CC BY
39
УДК 633.18:577.2:57.088
03.00.00 Биологические науки
АПРОБАЦИЯ ISSR ДНК-МАРКЕРОВ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИДА GALANTHUS WORONOWII LOSINSK.. И АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ РАСТЕНИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO*
Супрун Иван Иванович 1
к.б.н., зав. лабораторией, SPIN-код: 7124-5304
Маляровская Валентина Ивановна2
к.б.н., зав. лабораторией, SPIN-код: 1302-3070
Степанов Илья Владимирович1 м.н.с., SPIN-код: 3968-1982
Коломиец Татьяна Михайловна2
к.с.х.н., доцент, ведущий научный сотрудник,
SPIN-код: 8205-3113
Самарина Лидия Сергеевна2
к.б.н., старший научный сотрудник, SPIN-код:
4781-4020
Слепченко Наталья Александровна1 к.б.н., ученый секретарь, SPIN-код: 4912-4347
1 Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия, Россия, г. Краснодар, ул. 40 лет Победы, 39. supruni@mail. ru
2 Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур, Россия, г. Сочи, ул. Яна Фабрициуса, 2/28. subplod@mail.ru
UDC 633.18:577.2:57.088 Biology
APPROBATION OF ISSR DNA-MARKERS FOR GENOTYPING OF GALANTHUS WORONOWII LOSINSK.. AND ANALYSIS OF GENETIC STABILITY OF PLANTS, OBTAINED BY IN VITRO CULTURE
Suprun Ivan Ivanovich1
Cand. Biol. Sci., Head of the laboratory, SPIN: 71245304
Malyarovskaya Valentina Ivanovna2 Cand. Biol. Sci., Head of the laboratory, SPIN: 13023070
Stepanov Ilia Vladimirovich1 staff scientist, SPIN-code: 3968-1982
Momiyets Tatyana Mikhailovna2 Cand.Agr.Sci., docent, leading researcher; SPIN: 82053113
Samarina Lidia Sergeyevna2
Cand. Biol. Sci., research sci. SPIN: 4781-4020
Slepchenko Natalia Aleksandrovna1
Cand. Biol. Sci., Scientific secretary, SPIN: 4912-4347.
1 North Caucasian Regional Research Institute of Horticulture and Viticulture, Russia, Krasnodar, 40 let Pobedy street, 39
supruni@mail. ru
2 All-Russian Scientific and Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops, Russia, Sochi, JanаFabrisiusа str., 2/28.
subplod@mail. ru
В ходе работы была проведена оценка 33 ISSR маркеров на эффективность использования в выявлении генетических изменений в регенерантах подснежника Воронова (Оа1ап^т woronowii Losinsk..).Установлено 10 маркеров перспективных для проведения генотипирования по исследуемому виду. По пяти маркерам из отобранных десяти был проведен анализ выборки из 20 растений-регенерантов и маточного растения. Полученные данные свидетельствуют о генетической стабильности растительного материала в процессе микроклонального
In the course of the work, 33 ISSR markers were evaluated for efficacy in the detection of genetic changes in regenerants of Galanthus woronowii Losinsk.. Ten markers were found suitable for genotyping according to the species under study. Five samples from the selected ten were analyzed for a sample of 20 plants of regenerants and a mother plant. The obtained data testify to genetic stability of plant material in the process of microclonal propagation
*
Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края (проект № 16-44-230274 р_а)
размножения
Ключевые слова: ISSR ДНК-МАРКЕРЫ, ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ, СТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНОТИПА IN VITRO, РЕДКИЕ ВИДЫ РАСТЕНИЙ, GALANTHUS WORONOWII LOSINSK
Doi: 10.21515/1990-4665-133-088
Keywords: ISSR DNA-MARKERS, GENETIC POLYMORPHISM, IN VITRO GENOTYPE STABILITY, RARE PLANTS, GALANTHUS WORONOWII LOSINSK
На территории Западного Кавказа сосредоточено большое количество (более 65 %) редких видов растений, подлежащих охране на государственном и региональном уровнях [1]. Поэтому особую актуальность имеют исследования по разработке методов сохранения растений, ареалы и численность которых резко снижается, а также для уникальных форм, расширяющих и улучшающих сортимент возделываемых растений.
