CC BY
11
Turczaninowia 26, 2: 45-58 (2023) DOI: 10.14258/turczaninowia.26.2.3 http://turczaninowia.asu.ru
ШШ ISSN 1560-7259 (print edition)
M TURCZANINOWIA
¡¡j| ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 582.6/.9+57.574.3+575.2
Эффективность SCoT-маркеров для характеристики внутривидового генетического разнообразия Cyclamen ^um, Helleborus caucasicus, Galanthus woronowii, Paeonia caucasica
Р. М. Шхалахова1' 2*, В. И. Маляровская1' 3, Н. Г. Конинская1' 4
1 Федеральный исследовательский центр «Субтропический научный центр Российской академии наук», ул. Яна Фабрициуса, д. 2/28, г. Сочи, 354002, Россия
2E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0001-5262-7866
3E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0003-4213-8705
4E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-2126-5863
* Автор для переписки
Ключевые слова: генетическое разнообразие, полиморфизм, редкие и исчезающие виды, PCoA анализ, SCoT-маркеры.
Аннотация. Для создания стратегий сохранения редких и исчезающих растений важно изучить внутривидовое генетическое разнообразие каждого конкретного вида. Для выполнения этих задач необходимы эффективные маркерные системы. В данном исследовании оценивалась эффективность 36 SCoT-маркеров для характеристики внутривидового генетического разнообразия Cyclamen mum Mill., Helleborus caucasicus A. Brown, Galanthus woronowii Losinsk., Paeonia caucasica Schipcz., собранных из разных мест произрастания Сочинского национального парка. Отдельные маркеры, такие как SCoT16 (58,2 %), SCoT6 (50,3 %), SCoT7 (49,6 %), SCoT8 (48,1 %), SCoT30 (42,8 %), SCoT29 (41,1 %) и SCoT20 (39,3 %), показали высокий уровень полиморфизма, что свидетельствует о хорошей применимости этих маркеров для оценки внутривидового генетического разнообразия исследуемых видов природной флоры Западного Кавказа. Кроме того, результаты исследования важны для реализации мер по сохранению данных видов и борьбы с генетической эрозией.
SCoT markers efficiency for characterizing the intraspecific genetic diversity of Cyclamen coum, Helleborus caucasicus, Galanthus woronowii, Paeonia caucasica
R. M. Shkhalakhova, V. I. Malyarovskaya, N. G. Koninskaya
Federal Research Centre the Subtropical Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences, Jana Fabriciusa St., 2/28, Sochi, 354002, Russia Federation
Keywords: genetic diversity, intraspecific diversity, PCoA analysis, polymorphism, rare and endangered species, SCoT markers.
Summary. Creating strategies of rare and endangered plants conservation requires studying the intraspecific genetic diversity of each particular species. Thus, efficient marker systems are necessary for implementing these objectives. In this study, the efficiency of 36 SCoT markers were evaluated for characterizing the intraspecific genetic diversity of Cyclamen mum Mill., Helleborus caucasicus A. Brown, Galanthus woronowii Losinsk., Paeonia caucasica Schipcz. collected from different habitats of the Sochi National Park. Single markers, such as SCoT16 (58,2 %), SCoT6 (50,3 %),
Поступило в редакцию 12.01.2023 Принято к публикации 30.06.2023
Submitted 12.01.2023 Accepted 30.06.2023
SCoT7 (49,6 %), SC0T8 (48,1 %), SCoT30 (42,8 %), SCoT29 (41,1 %), and SCoT20 (39,3 %) showed high levels of polymorphism, indicating good applicability of these markers to assess the intraspecific genetic diversity of the studied of the Western Caucasus flora species. In addition, the results of the study are important for the implementing conservation measures for these species and combating genetic erosion.
Введение
На территории Западного Кавказа сосредоточено более 2200 растений, из которых 65 % относятся к редким видам, подлежащим охране на государственном и региональном уровнях (Astapov et al., 2017). Большое разнообразие реликтов в регионе обуславливается особенностями экотонного эффекта Колхидской, Восточно-Средиземноморской и Кавказской горно-луговой геоботанических провинций. Кроме того, горные экосистемы часто образуют самые разнообразные центры произрастания редких видов, в том числе и эндемичных (Rahbek et al., 2019; Fassou et al., 2020). Так, Сочинский национальный парк является мощным природоохранным центром на Кавказе, в настоящее время здесь под охраной находится более 400 видов растений (Timukhin, 2006). Особого внимания к сохранению требуют редкие виды растений, оказавшиеся под угрозой исчезновения. Несмотря на охранные меры, целый ряд угнетенных реликтов до недавнего времени оставался неучтенным в официальных списках Красных книг (Shumkova et al., 2019). Важнейшим этапом в организации мероприятий по сохранению редких и исчезающих видов является анализ генетического разнообразия внутри каждого конкретного вида, так как в основе его самоорганизации лежит внутривидовой генетический полиморфизм (Fassou et al., 2020). Однако данные о распределении генетического разнообразия внутри и между популяциями большинства редких и исчезающих видов растений недостаточны, вместе с этим они необходимы, например, при отборе наиболее дистантных особей для скрещивания и увеличения генетического разнообразия и адаптивного потенциала вида. Таким образом, анализ внутривидового разнообразия редких видов растений имеет большое значение, так как позволяет выявить частоты и распределение генетических полиморфизмов, что является необходимым условием для грамотной стратегии сохранения исчезающих видов (Kress, Erickson, 2012), в частности для таких видов, как Cyclamen wum Mill., Helleborus caucasicus A. Brown, Galanthus woronowii Losinsk., Paeonia caucasica Schipcz.
Цикламен кавказский (Cyclamen wum) относится к семейству первоцветные (Primulaceae), распространен на территориях средиземноморской флоры: от Болгарии до Северной Сирии и Ирана, в России произрастает на территории Краснодарского края, Республик Адыгеи и Крыма. В Краснодарском крае встречается в районах г. Сочи, г. Туапсе и г. Геленджик (Vahrusheva et al., 2009; Luchkina, 2010; Fomenko, Postarnak, 2011). Занесен в Красную книгу РФ (категория 3) и Краснодарского края (категория 2) (Litvinskaya, 2008; Timukhin, Tuniev, 2017). Из-за своего горного происхождения C. coum отличается высокой морозостойкостью, что делает его ценным источником генетического материала для селекционеров и производителей цикламенов в умеренной зоне (Prange et al., 2010). Cyclamen wum содержит сапонины (кумозиды, цикламинорин, деглюкоцикламин и др.) (Ishizaka et al., 2002), стерины (стигмастерол и др.), алкалоиды, фла-воноиды, фенолы, дубильные вещества, антоци-аны, терпены и гликозиды (Dall'Acqua et al., 2010; Altunkeyik et al., 2012; Öztürk, 2020). Наличие широкого спектра лекарственных метаболитов характеризует антиоксидантную, антибактериальную и противоопухолевую активность экстрактов С. wum (Bokov et al., 2020).
