Б. Экспериментальная иммунология. — М.: Медицина, 1968. — 677 с.
5. Берестецкий О.А. Методические рекомендации по получению новых штаммов клубеньковых бактерий и оценке их эффективности. — Л., 1979. — 33 с.
6. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. — М.: Агропромиздат, 1985. — 352 с.
7. Штам бактер^ Bradyrhizobium japonicum для одержання бактерiального до-брива пщ сою: пат. 85943 УкраУни: МПК С 12 N 1/20, С 05 F 11/08 / Кова-левська Т.М., Надкернична О.В., Крутило Д.В., Горбань В.П.; заявник та патентов-ласник 1н-т с.-г. м^робюлопУ УААН. — № а 2007 07156; заявл. 25.06.07; опубл. 10.03.09, Бюл. № 5. — 4 с.
References
1. Babych A.O. Suchasne vyrobnyctvo i vy-korystannja soi'. — Kyi'v: Urozhaj, 1993. — 432 s.
2. Tolkachev N.Z. Potentsial'nye vozmozh-nosti simbioticheskoi azotfiksatsii pri vyrashchi-vanii soi na yuge Ukrainy // Mikrobiol. zhurn. — 1997. — T. 59. — № 4. — S. 34-41.
3. Patyka V.P., Krutylo D.V., Kovalevs'ka T.M. Vplyv aborygennyh populjacij bul'boch-kovyh bakterij soi' na symbiotychnu aktyvnist' introdukovanogo shtamu Bradyrhizobium japonicum 634b // Mikrobiol. zhurn. — 2004. — T. 66. — № 3. — S. 14-21.
4. Kebot E., Meier B. Eksperimental'naya immunologiya. — M.: Meditsina, 1968. — 677 s.
5. Berestetskii O.A. Metodicheskie reko-mendatsii po polucheniyu novykh shtammov kluben'kovykh bakterii i otsenke ikh effektivnos-ti. — L., 1979. — 33 s.
6. Dospekhov B.A. Metodika polevogo opy-ta. — M.: Agropromizdat, 1985. — 352 s.
7. Shtam bakterij Bradyrhizobium japonicum dlja oderzhannja bakterial'nogo dobryva pid soju: pat. 85943 Ukrai'ny: MPK S 12 N 1/20, S 05 F 11/08 / Kovalevs'ka T.M., Nadker-nychna O.V., Krutylo D.V., Gorban' V.P.; za-javnyk ta patentovlasnyk In-t s.-g. mikrobiologii' UAAN. — № a 2007 07156; zajavl. 25.06.07; opubl. 10.03.09, Bjul. № 5. — 4 s.