Разрешение проблемы сохранения биоразнообразия возможно на основе всестороннего изучения редких и исчезающих видов растений, их биологических и экологических особенностей, тактики и стратегии выживания. Одной из составляющих стратегии сохранения редких видов, которая может ослабить или снять антропогенное давление, оказываемое на природные популяции таких видов, является введение их в культуру. При этом важную роль играет освоение различных способов их массового размножения [2]. В связи с чем наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ все большее значение приобретает использование для этих целей культуры изолированных тканей и органов. Несомненно, привлечение методов биотехнологии, базирующихся на культивировании изолированных органов, тканей и клеток растений для решения проблем сохранения биологического разнообразия имеет преимущества перед традиционно используемыми подходами.
Одним из видов, подлежащих охране на территории Западного Кавказа, является подснежник Воронова (Galanthus woronowii Losinsk.).
Этот вид внесен в Красную книгу Краснодарского края и рекомендован к охране на территории Большого Сочи [3, 4]. Также он включен в Приложение II Международной Конвенции СИТЕС. Это эндемик, численность которого сокращается в результате чрезмерного использования его человеком. Встречается в Краснодарском крае на Черноморском побережье от Туапсе до реки Псоу, в Республике Адыгея (Гузерипль), в Ставропольском крае близ г. Ессентуки [3].
По мнению Слепченко Н.А. (2013) для размножения Galanthus woronowii необходимо в большей степени, чем для других луковичных (Leucojum aestivum и Pancratium maritimum) использовать методы культуры тканей, поскольку малый размер луковиц этого вида не позволяет размножать растения вегетативным способом [2].
Во ВНИИЦиСК (г. Сочи) проводятся исследования по разработке приемов размножения и сохранения редких и исчезающих видов Западного Кавказа в условиях in vitro [5-7]. С 2016 года начали проводиться работы по введению в условия культуры in vitro и эндемичного вида G. woronowii. Важным преимуществом разрабатываемой технологии размножения редких генотипов, в том числе и подснежника Воронова, в культуре in vitro должно явиться массовое воспроизводство генетически стабильных регенератов, не отличающихся по ряду морфологических, биохимических и генотипических признаков от исходных растений [8] (рисунок 1).
Рисунок 1 Микролуковички подснежника Воронова в культуре in
vitro.
Однако при размножении культуры in vitro возникает опасность возникновения сомаклональной изменчивости. Для мониторинга подобной ситуации необходимо проведение анализа, способного выявить генетические отклонения в размножаемом растительном материале [9].
В качестве метода быстрой и эффективной оценки генетического полиморфизма положительно себя зарекомендовали мультилокусные ISSR ДНК-маркеры. ISSR праймеры, комплементарные микросателлитным последовательностям генома, позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двух расположенных в достаточной близости микросателлитных локусов. И как следствие в процессе ПЦР синтезируется большое количество фрагментов ДНК, представленных на электрофореграмме в виде ДНК-фингерпринта [10].
В настоящее время в научной литературе имеется целый ряд примеров успешного использования мультилокусных ДНК-маркеров для проведения анализа растений, полученных путем микроклонального размножения, на предмет наличия у них генетических отклонений. Примером может послужить работа, проведенная с использованием 18
ISSR маркеров для скрининга полученных растений-регенерантов лилии восточной при микроклональном размножении в условиях in vitro. При этом уровень проявления генетических мутаций, вызванных микроклональным размножением был минимален [11]. В исследованиях Wang Q.M. с соавторами [12] по анализу генетической стабильности растений-регенерантов, относящихся к виду Clivia miniata (Lindl.) Bosse, ISSR маркеры также были использованы в качестве эффективного молекулярно-генетического «инструментария» для анализа генетической однородности регенерантов.