Зимовник кавказский (Helleborus caucasicus) -третичнореликтовый вид, относящийся к семейству Лютиковые (Ranunculaceae), летнезимнезе-леный травянистый корневищный полукарпик. Распространен на территории Средиземноморья, Кавказа, Азии. В РФ произрастает главным образом на территории всего Российского Кавказа. Краснодарский край является основным местом произрастания данного вида, здесь он распространен на территориях от г. Геленджика до г. Сочи. Занесен в Красную книгу Краснодарского края (категория 3) как вид, «находящийся в состоянии, близком к угрожающему» (Litvinskaya, 2017). Экстракты H. caucasicus обладают широким спектром биологической активности, в корнях и корневищах обнаружены гликозиды (буфадиенолиды и экдистероиды), биоциды, стероидные сапонины, гамма-лакто-ны. Гликозид корельборин P активно применялся при сердечной недостаточности, но производство этого препарата резко сократилось
из-за недостаточной сырьевой базы (Chukuridi, Bakalov, 2009). В ряде исследований отмечался цитотоксический эффект экстракта корней и корневищ H. caucasicus в отношении клеток рака легких и колоректального рака (Muzashvili et al., 2006; Bassarello et al., 2008; Martucciello et al., 2018).
Подснежник Воронова (Galanthus worono-wii) - спорадично распространенный эндемик Западного Кавказа из семейства Амариллисовые (Amaryllidaceae) (Mikheev, 2008; Timukhin, Tuniev, 2017). Встречается в северо-восточной части Турции, Грузии, Южной Осетии, Абхазии (Davis, 2006), в Краснодарском крае на Черноморском побережье от Туапсе до реки Псоу, в Республике Адыгея, в Ставропольском крае, близ г. Ессентуки. Внесен в Красные книги РФ (категория 2б) и Краснодарского края (категория 2) и рекомендован к охране на территории Большого Сочи (Mikheev, 2008; Timukhin, Tuniev, 2017; Malyarovskaya et al., 2018). G. woronowii - один из основных источников растительных алколоидов (Jin, 2013), галантамина, обладающего ацетил-холинэстеразной ингибирующей активностью (Howes, Perry, 2011; Sarikaya et al., 2013) и лико-рина (Bokov et al., 2017; Gen^ et al., 2019).
Пион кавказский (Paeonia caucasica) - травянистый реликтовый многолетник из семейства Paeoniaceae, численность которого резко сокращается из-за сбора и выкопки корневищ в коммерческих целях (Ukhova, Litvinskaya, 2019). Распространен на территории Юго-Западной Азии, Кавказе (Грузия), в России в Республиках Северного Кавказа, в Краснодарском крае от г. Анапы до г. Сочи и в Республике Адыгея. Занесен в Красные книги РФ (категория 3), Краснодарского края (категория 2) (Mikheev, 2008; Litvinskaya, 2017). Экстракты P. caucasica содержат терпенои-ды, фенологликозиды, флавоноиды, фенольные соединения (галловая кислота и пеонифлорин), иридоиды, дубильные вещества (Wu et al., 2010; Parker et al., 2016; Deng et al., 2018). В ряде стран применяется в качестве обезболивающего, противовоспалительного, иммуномодулирующего, антиоксидантного средства (Ivanova et al., 2002).
Согласно новым подходам молекулярной биологии эффективной платформой для анализа генетической вариабельности стали системы молекулярных маркеров. Одним из самых главных преимуществ ДНК-маркеров является то, что они не подвержены влиянию окружающей среды и не имеют плейотропных или эпистати-ческих эффектов (Fassou et al., 2020).
Существуют разные типы ДНК-маркеров, такие как AFLP, ISSR, RAPD, SRAP, SCoT и SSR, используемые для исследования генетического разнообразия различных видов растений (Martins et al., 2004; Hou et al., 2005; Arif et al., 2009; Son et al., 2012; Mukherjee et al., 2013; Simsek et al., 2017). Каждый тип маркера имеет свои преимущества и недостатки: низкая воспроизводимость RAPD, высокая стоимость AFLP и необходимость знать фланкирующие последовательности для SSR. Метод ISSR-PCR преодолевает большую часть этих ограничений, однако локализация в геноме продуктов амплификации, так же, как и функция, остаются неизвестными (Karimi et al., 2014). При этом лишь единичные публикации встречаются по перечисленным видам природной флоры. В ряде работ анализировали генетическое разнообразие некоторых видов рода Cyclamen L. с использованием RAPD и SRAP праймеров (Na-deri et al., 2009; Simsek et al., 2017), рода Helleborus L. с ISSR (Fassou et al., 2020), рода Paeonia L. (Yang et al., 2005; Lim et al., 2013), где отмечался высокий уровень полиморфизма. Также ранее была оптимизирована система SCoT-PCR для древовидных видов рода Paeonia L. (Hou et al., 2005). В других исследованиях оценивались генетическая стабильность коллекции in vitro Galanthus woronowii с помощью ISSR праймеров (Suprun et al., 2017) и внутривидовой полиморфизм нескольких видов Galanthus с RAPD праймерами, где идентифицировались единичные генетические отличия (Zubov et al., 2011).
Наряду с быстрым ростом исследований в области геномики наблюдается тенденция отхода от случайных ДНК-маркеров к маркерам, нацеленным на гены (Gupta, Rustgi, 2004; Gupta et al., 2019). Таковыми являются маркеры SCoT (start codon targeted), основанные на полиморфизме, направленном на стартовый кодон. Маркеры SCoT состоят из короткой консервативной области, фланкирующей стартовый кодон (ATG), который является консервативным для всех генов (Collard, Mackill, 2009). Данный метод набирает популярность благодаря своему превосходству над другими системами доминантных маркеров ДНК, такими как RAPD, AFLP или ISSR, в отношении более высокого полиморфизма и лучшей разрешаемости. Кроме того, из-за большей длины праймеров с более высокой температурой отжига SCoT являются более надежными и воспроизводимыми (Hou et al., 2011; Hajibarat et al., 2015; Satya et al., 2015; Etminan et al., 2016; Samarina et al., 2021).
В связи с этим целью исследований являлась оценка эффективности SCoT-маркеров для анализа внутривидового разнообразия редких и исчезающих видов Западного Кавказа Cyclamen mum, Helleborus caucasicus, Galanthus woronowii, Paeonia caucasica.
Материалы и методы
Растительный материал и экстракция ДНК. В данном исследовании был использован расти-
тельный материал четырех видов, произрастающих на территории Западного Кавказа, в частности, в окр. г. Сочи (рис. 1).
Образцы Cyclamen mum были взяты из двух природных популяций: первая популяция произрастала на скалистых породах (C1, C2), площадь составила около 100 м2, численность на 1 м2 - 2-3 особи; вторая - в лесной тенистой местности (C3, C4), площадь популяции - 400450 м2, численность на 1 м2 около 4 особей. Растения росли группами, неравномерно.
хостинскии Пикет район Семёновка
626 м
Змейковские водопады
Из^айловка
I. •
Краевло-
Армд&кое прогресс
J
^Береговая
Орлиные скаль
С2
Калиновое Озеро
1 Воронцов
Расстояние
между
популяциями
Расстояние
между
популяциями
Н, caucasicus -
6,5 КМ
Илларйоновка
-4-ОЧ г/Ахун
С1-С4 - Cyclamen соит G1-G3 - Galanthus woronowii
Н1-Н4 - Helleborus caucasicus P1-P4 - Paeonia caucasica
Рис. 1. Географическое местонахождение исследуемых эндемиков Западного Кавказа.
