CC BY
99
УДК 633.854.78:631
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ АНДРОГЕННЫХ ГАПЛОИДОВ ЯЧМЕНЯ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ, СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И ПЛОТНОСТИ ИНОКУЛЯЦИИ ПЫЛЬНИКОВ
©2013 Е.В.Белинская
Институт растениеводства им. В.Я. Юрьева НААН Украины, г. Харьков Поступила 05.06.2013
Изучали возможность одноэтапного получения растений-регенерантов в культуре пыльников in vitro ячменя ярового при замене агар-агара в индукционной среде кукурузным крахмалом, выделенным из зерна линии-носителя мутантного гена структуры эндосперма suj_ и химически модифицированным крахмалом Д-5а, а также влияние на эффективность гаплопродукционного процесса плотности инокуляции пыльников. Установлено, что на питательных средах, содержавших крахмал, снижение частоты регенерации происходило либо вследствие высокой интенсивности роста неэмбриогенного каллуса (su 2 -крахмал), либо из-за ингибирова-ния роста и развития эмбриоидов (химически модифициролованный крахмал). Уменьшение плотности инокуляции пыльников способствовало повышению частоты регенерации растений на агаровой среде.
Ключевые слова: ячмень Hordeitm vulgare L), культура пыпъников in vitro, питательная среда, агар-агар, крахмап, эмбриоидогенез, регенерация растений.
Как известно, общая схема получения андроген-ных гаплоидов предусматривает культивирование пыльников на питательной среде с целью индукции аномального многократного деления гаплоидных микроспор с образованием морфогенных структур, из которых формируются растения-регенеранты [1, 2].
Обычно процесс проходит в два этапа при использовании двух типов сред. Первая среда - индукционная - содержит комплекс физиологически активных веществ, стимулирующих отклонение микроспор от гаметофитного пути развития, их многократное деление и дальнейший каллусогенез или эмбриоидогенез. Состав второй среды - регенерационной - способствует регенерации растений из перенесенных на нее морфогенных структур микроспориального происхождения. При этом наиболее быстрым и экономически выгодным путем получения гаплоидов является эмбриоидогенез - образование биполярных структур с синхронным развитием апексов корня и стебля непосредственно из многоклеточных микроспор (прямой эмбриоидогенез) или из эмбриогенного каллуса (непрямой эмбриоидогенез) [3].
Следует отметить, что высокая регенерационной способность эмбриоидов, которые могут прорастать на индукционной среде, позволяет получать гаплоиды без использования регенерационной среды, что существенно уменьшает трудоёмкость и способствует экономии материалов.
Нами впервые установлено, что замена агар-агара химически модифицированными [4, 5] и естественными крахмалами [6, 7] в индукционной среде способствовала повышению частоты прямого эмбриои-догенеза и регенерации растений в культуре in vitro пыльников ячменя ярового. В связи с этим целью исследований было изучение возможности одноэтапного получения гаплоидов этого вида растений на крах-малсодержащих средах и определение влияния плотности инокуляции пыльников на эффективность гаплопродукционного процесса.
Белинская Елена Владимировна, к.б.н., ведущий научный сотрудник, e-mail: bilinska(a!ukr.net
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве модельного генотипа была использована линия ячменя ярового (Hordeum vulgare L.) ДГ00-126, полученная методом культуры пыльников in vitro на основе Fi гибрида Харьковский 74><Экзотик и характеризующаяся высокой частотой образования эмбриоидов, эмбриогенного каллуса и нормально пигментированных растений-регенерантов [8].
Растения, служившие донорами пыльников, выращивали в полевых условиях. Отбор, предобработка колосьев и получение асептической культуры пыльников были проведены по методикам, опубликованным ранее [9, 10].
Пыльники культивировали на индукционных питательных средах [10], различающихся гелеобразую-щими компонентами. В частности, NMS\icu.2 содержала 0,8% агар-агара («Difco», США); NMSsu; - 6,5% кукурузного крахмала, полученного из зерна линии АС-11, которая является носителем естественной мутации гена структуры эндосперма su 2 [7]; NMSsa -12,0% химически модифицированного крахмала Д-5а [5]. Препараты крахмалов были любезно предоставлены С.М. Тымчуком и П.Г. Дульневым.
Пыльники помещали в стеклянные пробирки (10x150 мм) или стерильные пластиковые чашки Петри (d=35 мм). В каждую пробирку на «косячок» среды и в чашку Петри высаживали по 30-45 шт пыльников, вычлененных из одного колоса. В эксперименте по изучению влияния на показатели гаплопродукции плотности инокуляции пыльников в одну пробирку высаживали пыльники, изолированные из половины колоса.