Так же наглядным примером эффективности применения ISSR маркеров для анализа генетической стабильности является работа группы исследователей из лаборатории лесной генетики и биотехнологии Нанкинского университета (Китай). В ходе проведения микроклонального размножения вида Lilium longiflorum Thunb. данным коллективом была осуществлена обработка адвентивных почек гамма-облучением с целью индицирования мутагенеза. Облученные растения-регенеранты и исходные растения были сопоставлены друг с другом с использованием ISSR ДНК-маркеров. Использованный в работе метод позволил выявить мутантные образцы, у которых в процессе последующей оценки по комплексу морфолого-анатомических признаков были установлены отличия от исходной формы [13]. В данной работе, в ходе апробации ISSR-маркеров, из 50 маркеров были отобраны только 7 наиболее информативных. Это подчеркивает необходимость в оценке достаточно большого числа ДНК -маркеров для успешного выявления наиболее информативных.
В связи с этим, целью нашего исследования являлось выполнение апробации 33 ISSR ДНК-маркера и последующий анализ генетической стабильности регенерантов подснежника Воронова, полученных путем микроклонального размножения, по технологии, разработанной в ВНИИЦиСК.
Материалы и методы. Для проведения ДНК-анализа были отобраны 20 растений-регенерантов из in vitro коллекции ВНИИЦиСК и маточное растение. Выделение ДНК проводилось стандартной ЦТАБ методикой из листьев [14].
В работе оценивали полиморфизм следующих ISSR-маркеров: UBC813, UBC864, UBC844, UBC843, UBC825, UBC818, UBC811, UBC845, UBC853, UBC826, UBC810, UBC817, UBC808, UBC824, UBC807, UBC815, UBC 27, UBC873, ASSR02, ASSR15, ASSR20, ASSR 29, 3A39, 3A21, 3A30, 3A35, 3A37, 3A59, M1, M8, X9, X11, X10 [15, 16].ПЦР была проведена согласно следующей программе: 3 минуты предварительной денатурации при температуре 95 °С; последующие 35 циклов: денатурация 35 секунд при 95 °С, отжиг праймеров 1 минута при 50 °С, элонгация 1,5 минуты при 72 °С, и финальный цикл синтеза при температуре 72 °С в течение 5 минут. Концентрации реагентов в ПЦР смеси: 2,5 мкл 10-кратного буфера для Taq ДНК-полимеразы (ООО «Сибэнзим», Россия), 0,5 или 2,5 мклёЭТР (2,5 мМ), 1 единица активности Taq ДНК-полимеразы, 2 мклпраймера (3,75 мМ) и 40-50 нг тотальной ДНК в общем объеме 25 мкл. Электрофорез ПЦР-продуктов проводился в 2,5 % агарозном геле при напряжении 100 В.
Результаты и обсуждение. Для пополнения сведений об эффективных ISSR маркеров для генотипирования образцов подснежника Воронова были апробированы как новые, ранее не использовавшиеся в работе ISSR, так и задействованные нами в предыдущем исследовании [17], но с измененными условиями ПЦР (рисунок 2). В проведённой работе эффективность ISSR маркеров оценивалась по общему количеству апмлифицированных ДНК-фрагментов и степени их выраженности на электрофорезе.
М
3 4
И"*
1гЦ|
■' ^
"Ж.. т
1 ••
л Л
£ 4 Щ Ж
:: __ Щ У.
Рисунок 2 Электрофоретические спектры ^ЗЯ-маркеров подснежника
Воронова.