Образцы Helleborus caucasicus также были взяты из двух популяций: первая популяция находилась в районе жилых домов, вдоль р. Маце-ста (Н1, Н2), площадь популяции составила 20 м2 с численностью 38 особей; вторая популяция в лесной местности (Н3, Н4), площадь популяции - 90 м2, численность - до 3 особей на м2.
Образцы Galanthus woronowii были отобраны с нижней границы (С1), середины (С2) и верхней (С3) границы популяции, находящейся в тенистой лесной зоне вершины г. Ахун, общая площадь, занимаемая растениями, составила около 350 м2, численность - до 4-5 особей на 1 м2. Растения росли скоплениями, образуя небольшие группы.
Образцы Paeonia caucasica были отобраны с нижней (P1, P2) и верхней границ (P3, P4) популяции, находящейся на одной территории с популяцией Cyclamen wum. Общая площадь, занимаемая растениями, составила около 100 м2 с численностью 46 особей. Растения также росли группами, неравномерно.
Территории данных популяций подвержены, главным образом, антропогенным нагрузкам (вытаптывание, сбор на букеты, сбор в лекарственных целях, рекреационные нагрузки).
Из листьев отобранных образцов выделяли ДНК согласно протоколу CTAB (Doyle, 1990). Качество выделенной ДНК проверяли в 1%-м агарозном геле и спектрофотометрическим ме-
тодом. Все образцы разбавляли до рабочей концентрации 200 нг/мкл.
Генетический анализ. Поскольку 36 SCoT-праймеров были первоначально разработаны для Oryza sativa (Collard, Mackill, 2009) (табл. 1),
Реакционная смесь для ПЦР SCoT состояла из 10 мкл 2х реакционного буфера HS-TaqPCR (Биолабмикс, Новосибирск, Россия), содержащего Hot Start Taq-полимеразу, 0,4 мкл прай-мера (10 мкМ), 2 мкл ДНК (200 нг/мкл) и обработанной DEPC воды в общем объеме ПЦР 20
мы предварительно оценили переносимость этих праймеров на исследуемые виды и подобрали оптимальную программу амплификации. Эффективные 8СоТ-маркеры были выбраны для дальнейшей оценки.
мкл. Амплификацию проводили в термоцикл ере MiniAmp (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) по следующей программе: первичная денатурация 5 мин при 95 °C, отжиг 35 циклов денатурация при 95 °C в течение 1 мин, отжиг при 52 °C в течение 1 мин, элонгация при 72 °C в
Таблица 1
SCoT-маркеры, используемые для генетического анализа исследуемых видов
Название Сиквенс праймера 5'3'
SCoT праймер
SCoTl CAACAATGGCTACCACCA
SCoT2 CAACAATGGCTACCACCC
SCoT3 CAACAATGGCTACCACCG
SCoT4 CAACAATGGCTACCACCT
SCoT5 CAACAATGGCTACCACGA
SCoT6 CAACAATGGCTACCACGC
SCoT7 CAACAATGGCTACCACGG
SCoT8 CAACAATGGCTACCACGT
SCoT9 CAACAATGGCTACCAGCA
SCoT10 CAACAATGGCTACCAGCC
SCoTll AAGCAATGGCTACCACCA
SCoT12 ACGACATGGCGACCAACG
SCoT13 ACGACATGGCGACCATCG
SCoT14 ACGACATGGCGACCACGC
SCoT15 ACGACATGGCGACCGCGA
SCoT16 ACCATGGCTACCACCGAC
SCoT17 ACCATGGCTACCACCGAG
SCoT18 ACCATGGCTACCACCGCC
SCoT19 ACCATGGCTACCACCGGC
SCoT20 ACCATGGCTACCACCGCG
SCoT21 ACGACATGGCGACCCACA
SCoT22 AACCATGGCTACCACCAC
SCoT23 CACCATGGCTACCACCAG
SCoT24 CACCATGGCTACCACCAT
SCoT25 ACCATGGCTACCACCGGG
SCoT26 ACCATGGCTACCACCGTC
SCoT27 ACCATGGCTACCACCGTG
SCoT28 CCATGGCTACCACCGCCA
SCoT29 CCATGGCTACCACCGGCC
SCoT30 CCATGGCTACCACCGGCG
SCoT31 CCATGGCTACCACCGCCT
SCoT32 CCATGGCTACCACCGCAC
SCoT33 CCATGGCTACCACCGCAG
SCoT34 ACCATGGCTACCACCGCA
SCoT35 CATGGCTACCACCGGCCC
SCoT36 GCAACAATGGCTACCACC
течение 2 мин и финальная элонгация при 72 °C в течение 5 мин. Разделение SCoT-фрагментов проводили в 2%-м агарозном геле в течение 2,5 часов при 90 В в 1 х ТАЕ буфере. Длину каждого фрагмента ДНК в геле определяли по маркеру размера длин ДНК Sky-High (Биолабмикс), предназначенному для оценки длин и количества двуцепочечных ДНК размером от 250 до 10 000 п.н. Данные записывали в виде бинарной матрицы 1/0 для обозначения наличия и отсутствия амплифицированных фрагментов соответственно. Подсчет полос и длин фрагментов оценивались приблизительно вручную.
Статистическая обработка. Параметры генетического разнообразия были рассчитаны с использованием программы IMEC (Marker Efficiency Calkulator. URL: https://irscope.shin-yapps.io/iMEC/) и программного обеспечения GeneAlex ver. 6.5 (Peakall, Smouse, 2006; Peakall,
Smouse, 2012). Для каждого анализируемого параметра исследовали одну биологическую по-вторность (один образец - один генотип) и две технические повторности. Оценивались следующие параметры: общее количество бэндов, количество полиморфных бэндов (P = полиморфизм (%)). Кроме того, был выполнен анализ главных координат (PCoA) на основе набора данных матрицы в GeneAlex ver. 6.5.
Результаты
В результате апробации 36 SCoT-праймеров на целевых видах природной флоры три (SCoT13, SCoT14, SCoT15) показали низкий уровень амплификации в образцах и были удалены из анализа. Наибольшее количество полиморфных полос генерировали праймеры SCoT6 и SCoT16 (рис. 2).
Рис. 2. Электрофоретические спектры SCoT-праймеров для Cyclamen coum, Helleborus caucasicus, Galanthus woronowii, Paeonia caucasica.
Для всех анализируемых образцов генериро- праймер. При этом размер амплифицированных
вано 1205 фрагментов ДНК. Так, для Cyclamen продуктов варьировал от 0,175 (SCoT24) до 5,95
mum получено 305 фрагмента в диапазоне от 2 т. п. н. (SCoT20) (рис. 3). (SCoT1) до 23 (SCoT6), в среднем 9,21 полос на
Рис. 3. Минимальный и максимальный размеры фрагментов ДНК (п. н.) Cyclamen mum и Helleborus caucasicus.