Наблюдения за индукцией и развитием морфогенных структур проводили через каждые 5-7 сут, начиная с 20-х сут с момента инокуляции пыльников. Последний подсчет количества морфогенных пыльников в обоих вариантах опыта был проведен на 35 сут от начала культивирования пыльников, после чего в контроле была проведена пересадка каллуса и эмбриоидов на среду для регенерации. Подсчет растений-
регенерантов был проведен через две недели после
1571
пересадки в контроле и одновременно в варианте «без пересадки».
Регенерационная среда содержала соли макро- и микроэлементов по Мурасиге и Скугу [11], а также (в мг/л): мио-инозитол - 100; витамины Bl, В6 и РР - по 0,5; ИУК и БАП - по 0,2, (витамины и фитогормоны -«Serva», Германия); глутамин - 100 («PRS-CODEX», Испания); сахарозу - 30 г/л («Merck», Германия), агар-агар - 0,8% («Difco», США); рН 5,7-5,8.
Показателями эффективности экспериментального андрогенеза in vitro служили количество морфоген-ных пыльников, зеленых и хлорофиллдефектных растений в процентах от общего количества пыльников, высаженных на среду. В варианте «без пересадки» также было определено количество дифференцированных эмбриоидов, которые не проросли.
Результаты эксперимента (табл. 1) свидетельствуют о том, что в целом не удалось решить поставленную задачу по получению растений без пересадки морфогенных структур на регенерационную среду. Отсутствие достоверных различий по количеству эмбриогенных пыльников на средах с однотипным гелеобразователем можно считать подтверждением одинаковых стартовых условий про-
Экспериментальные данные обработаны при помощи методов дисперсионного анализа и вариационной статистики [12] с использованием пакета программ «ОСГЭ».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Наблюдения показали, что через 20 сут после инокуляции пыльников на питательную среду имело место интенсивное образования морфогенных макроструктур - каллуса и эмбриоидов на всех средах. Затем в пробирках с агаровой NN/18 мод. 2 и крахмалсо-держащей средой ЫМБвиз. которые были оставлены для обноэтапного получения гаплоидов, происходило разрастание каллуса с формированием сплошной массы, среди которой были видны эмбриоды, и пророс-тание последних з образованием растений-регенерантов (рис. 1)
цесса регенерации растений. Однако высокая частота индукции андрогенных структур и интенсивный рост каллуса, которые свойственны линии ДГ00-126, при ограниченной площади питания в вариантах «без пересадки» привели, очевидно, к конкуренции между ними и потере способности к регенерации, в том числе и эмбриоидами. Так, на обеих средах не проросло более 22% эмбриоидов.
а) б)
Рис. 1. Регенерация растений в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 на индукционной среде: а -химически модифицированным крахмалом Д-5а; б - с агар-агаром через 40 сут после инокуляции пыльников
Таблица 1. Индукция морфогенных структур и регенерация растений в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 в зависимости от способа регенерации растений и гелеобразующего компонента питательной среды (2009 г.)
Среда Высажено пыльников, шт. Получено
морфогенных пыльников зеленых растений-регенерантов растений-альбиносов количество эмбриоидов3
шт. % шт. % шт. % %
М/КмодДп)1 248 102 41,13 66 26,61 37 14,92 -
NMSMOfl.2 (бпУ 152 56 36,84 23 15,13 44 28,97 23,11
NMSsu2(H)1 225 74 32,89 88 39,11 24 10,67 -
NMSSU2(6H)2 167 52 31,13 15 8,98 16 9,58 22,15
HCPos 9,45 8,17 6,98 -
Прим. NMSMOfl.2 - 0,8 % агар-агара; NMSsib - 6,5 % кукурузного крахмала типа su2. 1 - морфогенные структуры пересаживали на среду для регенерации; 2 - регенерация происходила на индукционной среде без пересадки; 3 - эмбриоиды, которые не проросли на индукционной среде
1572
Следует отметить, что более интенсивный рост каллуса наблюдался на среде, содержавшей ьи2 -крахмал, и следствием «перерастания» культуры было многократное уменьшение частоты регенерации растений. Поскольку в ходе эксперимента выяснилось, что проблемой одноэтапного получения гаплоидов ячменя является высокая интенсивность роста каллуса с низкой регенерационной способностью, который заполняет весь объем пробирки, препятствуя реализации морфогенетического потенциала культуры, логичными шагами в направлении повышения выхода растений-регенерантов представлялось использование компонентов питательной среды, которые снижают скорость нарастания каллусной массы, а также увеличение площади питания за счет уменьшения плотности инокуляции пыльников.