Примечание: М - маркер молекулярной массы ДНК; 1 - ЦВС864, 2 -иВС815, 3 - иВС827, 4 - Л88Я29, 5 - иВС813, 6 - ЦВС818, 7 - ШС811, 8 -
Л88Я02
Из 24 маркеров, ранее не использовавшихся для генотипирования образцов подснежника Воронова, по 7 И^Я маркерам (3Л39, 3Л30, М8, ЦВС826, Х11, иВС807, Л88Я20) амплификация не была выявлена. Их дальнейшее использование для генотипирования целевого вида бесперспективно. В свою очередь, девять маркеров, по которым прошла ПЦР, имели различное качество амплифицированных фрагментов. В зависимости от качества фингерпринтов, маркеры были разделены на группы по приоритетности их использования в генотипировании подснежника Воронова (таблица 1). По результатам анализа по ряду маркеров были получены минорные ДНК фрагменты с недостаточной степенью выраженности. К таким маркерам можно отнести ЦВС817, ЦВС824, 3Л37, Х9, ЦВС853, Х10, ЦВС815, ЦВС873. Использование фингерпринтов по данным маркерам для генотипирования образцов нежелательно из-за возможного возникновения ошибок при анализе результатов, связанных с плохим качеством детектируемых фрагментов в электрофоретическом спектре. Маркеры, имеющие только минорные фрагменты, вошли в IV и III группы приоритетности. Исключение составил маркер Х10, который был включен в группу II из-за большого количества минорных фрагментов. Остальные маркеры, отнесенные во II
группу, при генотипировании образцов подснежника Воронова дали четкие ДНК-фрагменты, однако количество фрагментов было недостаточно для включения маркеров в I группу. В I группу вошли три маркера, имеющие наиболее качественные фингерпринты по образцам подснежника Воронова. К I группе отнесены маркеры: ЦВС844, ЦВС843, 3А59. Также помимо новых, ранее не применявшихся на генотипах подснежника Воронова 188Я маркеров в работе были задействованы прежде апробированные на данном виде маркеры, но с использованием новых условий ПЦР, в частности была увеличена концентрация ё№ТРс0,5 до 2,5 тМ. В эту группу входят 9 маркеров: ЦВС813, ЦВС864, А88Я29, иВС825, иВС818, ЦВС811, А88Я02, А88Я15, ЦВС827.
Таблица 1 Количество фрагментов в спектрах апробированных 188Я-
маркеров у вида Galanthus wöronowii Losinsk.
№ Маркеры Общее количество фрагментов Количество минорных фрагментов Приоритет использования
1 UBC 813 0 0 -
2 UBC 864 4 2 I
3 UBC 844 9 5 I
4 ASSR 29 4 0 I
5 UBC 843 5 2 I
6 UBC 825 3 2 III
7 UBC 818 6 3 I
8 UBC 811 7 4 I
9 ASSR02 6 1 I
10 ASSR15 2 0 I
11 ASSR20 0 0 -
12 3A39 0 0 -
13 3A21 3 2 III
14 UBC 810 1 0 IV
15 UBC 817 3 3 III
16 UBC 808 2 0 II
17 UBC 824 5 5 IV
18 3A30 0 0 -
19 3A35 4 3 III
20 3A37 7 7 III
21 3A59 5 2 I
22 M1 1 0 II
23 M8 0 0 -
24 X9 3 3 III
25 UBC 845 5 2 III
26 UBC 853 2 2 III
27 UBC 826 0 0 -
28 X 11 0 0 -
29 UBC 807 0 0 -
30 X 10 7 7 II
31 UBC 815 1 1 IV
32 UBC 827 6 2 I
33 UBC 873 4 4 II
В большинстве случаев качество фингерпринтов использованных маркеров улучшилось за счет изменения параметров ПЦР. Исключение составили маркеры ЦВС813 и А88Я15. Маркер ЦВС813 не выявил дискретных фрагментов в спектре и его использование для искомого вида бесперспективно. По маркеру А88Я15 при новых параметрах ПЦР также не было выявлено увеличения фрагментов в спектре, при высоком качестве амплификации. У остальных маркеров количество ДНК фрагментов варьировало от 3 у ЦВС825 до 8 у ЦВС818, что делает их перспективными для проведения генотипирования. Поэтому, они были включены в группу приоритета I. Таким образом, в ходе оценки информативности 188Я маркеров было определено 10 маркеров, имеющих высокую информативность при проведении генотипирования образцов подснежника Воронова. Из числа этих маркеров было выбрано пять образцов подснежника Воронова для проведения анализа на генетическую стабильность в процессе микроклонального размножения: 3А59, А88Я 02, ЦВС843, А88Я29, ЦВС818 (Рисунок 3). Анализ был проведен на выборке, включающей 20 растений-регенерантов и исходное растение, послужившее донором эксплантов.