Среди образцов Helleborus caucasicus SCoT-праймеры генерировали 323 фрагмента в диапазоне от 4 (SCoT1, 22) до 20 (SCoT6), в среднем 9,8 полос на праймер. В то же время, размер ам-плифицированных продуктов варьировал от 0,5 (SCoT27) до 4 т. п. н. (SCoT10) (рис. 3). Для видов Galanthus woronowii и Paeonia caucasica SCoT праймеры генерировали 294 и 283 ампликона соответственно. Диапазон количества фрагмен-
тов ДНК у Оа1апШш %>отопо%>и от 6 (8СоТ21) до 15 (8СоТ6, 27), у Рагота caucasica от 3 (8СоТ32) до 18 (8СоТ6), в среднем для каждого вида 8,8 и 8,6 полос на праймер соответственно. Размер амплифицированных продуктов варьировал от 0,3 (8СоТ31) до 4 т. п. н. (8СоТ5) у Оа1апЛш %>отопо%>и и от 0,21 (8СоТ25) до 5 т. п. н. у Рагота caucasica (8СоТ32) (рис. 4).
Рис. 4. Минимальный и максимальный размеры фрагментов ДНК (п. н.) Galanthus woronowii и Paeonia caucasica.
Изученные нами праймеры были распределены на два кластера по параметру полиморфизма (табл. 2). В первом кластере 16 8СоТ-праймеров, показавших низкий уровень полиморфизма для большинства исследуемых видов. Среди них только 8СоТ17 показал достаточно высокий полиморфизм для Helleborus caucasicus. Во второй кластер вошли 17 8СоТ-праймеров с высоки -
Таким образом, эффективными маркерами, показавшими наибольшее среднее значение полиморфизма для всех видов растений, оказались 8СоТ16 (58,2 %), 8СоТ6 (50,3 %), 8СоТ7 (49,6 %), 8СоТ8 (48,1 %), 8СоТ30 (42,8 %), 8СоТ29 (41,1 %) и 8СоТ20 (39,3 %).
ми значениями полиморфизма. Так, во втором кластере среднее значение полиморфизма для Cyclamen mum составило 50 %, от 18,2 (SCoT28) до 93,8 % (SCoT8), для Helleborus caucasicus -42,6 %, от 12,5 (SCoT28) до 66,7 % (SCoT17), для Galanthus woronowii - 22,1 %, от 9,1 (SCoT26) до 77,8 % (SCoT7), для Paeonia caucasica - 27,2 %, от 10 (SCoT5) до 85,5 % (SCoT16).
На рисунке 5 представлен анализ главных координат (РСоА), с помощью которого определены генетические дистанции между образцами каждого целевого вида из разных экологических мест произрастания (рис. 5).
Таблица 2
Полиморфизм SCoT-маркеров для исследуемых образцов
Группа Маркер Фрагменты ДНК Полимо рфизм, %
Cyclamen Helleborus Galanthus Paeonia Cyclamen Helleborus Galanthus Paeonia
Кластер I SCoT1 2 4 6 7 0 50 33,3 0
SCoT22 4 4 7 5 0 0 28,6 0
SCoT24 3 11 11 5 0 45,5 18,2 0
SCoT11 3 8 8 5 0 50 25 0
SCoT35 3 5 7 6 0 40 28,6 0
SCoT36 3 9 10 6 0 33,3 50 0
SCoT10 3 5 5 0 0 0
SCoT21 5 6 5 4 0 0 0 0
SCoT23 5 7 8 7 20 42,9 0 0
SCoT18 5 6 6 7 0 33,3 33,3 14,3
SCoT25 6 9 11 8 0 33,3 27,3 0
SCoT2 6 5 10 10 0 20 0 20
SCoT31 7 8 6 8 0 25 16,7 0
SCoT4 8 15 8 9 25 46,7 12,5 0
SCoT3 8 6 8 8 25 0 0 25
SCoT17 9 9 6 4 0 66,7 0 0
Кластер II SCoT19 9 11 6 13 22,2 54,5 0 23,1
SCoT9 9 14 11 12 33,3 42,9 36,4 25
SCoT27 9 15 15 10 22,2 46,7 40 50
SCoT29 9 13 8 12 44,4 61,5 0 58,3
SCoT12 10 8 10 8 50 25 0 0
SCoT33 11 12 12 10 63,6 58,3 58,3 0
SCoT28 11 8 11 6 18,2 12,5 0 16,7
SCoT34 11 12 9 9 27,3 25 0 22,2
SCoT30 12 14 10 9 66,7 64,3 40 0
SCoT5 13 14 8 10 38,5 42,9 37,5 10
SCoT32 14 8 9 3 21,4 25 11,1 0
SCoT7 15 10 9 11 73,3 20 77,8 27,3
SCoT8 16 8 9 12 93,8 62,5 11,1 25
SCoT26 17 15 11 7 64,7 26,7 9,1 14,3
SCoT20 18 13 13 15 44,4 46,2 0 66,7
SCoT16 17 11 9 14 70,6 54,5 22 85,7
SCoT6 23 20 15 18 73,9 55 33,3 38,9
Principal Coordinates [PCoA)
♦ н Орлинные / скалы Змейковские C1
♦ сз ^воррпар^__ ♦ С2
Генетические дистанции в популяциях Cyclamen соит Mill. Principal Coordinates (PCoA)
63 Верхняя граница ареала Середина ареала Q2
Нижняя грании ареала G1
Генетические дистанции в популяции Galanthus woronowii Losinsk.
Principal Coordinates (PCoA)
♦ "I \ > ул. Береговая Змейковские ♦ Н4 водопады
* Н2 * нз
Coord. 1
Генетические дистанции в популяциях Helleborus caucasicus A. Brown
Principal Coordinates (PCoA)
♦ Р4 Верхняя граница Нижняя граница
ареала ареала , —► ♦ "
+ РЗ /
♦ РЭ
Coord. 1
Генетические дистанции в популяции Paeonia caucasica Schipcz.
Рис. 5. Генетические дистанции в популяциях Cyclamen mum, Helleborus caucasicus, Galanthus woronowii, Paeonia caucasica на основе SCoT праймеров.
Установлено, что образцы двух популяций Cyclamen mum (C1, C2 и C3, С4) генетически отдалены друг от друга, такие же результаты наблюдались и в образцах популяций Helleborus caucasicus (H1, H2 и H3, H4). На основе PraA анализа также показано, что среди образцов Galanthus woronowii (G1, G2, G3) и Paeonia caucasica (P1, P2 и P3, P4), собранных в различных местах произрастания, также наблюдается генетическая дистантность.
Таким образом, система SCoT-маркеров эффективна для оценки внутривидового разнообразия целевых «краснокнижных» видов Западного Кавказа.
Обсуждение результатов
Маркеры SCoT ассоциированы с функциональными генами, поэтому первичный анализ полиморфизма SCoT-маркеров на различных видах растительных организмов имеет важное значение для таких целей, как селекция, характеристика зародышевой плазмы, изучение генетической стабильности и разнообразия различных культур и диких видов растений (Gorji et al., 2011; Xiong et al., 2011; Luo et al., 2012; Wu et al., 2013; Samarina et al., 2021, 2022). Изученные SCoT-маркеры не были ранее апробированы на целевых эндемичных видах растений природ-
ной флоры: Cyclamen mum, Helleborus caucasicus, Galanthus woronowii и Paeonia caucasica, поэтому нами они впервые были использованы для оценки внутривидового разнообразия данных видов.