Принимая во внимание то, что на питательных средах, которые содержали вместо агар-агара химически модифицированные крахмалы, наряду со
стимуляцией прямого эмбриоидогенеза снижался рост каллуса [7, 8], один из этих препаратов - Д-5а — был использован для разработки методики одно-этапного получения гаплоидов ячменя. В качестве культуральных сосудов были использованы чашки Петри, что обеспечивало большую площадь питания доя развивающихся морфогенных структур.
Исследования показали, что увеличение площади питания на агаровой среде привело к нивелированию различий по показателям гаплопродукции в вариантах «пересадка» и «без пересадки» андро-генных структур на среду для регенерации (табл. 2). При использовании химически модифицированного крахмала Д-5а в индукционной среде в сочетании с пересадкой морфогенных структур на реге-нерационную среду с агаром отмечено существенное возрастание частоты регенерации зеленых растений. В то же время при обноетапном получении гаплоидов эффективность регенерации была почти в 8 раз ниже.
Таблица 2. Индукция морфогенных структур и регенерация растений в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 в зависимости от способа регенерации растений и гелеобразующего компонента питательной среды (2010 г.)
Среда Высажено пыльников, шт. Получено
морфогенных пыльников зеленых растений-регенерантов растений-альбиносов
шт. % шт. % шт. %
NMSMOfl.2(n)' 304 144 47,36 81 26,64 16 5,26
NMSMOfl.2 (бп)2 382 187 48,95 99 25,91 13 8,15
NMSsa (п)1 383 149 38,90 216 56,39 55 14,36
NMSsa (бп)2 309 129 41,74 23 7,44 13 4,21
HCPos 3,69 3,13 0,97
Прим. 1ЯМ8мод.2 - 0,8 % агар-агара; 1ЯМ85а - 12,0 % химически модифицированного крахмала Д-5а. 1 - морфогенные структуры пересаживали на среду для регенерации; 2 - регенерация происходила на индукционной среде без пересадки
Это было связано с тем, что гель из крахмала Д-5 а обладал более низкой по сравнению с агаровым водоудерживающей способностью, и высыхание среды снижало частоту прорастания эмбриодов (не проросло более 45 % эмбриодов). Следует отметить, что на среде, содержавшей крахмалД-5а, формировались более мелкие эмбриоды, значительная часть которых прекращала развитие на глобулярной стадии (рис. 1). В варианте «пересадка» такие структуры переносили на агаровую среду для регенерации вместе с пыльником, что способствовало их дифференциации и прорастанию с формированием растений нормальной морфологии, лишенных, к тому же, признаков витрификации.
Ввиду высокой стоимости стерильных чашек Петри одноразового использования, был проведен эксперимент по изучению влияния на эффективность регенерации растений плотности инокуляции пыльников с применением в качестве культуральных сосудов пробирок. Как видно из результатов, представленных на рис. 2, при культивировании на среде с агар-агаром пыльников, изолированных из одного колоса с пересадкой полученных андроген-ных структур на регенерационную среду (КП) и без
пересадки (КБП), а также в аналогичных вариантах, но с инокуляцией на среду пыльников, вычлененных их половины колоса С/г КП и 1А КБП), получены сравнимые результаты по количеству морфогенных пыльников. Однако при снижении плотности высаженных пыльников (варианты 1А КП и 1/г КБП) отмечено существенное увеличение частоты регенерации нормально пигментированных растений, обусловленное более благоприятными условиями для дифференции и прорастания эмбриои-дов.
Впервые изучена возможность одноэтапного получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников in vitro при использовании в качестве гелеобразо-вателей индукционной среды агар-агара, высоко-амилозного кукурузного крахмала из зерна линии-носителя мутантного гена структуры эндосперма sii2 и химически модифицированного крахмала Д-5 а. На средах с агар-агаром и кукурузным крахмалом в вариантах без пересадки морфогенных структур на регенерационную среду отмечен активный рост неэмбриогенного каллуса, что привело к снижению регенерационной способности культуры. Замена агар-агара химически модифицирован-
1573
ным крахмалом Д-5а угнетала дифференциацию и прорастание эмбриоидов на индукционной среде, но в то же время способствовала существенному увеличению частоты регенерации растений при пересадке морфогенных структур на регенерацион-
ную среду с агар-агаром. Одноэтапное получение гаплоидов ячменя может быть достигнуто при снижении плотности инокуляции пыльников на агаровой среде.