А)
М 12 3 4 5 6 7 8
В)
М 1 2 3 4 56 78
Рисунок 3 Генотипирование растений - регенерантов подснежника Воронова по маркерам UBC843 (A) и ASSR29 (B) Примечание: М-маркер молекулярной массы ДНК, 1 - маточное растение,
2-8 - растения регенеранты.
По всем маркерам для всех изученных растений-регенерантов наблюдались идентичные ДНК-фингерпринты, что свидетельствует о генетической однородности клонов и их генетической идентичности с исходным растением-донором эксплантов.
Выводы. Проведенная работа позволила выявить перспективные ISSR маркеры для генотипирования вида Galanthus woronowii. На основе набора установленных эффективных ДНК-маркеров был проведен анализ выборки из 20 растений-регенерантов и донорного растения. Выявленная генетическая однородность растений-регенерантов, полученных в культуре in vitro, установленная методом ISSR-генотипирования, позволяет утверждать, что технология размножения подснежника Воронова in vitro, разработанная во ВНИИЦиСК не влияет на генетическую структуру регенерантов. Ее использование не приведет к генетическому вырождению in vitro линий в череде поколений микроклонально размноженных растений. Наряду с оценкой генетической
стабильности растений-регенерантов, отобранные нами в ходе исследования ISSR ДНК-маркеры могут быть успешно использованы при анализе генетической структуры природных популяций данного вида, что обладает высокой актуальностью, учитывая его охранный статус.
Литература
1.Тимухин И.Н. Флора сосудистых растений Сочинского национального парка // Инвентаризация основных таксономических групп и сообществ, созологические исследования Сочинского национального парка - первые итоги первого в России национального парка. Монография. М.: «Престиж», 2006. С. 41-84.
2. Слепченко Н.А. Редкие и исчезающие виды семейства Amaryllidaceae Jaume Saint-Hilaire на черноморском побережье России и стратегия их сохранения: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.02.08, 03.02.01 / Слепченко Наталья Александровна. -Махачкала, 2013. - 23 с.
3. Красная книга Краснодарского края. Том Растения и грибы. — Краснодар: ООО «Дизайн Бюро № 1», 2007. — 489 с.
4. Солодько А.С., Кирий П.В. Красная книга Сочи. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды. Том 1. Растения и грибы. - Сочи, 2002.148 с.
5. Маляровская В.И., Коломиец Т.М., Соколов Р.Н., Самарина Л.С. Влияние спектрального состава света на рост и развитие Lilium caucasicum в условиях культуры in vitro// Политематический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. - 2013. - № 94. - С. 1016-1026.
6. Соколов, Р.Н., Коломиец Т.М., Маляровская В.И. Введение в культуру invitro некоторых редких и исчезающих видов флоры Западного Кавказа // Политематический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. - 2013. - №94(10). - С. 1-17.
7. Самарина Л.С., Коломиец Т.М., Слепченко Н.А. Сохранение in vitro исчезающего псаммофита черноморского побережья России Pancratium maritimum // Субтропическое и декоративное садоводство. — 2012. - Вып. 47.— С. 172-177.
8. Супрун И.И, Коломиец Т.М., Соколов Р.Н., Маляровская В.И., Самарина Л.С. Поиск оптимальных ISSR маркеров для проведения генотипирования панкрация морского// Плодоводство и виноградарство Юга России, 2014. - № 30(06).