В нашей работе ряд SCoT-маркеров (SCoT6-8, SCoT16, SCoT20, SCoT29, SCoT30) показал высокий уровень полиморфизма, в среднем для всех исследуемых видов от 39,3 до 58,2 %. В исследовании O. Simsek общий уровень полиморфизма RAPD-праймеров составил 99,3 % для Cyclamen, а SRAP-праймеров - 100 % (Simsek et al., 2017). А в исследовании ISSR-праймеров на видах рода Helleborus полиморфизм был от 43,28 до 76,87 % (Fassou et al., 2020). Также полиморфизм для видов рода Galanthus составлял 12,319,5 %. В работе M. Y. Lim общий полиморфизм RAPD-праймеров для Paeoniа составил 87,3 % (Lim et al., 2013). Стоит отметить, что исследования велись на различных видах одного рода, что способствовало выявить значительные генетические различия. Вместе с этим известно, что при изучении внутривидового полиморфизма на других видах растений, SCoT-маркеры показывают высокий полиморфизм, в диапазоне от 50 до 75 %. (Luo et al., 2012; Wu et al., 2013; Nath et al., 2015). Наши результаты согласуются с этими исследованиями и свидетельствуют об эффективности SCoT-маркеров для оценки внутривидовой изменчивости целевых видов.
В ряде исследований образцы, завезенные из близких географических локаций, формируют аналогичный генетический фон и обычно группируются в единый кластер (Hirano et al., 2010; Luo et al., 2012). Однако в результате анализа PCoA нами отмечены генетические дистанции между образцами внутри вида, что может быть связано с небольшой выборкой образцов. В дальнейшем планируется применение отобранных наиболее эффективных маркеров на расширенной выборке популяций.
Заключение
Наши результаты подтверждают актуальность и показывают эффективность SCoT-маркеров для оценки генетического разнообразия, характеристики и идентификации целевых видов природной флоры: Cyclamen mum, Helleborus caucasicus, Galanthus woronowii и Paeonia caucasica. Выявлены наиболее перспективные маркеры: SCoT6-8, SCoT16, SCoT20,
8СоТ29, 8СоТ30. Полученные результаты актуальны для дальнейших генетических исследований, а также являются вспомогательным инструментом при разработке стратегии сохранения редких и исчезающих видов растений.
Благодарности
Авторы выражают особую благодарность к. б. н. Лидии Сергеевне Самариной (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр «Субтропический научный центр Российской академии наук», г. Сочи) за помощь в планировании опытов и обработке полученных данных.
Публикация подготовлена в рамках реализации ГЗ ФИЦ СНЦ РАН № FGWR-2021-0008 «Разработка методов биотехнологии для целей сохранения генетических ресурсов субтропических, плодовых, декоративных культур и видов природной флоры как источников ценных признаков и селекционных исследований».
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
Altunkeyik H., Gulcemal D., Masullo M., Alankus-Caliskan O., Piacente S., Karayildirim T. 2012. Triterpene saponins from Cyclamen hederifolium. Phytochemistry 73: 127-133. DOI: 10.1016/j.phytochem.2011.09.003
Arif M., Zaidi N. W., Singh Y. P., Haq Q. M. R., Singh U. S. 2009. A comparative analysis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity in Shisham (Dalbergia sissoo). Plant Mol. Biol. Rep. 27(4): 488-495. DOI: 10.1007/ s11105-009-0097-0
Astapov M. B., Lozovoy S. P., Litvinskaya S. A. 2017. Introduction. In: S. A. Litvinskaya (ex. ed.). Krasnaya kniga Krasnodarskogo kraya. Rasteniya i griby [Red Book of the Krasnodar Territory. Plants and Fungi]. Krasnodar: Administration of the Krasnodar Territory. 850 pp. [In Russian] (Астапов M. Б., Лозовой С. П., Литвинская С. A. Введение // Красная книга Краснодарского края. Растения и грибы. Отв. Ред. С. А. Литвинская. 3-е изд. Краснодар: Администрация Краснодарского края, 2017. 850 с.).
Bassarello C., Muzashvili T., Skhirtladze A., Kemertelidze E., Pizza C., Piacente S. 2008. Steroidal glycosides from the underground parts of Helleborus caucasicus. Phytochemistry 69(5): 1227-1233. DOI: 10.1016/j.phyto-chem.2007.11.007
Bokov D. O., Krasikova M. K., Sergunova E. V., Bobkova N. V., Kovaleva Tyu., Bondar A. A., Marakhova A. I., Morokhina S. L., Krasnyuk I. I., Moiseev D. V. 2020. Pharmacognostic, phytochemical and ethnopharmacological potential of Cyclamen coum Mill. Pharmacogn. J. 12(1): 204-212. DOI: 10.5530/pj.2020.12.31
Bokov D. O., Samylina I. A., Nikolov S. D. 2017. Macroscopic and microscopic evaluation of Galanthus woronowii Losinsk. and Galanthus nivalis L. homeopathic crude herbal drugs. Int. J. Pharmacogn. Phytochem. Res. 9(1): 58-64. DOI: 10.25258/ijpapr.v9i1.8041
Chukuridi S. S., Bakalov A. N. 2009. The state of natural populations and features of cultivation in the culture of Helleborus caucasicus var. flavor-guttatus Br. and Scopolia carniolica Jacq. In: Subtropicheskoye dekorativnoye sadovod-stvo [Subtropical ornamental gardening] 1(42): 188-192. [In Russian] (Чукуриди С. С., Бакалов А. Н. Состояние естественных популяций и особенности выращивания в культуре морозника кавказского Helleborus caucasicus var. flavor-guttatus Br. и скополии карниолийской Scopolia carniolica Jacq. // Субтропическое декоративное садоводство, 2009. Т. 1(42). С. 188-192).
Collard B. C. Y., Mackill D. J. 2009. Start Codon Targeted (SCoT) Polymorphism: A simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants. Plant Mol. Biol. Rep. 27: 86-93. DOI: 10.1007/s11105-008-0060-5
Dall'Acqua S., Castagliuolo I., Brun P., Ditadi F., PalU G., Innocenti G. 2010. Triterpene glycosides with in vitro anti-inflammatory activity from Cyclamen repandum tubers. Carbohydr. Res. 345(5): 709-714. DOI: 10.1016/j. carres.2009.12.028
Davis A. P. 2006. The genus Galanthus-snowdrops in the wild. In: M. Bishop, A. P. Davis, J. Grimshaw (eds.). Snowdrops, A Monograph of Cultivated Galanthus. Cheltenham: Griffin Press Publishing Ltd. Pp. 9-63.
DengR. X., YangX., Wang Y. X., Du M. Z., Hao X. T., Liu P. 2018. Optimization of ultrasound-assisted extraction of monoterpene glycoside from oil Peony seed cake. J. Food Sci. 83(12): 2943-2953. DOI: 10.1111/1750-3841.14378 Doyle J. J. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15.