60 -,
J50
•е-&
40 30 -I-20 -10 --
КП
КБП 1/2 К П 1/2КБП
Соцветие, способ регенерации
100 80
60 40
20 --
КП
КБП 1/2 К П 1/2КБП
Соцветие, способ регенерации
а) б)
Рис. 2. Индукция морфогенных структур (а) и регенерация растений (б) в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 в зависимости от плотности инокуляции пыльников на питательную среду и способа регенерации. К - изолированы пыльники одного колоса, Vi К - половины колоса; П - пересадка морфогенных структур; БП - без пересадки
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Jahne-Gartner А., Lortz Н. Protocols for anther and microspore culture of barley // Methods in Molecular Biology. Plant Cell Culture Protocols / Edit. R.D. Hall. Totowa: Yumana Press Inc., 1995. V. 111. P. 269-271.
2. Szarejko I. Anther culture for doubled haploid production in barley (Hordeum vulgare L.) // Doubled haploid production in crop plants / Ed. M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster, I. Szarejko. Dordrecht: Kluwer academic publishers, 2003. P. 3542.
3. Батыгина ТБ. Хлебное зерно / Отв. ред. М.С. Яковлев. Л.: Наука. 1987. 103 с.
4. Белинская Е.В., Дульнее П.Г. Модифицированный крахмал как компонент питательной среды для получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников in vitro // Физиология и биохимия культурных растений. 2007. Т. 39. № 2. С. 136-143.
5. Белинская Е.В., Дульнее П.Г. Особенности морфогенеза в культуре in \itro пыльников ярового ячменя на средах с химически модифицированными крахмалами // Физиология и биохимия культурных растений. 2012. Т. 44. № 5. С. 440^148.
6. Белинская Е.В., Тъшчук С.М., Дульнее П.Г.. Деребизоеа О.Ю. Использование высокоамилозного крахмала в питательной среде для культивирования пыльников ячменя //
Физиология и биохимия культурных растений. 2009. Т. 41. № 6. С. 539-546.
7. Бшинсъка О.В. Застосування кукурудзяних крохмал1в з шдвищеним BMicTOM амшози (мутацп ае i sui ) у склад! штучного живильного середовища для одержання гапло1дов ярого ячменю у культур! пилягав in vitro // Вюник Харювського нацюнального ушверситету ¡м. В.Н. Каразша. Сер1я: бюлогш. 2010. Вип. ll'(№905). С.'60-65.
8. Белинская Е.В. Влияние элементов технологии гаплоидной индукции на проявление генотипических особенностей морфогенеза в культуре пыльников in vitro ярового ячменя // Цитология и генетика. 2010. Т. 44. № 2. С. 38-44.
9. Бшинсъка О.В. Генотипов! особливое^ шдукцп гапло1дов ячменю (Н. vulgare L.) методом культури пилягав in vitro: Автореф. дис. ... канд.. бюл. наук. Харгав, 1997. 19 с.
10. Белинская Е.В. Наследование способности к андрогенезу in vitro у ярового ячменя // Цитология и генетика. 2008. Т. 41. №4. С. 27-37.
11. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for growth and bio-assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.
12. Плохинский НА. Биометрия. M.: Изд. Московского университета, 1964. 367 с.
EFFICIENCY OF ANDROGENETIC HAPLOID PRODUCTION DEPENDING ON A MODE OF PLANT REGENERATION, MEDIUM COMPOSITION AND ANTHER INOCULATION DENSITY
©2013 E.V. Belinskaya
Yuijev Plant Production Institute of NAAS of Ukraine, Kharkov
The possibility of the one step plant production in spring barley anther culture in vitro via agar substitution for native com starch obtained from the seeds of line which was a carrier of the mutant endosperm structure gene suj and a comically modified starch D-5a has been investigated. Hie effect of anther inoculation density on the efficiency of the haploid production process has also been studied. It has been shown that on the media possessing starches the lowering of the regeneration frequency was conditioned by a high intensity of nonenibryogenic callus growth (sii2-starch) or by a suppression of embryoid growth and development (chemically modified starch). A reduction of anther inoculation density has promoted a frequency of plant regeneration on agar solidified medium.
Keywords: barley Hordeum vulgare L., anther culture in vitro, nutrient medium, agar, starch, embryoid production, plant regeneration.
Belinskaya Elena, Candidate of Biology, leading researcher, email: bilinska(a!ukr.net
1574