9. Новикова, Т.И., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких и полезных растений в коллекции in vitro Центрального Сибирского ботанического сада // Вестник ВОГиС. - 2008. - Том 12. - № 4. - С. 564-572.
10. Morgante, M. PCR-amplified microsatellite markers in plant genetics M. Morgante, A.M. Oliveri // Plant J. - Vol. 3. - 1993. - P. 175-182.
11. X. Liu, G.Yang., Adventitious shoot regeneration of oriental lily (Lilium orientalis) and genetic stability evaluation based on ISSR marker variation //. In Vitro Cell. Dev. Biol.— Plant.- 2012.- Vol.48. P. 172-179.
12. Wang Q.M., Gao F., Gao X. Regeneration of Clivia miniata and assessment of clonal fidelity of plantlets // Plant. Cell. Tiss. Organ. Cult. 2012.-Vol.109. P.191-200.
13. M. Xi, SunL., Qiu S. In vitro mutagenesis and identification of mutants via ISSR in lily (Lilium longiflorum) // Plant Cell Rep - 2012.- Vol.31- P. 1043-1051.
14. Doyle, J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. - Vol. 19. - 1987. P. 11-15.
15. Arzate-Fernandez, A.M. Miwa M., Shimada T., Yonekura T., Ogawa K. Genetic diversity of Miyamasukashi-yuri (Lilium maculatum Thunb. var. bukosanense), an endemic
and endangered species at Mount Buko, Saitama, Japan // Plant Species Biology. - 2005. -№ 20. - P. 57-65.
16. Krishna Parvathaneni, R., Natesan S., Arunachalam Devaraj A., Muthuraja R., Venkatachalam R., Prathap Subramani A. , Laxmanan P. Fingerprinting in Cucumber and Melon (Cucumi sspp.) Genotypes Using Morphological and ISSR Markers / R. Krishna Parvathaneni, // J. Crop Sci. Biotech. - 2011. - № 1. - P. 39-43.
17. Супрун И. И., Коломиец Т.М., Маляровская В.И., Соколов Р.Н., Самарина Л.С., Слепченко Н.А. Апробация ISSR ДНК-маркеров для генотипирования редких видов растений Западного Кавказа: Lilium caucasicum Miscz. Ex Grossh., Galanthus woronowii Kolak., Pancratium maritimum // Научный журнал КубГАУ, №103(09), 2014 года http://ej .kubagro.ru/2014/09/pdf/37.pdf
References
1. Timukhinl.N. Flora sosudistykh rasteniy Sochinskogo natsional'nogo parka // Inventarizatsiya osnovnykh taksonomicheskikh grupp I soobshchestv, sozologicheskiye issledovaniya Sochinsko gonatsional'nogo parka - pervyye itogi pervogo v Rossiinatsional'nogo parka. Monografiya. M.: «Prestizh», 2006. P. 41-84.
2. SlepchenkoN.A. Redkiye I ischezayushchiye vidy semeystva Amaryllidaceae Jaume Saint-Hilaire na chernomorskom poberezh'ye Rossii I strategiya ikh sokhraneniya: avtoref. dis. ... kand. biol. nauk: 03.02.08, 03.02.01 / Slepchenko Natal'ya Aleksandrovna. -Makhachkala, 2013. - P.23.
3. Krasnaya kniga Krasnodarskogo kraya. Tom Rasteniya i griby. — Krasnodar: OOO «Dizayn Byuro № 1», 2007. — P.489.
4. Solod'ko A.S., Kiriy P.V. Krasnaya kniga Sochi. Redkiye I nakhodyashchiyesya pod ugrozoy ischeznoveniya vidy. Tom 1. Rasteniya I griby // Sochi, 2002. - P.148.
5. Malyarovskaya V.I., Kolomiyets T.M., Sokolov R.N., Samarina L.S. Vliyaniye spektral'nogo sostava sveta na rost I razvitiye Lilium caucasicum v usloviyakh kul'tury in vitro // Politematicheskiy setevoy elektronnyy nauchnyy zhurnal KubGAU. Krasnodar, 2013. - № 94. - P. 1016-1026.