Etminan A., Pour-Aboughadareh A., Mohammadi R., Ahmadi-Rad A., Noori A., Mahdavian Z., Mora-
di Z. 2016. Applicability of start codon targeted (ScoT) and inter-simple sequence repeat (ISSR) markers for genetic diversity analysis in durum wheat genotypes. Biotechnol. Biotechnol. Equip. 30: 1075-1081. DOI: 10.1080/13102818.2016.1228478
Fassou G., Kougioumoutzis K., Iatrou G., Trigas P., Papasotiropoulos V. 2020. Genetic diversity and range dynamics of Helleborus odorus subsp. cyclophyllus under different climate change scenarios. Forests 11(6): 620. DOI: 10.3390/f11060620
Fomenko E. V., Postarnak Yu. A. 2011. Comparative characteristics of morphological features and ontogeny of Cyclamen coum Mill. in the valleys of the rivers Psekups, Tuapse and Pshekha of the Krasnodar Territory. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra Rossiyskoy akademii nauk [Proceedings of the Samara Scientific Center of the Russian Academy of Sciences] 13(5-2): 123-127. [In Russian] (Фоменко Е. В., Постарнак Ю. А. Сравнительная характеристика морфологических особенностей и онтогенеза Cyclamen coum Mill. в долинах рек Псекупс, Туапсе и Пшеха Краснодарского края // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2011. № 13(5-2). С. 123-127).
Gen$ N. Yildiz i., Karan T., Eminagaoglu O., Erenler R. 2019. Antioxidant activity and total phenolic contents of Galanthus woronowii (Amaryllidaceae). Turk. J. Biod. 2(1): 1-5.
Gorji A. M., Poczai P., Polgar Z., Taller J. 2011. Efficiency of arbitrarily amplified dominant markers (SCoT, ISSR and RAPD) for diagnostic fingerprinting in tetraploid potato. Am J Potato Res 88: 226-237. DOI: 10.1007/s12230-011-9187-2
Gupta P. K., Rustgi S. 2004. Molecular markers from the transcribed/expressed region of the genome in higher plants. Funct. Integr. Geonomics 4: 139-62. DOI: 10.1007/s10142-004-0107-0
Gupta V., Jatav P. K., Haq S. U., Verma K. S., Kaul V. K., Kothari S. L., Kachhwaha, S. 2019. Translation initiation codon (ATG) or SCoT markers-based polymorphism study within and across various Capsicum accessions: insight from their amplification, cross-transferability and genetic diversity. J. Genet. 98: 61. DOI: 10.1007/s12041-019-1095-0 Hajibarat Z., Saidi A., Hajibarat Z., Talebi R. 2015. Characterization of genetic diversity in chickpea using SSR markers, start codon targeted polymorphism (ScoT) and conserved DNA-derived polymorphism (CDDP). Physiol. Mol. Biol. Plants 21(3): 365-373. DOI: 10.1007/s12298-015-0306-2
Hirano R., Htun O. T., Watanabe K. N. 2010. Myanmar mango landraces reveal genetic uniqueness over common cultivars from Florida, India, and Southeast Asia. Genome 53: 321-330. DOI: 10.1139/g10-005
Hou X., Wang J., Jia T., Zhang Y. Q., Hou J., Li J. J. 2011. Orthogonal optimization of SCoT-PCR system and primer screening of tree peony. Acta Agric. Bor. Sin. 26(5): 92-96.
Hou Y. C., Yan Z. H., Wei Y. M., Zheng Y. L. 2005. Genetic diversity in barley from west China based on RAPD and ISSR analysis. Barley Genet. Newsl. 35(1): 9-22.
Howes M.-J. R., Perry E. 2011. The role of phytochemicals in the treatment and prevention of dementia. Drugs Aging 28: 439-468. DOI: 10.2165/11591310-000000000-00000
Ishizaka H., Yamada H., Sasaki K. 2002. Volatile compounds in the flowers of Cyclamen persicum, C. purpurascens and their hybrids. Sci. Hortic. 94(1-2): 125-135. DOI: 10.1016/S0304-4238(01)00362-4
Ivanova A., Delcheva I., Tsvetkova I., Kujumgiev A., Kostova I. 2002. GC-MS analysis and anti-microbial activity of acidic fractions obtained from Paeoniaperegrina and Paeonia tenuifolia roots. Z. Naturforsch. 57(7-8): 624-628. DOI: 10.1515/znc-2002-7-813
Jin Z. 2013. Amaryllidaceae and Sceletium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 30: 849-868. DOI: 10.1039/C3NP70005D Karimi E., Jaafar H. Z. E., Aziz M. A., Taheri S., AzadiGonbad R. 2014. Genetic relationship among Labisia pumila (Myrsinaceae) species based on ISSR-PCR. Genet. Mol. Res. 13: 3301-3309. DOI: 10.4238/2014.April.29.8
Kress W. J., Erickson D. L. 2012. DNA barcodes: methods and protocols. Methods Mol. Biol. 858: 3-8. DOI: 10.1007/978-1-61779-591-6_1
Lim M. Y., Jana S., Sivanesan I., Park H. R., Hwang J. H., Park Y. H., Jeong B. R. 2013. Analysis of genetic variability using RAPD markers in Paeonia spp. Grown in Korea. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 31(3): 322-327. DOI: 10.7235/ hort.2013.12210
Litvinskaya S. A. 2008. Cyclamen coum. In: L. V. Bardunov, V. S. Novikov (eds.). Krasnaya kniga Rossiyskoy Fede-ratsii (rasteniya I griby) [Red Data Book of Russian Federation (plants and fungi)]. Moscow: KMK Scientific Press Ltd. Pp. 462-463. [In Russian] (Литвинская С. А. Цикламен кавказский // Красная книга Российской Федерации. Растения и грибы. Под ред. Л. В. Бардунова, В. С. Новикова. М.: Тов-во науч. изд. КМК, 2008. С. 462-463).
Litvinskaya S. A. 2017. Helleborus caucasicus. In: S. A. Litvinskaya (ex. ed.). Krasnaya kniga Krasnodarskogo kraya. Rasteniya i griby [Red Book of the Krasnodar Territory. Plants and Fungi]. Krasnodar: Administration of the Krasnodar Territory. Pp. 151-153. [In Russian] (Литвинская С. А. Зимовник кавказский. // Красная книга Краснодарского края. Растения и грибы. Отв. ред. С. А. Литвинская. 3-е изд. Краснодар: Администрация Краснодарского края, 2017. С. 151-153).
Litvinskaya S. A. 2017. Paeonia caucasicа. In: S. A. Litvinskaya (ex. ed.). Krasnaya kniga Krasnodarskogo kraya. Rasteniya igriby [Red Book of the Krasnodar Territory. Plants and Fungi]. Krasnodar: Administration of the Krasnodar Territory. Pp. 185-186. [In Russian] (Литвинская С. А. Пион кавказский // Красная книга Краснодарского края. Растения и грибы. Отв. ред. С. А. Литвинская. 3-е изд. Краснодар: Администрация Краснодарского края, 2017. С. 185-186).
Luchkina M. A. 2010. Comparative ontogenic analysis of Cyclamen coum Mill. and Cyclamen kuznetzovii Kotov et Czernov. Moscow Univ. Biol.Sci. Bull. 65: 84-89. DOI: 10.3103/S0096392510020094
Luo C., He X.-H., Chen H., Hu Y. and Ou S.-J. 2012. Genetic relationship and diversity of Mangifera indica L., revealed through ScoT analysis. Genet. Resour. Crop. Evol. 59: 1505-1515.