6. Sokolov, R.N., Kolomiyets T.M., Malyarovskaya V.I. Vvedeniye v kul'turu in vitro nekotorykh redkikh I ischezayushchikh vidov flory Zapadnogo Kavkaza // Nauchnyy zhurnal KubGAU. - 2013. - №94(10). - P. 1-17.
7. Samarina L.S., Kolomiyets T.M., Slepchenko N.A. Sokhraneniye in vitro ischezayushchego psammofita chernomorskogo poberezh'ya Rossii Pancratium maritimum // Subtropicheskoye I dekorativnoye sadovodstvo: sb. nauch. tr. / GNU VNIITsiSK Rossel'khozakademii.— 2012. №. 47.— P. 172-177.
8. Suprun I.I, Kolomiyets T.M., Sokolov R.N., Malyarovskaya V.I., Samarina L.S. Poiskoptimal'nykh ISSR markerov dlya provedeniya genotipirovaniya pankratsiyamorskogo// Plodovodstvo I vinogradarstvo Yuga Rossii, 2014. - № 30(06).
9. Novikova, T.I. Sokhraneniye redkikh ipoleznykh asteniy v kollektsii in vitro Tsentral'nogo Sibirskogo botanicheskogo sada / T.I. Novikova, A.YU. Nabiyeva, T.V. Poluboyarova // Vestnik VOGiS. - 2008. - V.12. - № 4. - P. 564-572.
10. Morgante, M. PCR-amplified microsatellite markers in plant genetics M. Morgante, A.M. Oliveri // Plant J. - Vol. 3. - 1993. - P. 175-182.
11. X. Liu, G.Yang., Adventitious shoot regeneration of oriental lily (Lilium orientalis) and genetic stability evaluation based on ISSR marker variation / X. Liu, G.Yang //. In Vitro Cell. Dev. Biol.— Plant.- 2012.- Vol.48. P. 172-179
12. Wang Q.M., Regeneration of Clivia miniata and assessment of clonal fidelity of plantlets /Q. Wang, F. Gao, X. Gao // Plant. Cell. Tiss. Organ. Cult. 2012.-Vol.109. P.191-200.
13. M. Xi, In vitro mutagenesis and identification of mutants via ISSR in lily (Lilium longiflorum) / M. Xi, L. Sun, S. Qiu // Plant Cell Rep - 2012.- Vol.31- P.1043-1051
14. Doyle, J.J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / J.J. Doyle, J.L. Doyle // Phytochem. Bull. - Vol. 19. - 1987. P. 11-15.
15. Arzate-Fernandez, A.M. Genetic diversity of Miyamasukashi-yuri (Lilium maculatum Thunb. var. bukosanense), an endemic and endangered species at Mount Buko, Saitama, Japan / A.M. Arzate-Fernandez, M. Miwa, T. Shimada, T. Yonekura and K. Ogawa // Plant Species Biology. - 2005. - № 20. - P. 57-65.
16. Krishna Parvathaneni, R. Fingerprinting in Cucumber and Melon (Cucumis spp.) Genotypes Using Morphological and ISSR Markers / R. Krishna Parvathaneni, S. Natesan, A. Arunachalam Devaraj, R. Muthuraja, R. Venkatachalam, A. Prathap Subramani, P. Laxmanan // J. Crop Sci. Biotech. - 2011. - № 1. - P. 39-43.
17. Suprun I. I. Kolomiyets T M, Malyarovskaya V I Aprobatsiya ISSR DNK-markerov dlya genotipirovaniya redkikh vidov rasteniy zapadnogo kavkaza: Lilium caucasicum Miscz. Ex Grossh., Galanthus woronowii Kolak., Pancratium maritimum /Suprun I I, i dr. // Nauchnyy zhurnal KubGAU, №103(09), 2014 goda http://ej.kubagro.ru/2014/09/pdf/37.pdf