Malyarovskaya V. I., Samarina L. S., Rahmangulov R. S., Koninskaya N. G. 2018. Study of micropropagation stages of Galanthus woronowii Losinsk. Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii [Fruit growing and berry growing in Russia] 55: 71-77. [In Russian] (Маляровская В. И., Самарина Л. С., Рахмангулов Р. С., Конинская Н. Г. Изучение этапов микроразмножения Galanthus woronowii Losinsk. // Плодоводство и ягодоводство России, 2018. № 55. С. 71-77). DOI: 10.31676/2073-4948-2018-55-71-77
Marker Efficiency Calkulator. [2021] URL: https://irscope.shinyapps.io/iMEC/ (Accessed 08 September 2021). Martins M., Sarmento D., Oliveira M. M. 2004. Genetic. stability of micropropagated almond plantlets, as assessed by RAPD and ISSR markers. Plant Cell Rep. 23(7): 492-496. DOI: 10.1007/s00299-004-0870-3
Martucciello S., Paolella G., Muzashvili T., Skhirtladze A., Pizza C., Caputo I., Piacente S. 2018. Steroids from Helleborus caucasicus reduce cancer cell viability inducing apoptosis and GRP78 down-regulation. Chem. Biol. Interact. 279: 43-50. DOI: 10.1016/j.cbi.2017.11.002
Mikheev A. D. 2008. Galanthus woronowii. In: L. V. Bardunov, V. S. Novikov (eds.). Krasnaya kniga Rossiyskoy Fed-eratsii (rasteniya i griby) [Red Data Book of Russian Federation (plants and fungi)]. Moscow: KMK Scientific Press Ltd. Pp. 54-55. [In Russian] (Михеев А. Д. Подснежник Воронова // Красная книга Российской Федерации. Растения и грибы. Под ред. Л. В. Бардунова, В. С. Новикова. М.: Тов-во науч. изд. КМК, 2008. С. 54-55).
Mikheev A. D. 2008. Paeonia caucasica. In: L. V. Bardunov, V. S. Novikov (eds.). Krasnaya kniga Rossiyskoy Feder-atsii (rasteniya i griby) [Red Data Book of Russian Federation (plants and fungi)]. Moscow: KMK Scientific Press Ltd. Pp. 422-423. [In Russian] (Михеев А. Д. Пион кавказский // Красная книга Российской Федерации. Растения и грибы. Под ред. Л. В. Бардунова, В. С. Новикова. М.: Тов-во науч. изд. КМК, 2008. С. 422-423).
Mukherjee A., Sikdar B., Ghosh B., Banerjee A., Ghosh E., Bhattacharya M., Roy S. C. 2013. RAPD and ISSR analysis of some economically important species, varieties, and cultivars of the genus Allium (Alliaceae). Turk. J. Bot. 37(4): 605-618. DOI: 10.3906/bot-1208-18
Muzashvili T., Skhirtladze A., Sulakvelidze T., Benidze M., Mshviladze V., Legault J., Pichette A., Kemertelid-ze E. 2006. Cytotoxic activity of Helleborus caucasicus A. Br. Georg. Chem. J. 6: 684-685.
Naderi R., AlaeyM., Khalighi A., HassaniM. E., Salami S. A. 2009. Inter-and intra-specific genetic diversity among cyclamen accessions investigated by RAPD markers. Sci. Hortic. 122(4): 658-661. DOI: 10.1016/j.scienta.2009.06.020 Nath V. S., Hegde V. M., Jeeva M. L., Misra R. S., Veena S. S., Raj M., Nair S. S. D. 2015. Genetic diversity of Phy-tophthora colocasiae causing taro leaf blight, analysis using start codon targeted (SCoT) polymorphism. J. Root Crops 39: 168-177.
Ozturk D. 2020. Cyclamen coum subsp. coum Miller (Primulaceae/Quha^egigiller) Taksonunun Anatomik, Mi-kromorfolojik ve Palinolojik Karakterlerinin Incelenmesi. SDU Fen. Bil. Enst. Der.24(2): 281-288. DOI: 10.19113/ sdufenbed.652819
Parker S. May B., Zhang C., Zhang A. L., Lu C., Xue C. C. 2016. A pharmacological review of bioactive constituents of Paeonia lactiflora Pallas and Paeonia veitchii Lynch. Phytother. Res. 30(9): 1445-1473. DOI: 10.1002/ptr.5653
Peakall R., Smouse P. E. 2006. GENALEX 6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Mol. Ecol. Notes 6: 288-295. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2005.01155.x
Peakall R., Smouse P. E. 2012. GenAlEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update. Bioinformatics 28: 2537-2539. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts460
Prange A. N. S., Serek M., Bartsch M., Winkelmann T. 2010. Efficient and stable regeneration from protoplasts of Cyclamen coum Miller via somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 101, 2: 171-182. DOI: 10.1007/s11240-010-9674-z
Rahbek C., Borregaard M. K., Antonelli A., Colwell R. K., Holt B. G., Nogues-Bravo D., Rasmussen C. M., Richardson K., RosingM. T., Whittaker R. J., Fjeldsa J. 2019. Building Mountain biodiversity: Geological and evolutionary processes. Science 365(6458): 1114-1119. DOI: 10.1126/science.aax0151
Samarina L. S., Malyarovskaya V. I., Reim S., Yakushina L. G., Koninskaya N. G., Klemeshova K. V. Shkhala-khova R. M., Matskiv A. O., Shurkina E. S., Gabueva T. Y., Slepchenko N. A., Ryndin A. V. 2021. Transferability of ISSR, SCoT and SSR markers for Chrysanthemum х morifolium Ramat and genetic relationships among commercial Russian cultivars. Plants 10(7): 1302. DOI: 10.3390/plants10071302
Samarina L. S., Matskiv A. O., Shkhalakhova R. M., Koninskaya N. G., Hanke M.-V., Flachowsky H., Shumeev A. N., Manakhova K. A., Malyukova L. S., Liu S., Zhu J., Gvasaliya M. V., Malyarovskaya V. I., Ryndin A. V., Pchikha-chev E. K., Reim S. 2022. Genetic diversity and genome size variability in the Russian genebank collection of Tea plant [Camellia sinensis (L). O. Kuntze]. Front. Plant Sci. 12: 800141. DOI: 10.3389/fpls.2021.800141
Sarikaya B. B., Kaya G. I., Onur M. A., Bastida J., Somer N. U. 2013. Phytochemical investigation of Galanthus woronowii. Biochem. Syst. Ecol. 51: 276-279.
Satya P., Karan M., Jana S., Mitra S., Sharma A., Karmakar P. G., Ray D. P. 2015. Start codon targeted (SCoT) polymorphism reveals genetic diversity in wild and domesticated populations of ramie (Boehmeria nivea L. Gaudich.), a premium textile fiber producing species. Meta gene 3: 62-70. DOI: 10.1016/j.mgene.2015.01.003
Shumkova O. A., Krivorotov S. B., Bukareva O. V., Arkhipov R. A. 2019. To the study of the distribution of protected plants in the North-Western Caucasus. In: Vestnik Tverskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya Biologiya i ekologiya [Bulletin of Tver State University. Series Biology and Ecology] 3: 55. [In Russian] (Шумкова О. А., Криворо-тов С. Б., Букарева О. В., Архипов Р. А. К изучению распространения охраняемых растений на Северо-Западном Кавказе // Вестник Тверского государственного университета. Серия Биология и экология, 2019. № 3. С. 55). DOI: 10.26456/vtbio111
Simsek O. Curuk P., Aslan F., Bayramoglu M., Izgu T., da Silva J. A T., Kacar Y. A., Mendi Y. Y. 2017. Molecular characterization of Cyclamen species collected from different parts of Turkey by RAPD and SRAP markers. Biochem. Genet. 55(1): 87-102. DOI: 10.1007/s10528-016-9770-9
Son J. H., Park K. C., Lee S. I., Kim J. H., Kim N. S. 2012. Species relationships among Allium species by ISSR analysis. Hortic. Environ. Biotechnol. 53(3): 256-262. DOI: 10.1007/s13580-012-0130-3
Suprun 1.1., Stepanov I. V., Slepchenko N. A., Malyarovskaya V. I., Kolomiec T. M., Samarina L. S. 2017. Approbation of ISSR DNA markers for genotyping of the species Galanthus woronowii Losinsk. and analysis of the genetic stability of plants obtained in culture in vitro. Politematicheskiy setevoy elektronnyy nauchnyj zhurnal Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Polythematic network electronic scientific journal of the Kuban State Agrarian University]. 133: 1166-1178. [In Russian] (Супрун И. И., Степанов И. В., Слепченко Н. А., Маляровская В. И., Ко-ломиец Т. М., Самарина Л. С. Апробация ISSR ДНК-маркеров для генотипирования вида Galanthus woronowii Losinsk. и анализ генетической стабильности растений, полученных в культуре in vitro // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета, 2017. № 133. C. 1166-1178). DOI: 10.21515/1990-4665-133-088
Timukhin I. N. 2006. Flora of vascular plants of the Sochi National Park. In: Inventarizatsiya osnovnykh taksonomi-cheskikh grupp i soobshchestv, sozologicheskiye issledovaniya Sochinskogo natsionalnogo parka - pervyye itogi raboty pervogo natsionalnogo parka Rossii [Inventory of the main taxonomic groups and communities, sozological studies of the Sochi National Park - the first results of the first national park in Russia]. Vol. 2. Sochi. Pp. 41-84. [In Russian] (Тимухин И. Н. Флора сосудистых растений Сочинского национального парка // Инвентаризация основных таксономических групп и сообществ, созологические исследования Сочинского национального парка - первые итоги первого в России национального парка. № 2. Сочи, 2006. С. 41-84).
Timukhin I. N., Tuniev B. S. 2017. Cyclamen coum. In: S. A. Litvinskaya (ex. ed.). Krasnaya kniga Krasnodarskogo kraya. Rasteniya i griby [Red Book of the Krasnodar Territory. Plants and Fungi]. Krasnodar: Administration of the Krasnodar Territory. Pp. 225-227. [In Russian] (Тимухин И. Н., Туниев Б. С. Цикламен кавказский // Красная книга Краснодарского края. Растения и грибы. Отв. ред. С. А. Литвинская. 3-е изд. Краснодар: Администрация Краснодарского края, 2017.С. 225-227).
Timukhin I. N., Tuniev B. S. 2017. Galanthus woronowii. In: S. A. Litvinskaya (ex. ed.). Krasnaya kniga Krasnodarskogo kraya. Rasteniya i griby [Red Book of the Krasnodar Territory. Plants and Fungi]. Krasnodar: Administration of the Krasnodar Territory. Pp. 454-455. [In Russian] (Тимухин И. Н., Туниев Б. С. Подснежник Воронова // Красная книга Краснодарского края. Растения и грибы. Отв. ред. С. А. Литвинская. 3-е изд. Краснодар: Администрация Краснодарского края, 2017. С. 454-455).
Ukhova M. O., Litvinskaya S. A. 2019. Dantovo Gorge as a potential area of special conservation importance within the Emerald Network of European Russia. In: Ekologo-geograficheskiye problemy regionov Rossii [Ecological and geographical problems of Russian regions: materials of the X All-Russian scientific and practical conference with international participation, dedicated to the 100th anniversary of the birth of Professor К I. Prokayev and the 90th anniversary of the Faculty of Natural Geography of SGSPU]. Samara. Pp. 90-92. [In Russian] (Ухова М. О., Литвинская С. А. Дантово ущелье как потенциальная территория особого природоохранного значения в рамках Изумрудной сети Европейской России // Эколого-географические проблемы регионов России: материалы X всерос. науч.-
практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 100-летию со дня рождения д. г. н., профессора В. И. Прокаева и 90-летию естественно-географического факультета СГСПУ Самара, 2019. С. 90-92).
Vahrusheva L. P., Ena A. V., Boldyrev E. V. 2009. Cyclamen coum in the Crimea: assessment of morphological criteria for species belonging to age conditions. Ekosistemy [Ecosystems] 1(20): 74-81. [In Russian] (Вахрушева Л. П., Ена А. В., Болдырев Е. В. Cyclamen coum в Крыму: оценка морфологических критериев видовой принадлежности возрастных состояний // Экосистемы, 2009. № 1(20). С. 74-81).
Wu J.-M., Li Y.-R., Yang L.-T., Fang F.-X., Song H.-z., Tang H.-Q., Wang M., WengM.-L. 2013. cDNA-SCot, a novel rapid method for analysis of gene differential expression in sugarcane and other plants. Aust. J. Crop Sci. 7: 659.
Wu S. H., Wu D. G., Chen Y. W. 2010. Chemical constituents and bioactivities of plants from the genus Paeonia. Chem. Biodivers. 7(1): 90-104. DOI: 10.1002/cbdv.200800148
Xiong F. Q., Zhong R. C., Han Z. Q., Jiang J., He L. Q., Zhuang W. J., Tang R. H. 2011. Start codon targeted polymorphism for evaluation of functional genetic variation and relationships in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) genotypes. Mol. Biol. Rep. 38: 3487-3494. DOI: 10.1007/s11033-010-0459-6
YangS., Shi S., GongX., Zhou R. 2005. Genetic diversity of Paeonia delavayi as revealed by ISSRs. Biodiv. Sci. 13(2): 105-111. DOI: 10.1360/biodiv.040179
ZubovD. A., Kashevarov G. P., Didenko S. Ya., Blyum O. B. 2011. The DNA polymorphism analysis of introduced Galanthus L. species (Amaryllidaceae J. St.-Hil.) using RAPD markers. Plant Introduction 52(4): 53-61. [In Russian] (Зубов Д. А., Кашеваров Г. П., Диденко С. Я., Блюм О. Б. Анализ ДНК-полиморфизма интродуцированных видов рода Galanthus L. (Amaryllidaceae J. St.-Hil.) с помощью RAPD-маркеров // 1нтродукщя рослин, 2011. № 52(4). С. 53-61). DOI: 10.5281/zenodo.2544348
