CC BY
20
УДК 616.36-005.4-089.843-092.9
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ФИБРОБЛАСТОВ, КСЕНО- И АЛЛОГЕННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ БЕЛКОВ В КОРРЕКЦИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ОСТРОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕПАТОПАТИИ
Разумова М.С., Литвинова Е.С., Гаврилюк Е.В.
ФГБОУ ВО Курский государственный медицинский университет, г. Курск, Российская Федерация
Аннотация. Проблема диагностики и терапии острых заболеваний печени продолжает оставаться актуальной и в настоящее время из-за сложности дифференциальной диагностики и оптимального выбора эффективных способов лечения на фоне продолжающегося роста количества пациентов данной нозологией. Целью исследования явилось установление эффективности культуральной жидкости фибробластов, ксено- и аллогенных гепатоцитов и выделенных из них белков в коррекции метаболических нарушений при острой токсической гепатопатии. Использование культуральной жидкости аллогенных гепатоцитов, ксеногенных гепатоцитов и фибробластов и особенно выделенных из них их белков в условиях острого токсического поражения печени (ОТПП) позволило эффективно корригировать нарушения метаболического статуса на системном уровне. Ключевые слова: культуральная жидкость, аллогенные гепатоциты, фибробласты, ксеногенные гепатоциты.
Проблема диагностики и терапии острых заболеваний печени продолжает оставаться актуальной и в настоящее время из-за сложности дифференциальной диагностики и оптимального выбора эффективных способов лечения на фоне продолжающегося роста количества пациентов данной нозологией [1-3]. Неудовлетворительные результаты лечения острого токсического поражения печени (ОТПП) во многом связывают с отсутствием эффективной патогенетической терапией [4-6], поэтому перспективным направлением в лечении таких состояний является использование клеточных технологий, а именно культуральной жидкости ксенно-, аллогенных гепатоцитов и фибробластов [7, 8].
Целью исследования явилось установление эффективности культуральной жидкости фибробластов, ксено- и аллогенных гепатоцитов и выделенных из них белков в коррекции метаболических нарушений при острой токсической гепатопатии.
Материал и методы исследования. ОТПП у 89 крыс-самцов Вистар проводили путем внутримышечного его введения в дозе 3 мл/кг в виде 50% раствора в оливковом масле пятикратно с интервалом 24 ч [2]. С целью получения культуральной жидкости ксеноген-ных и аллогенных гепатоцитов (КЖКГ, КЖАГ) в среде 199 культивировали 5х107 клеток на 3 мл среды в течение 6 ч. После истечения срока инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин при 400 g). Концентрацию белка в культуральной жидкости определяли по методу Къельдаля. Полученную КЖАГ и
КЖКГ вводили с первой инъекцией ЧХУ пятикратного (с 24-часовым интервалом) внутрибрюшинно из расчета 5 мг/кг белка. Полученную культуральную жидкость ФБ (КЖФБ) вводили внутрибрюшинно в объеме 5 мг/кг крысам с ОТПП, одновременно с первой инъекцией ЧХУ.
Для получения белков из 50-100 мл культуральной жидкости их осаждали равным объемом 10% трухук-сусной кислоты, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение 20 мин. при 1500 g. После отделения надосадка, осадок разводили в физиологическом растворе и диализовали в двух сменах фос-фатно-солевого буфера рН 7,2-7,4 в течение 18 часов. После определения концентрации белка и доведения его 0,9% раствором хлористого натрия до 5 мг/мл, полученный раствор фильтровали через стерилизацион-ные мембраны 0,2 мкм, расфасовывали в стерильные флаконы по 2 мл и лиофилизовали на установке лио-фильной сушки «УТОГ^».
Полученные белки КЖКГ, КЖАГ или КЖФБ вводили с первой инъекцией гепатотропного яда пятикратного (с 24-часовым интервалом) внутрибрюшинно крысам с ОТПП из расчета 5 мг/кг белка.
Для оценки функции гепатоцитов, в плазме крови определяли активность аспартат- и аланинаминотранс-фераз (АСТ, АЛТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гам-маглутаминтранспептидазы (ГГТ), содержание билирубина (БР), протромбиновый индекс (ПТИ) и тимоловую пробу концентрацию фибриногена (ФГ). Функционально-метаболическую активность нейтрофилов
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
крови оценивали по фагоцитарному показателю (ФИ), фагоцитарному числу (ФЧ), реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию в плазме крови и эритроцитах ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА), образующих с тиобарбитуровой кислотой окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом. Уровень стабильных метаболитов оксида азота (СМoN) выявляли с использованием двух аналитических операций: измерение эндогенного нитрита и превращение нитрата в нитрит с использованием нитрит-редуктазы.
Существенность различий оценивали по ^ критерию ф<0,05).
Результаты исследования. Острая интоксикация ЧХУ вызывает развитие основных биохимических синдромов поражения печени: цитолиза (увеличение активности АСТ, АЛТ, снижение коэффициента де Ри-тиса), внутри- и внепеченочного холестаза (повышение активности ЩФ и ГГТ), внутриклеточного холе-стаза с желтухой и токсическим поражением гепатоци-тов (увеличение содержания БР, активности АЛТ, АСТ, ЩФ, ГГТ), недостаточности синтетических процессов (снижение ПТИ и ФБ).
При оценке оксидантных показателей плазмы крови экспериментальных животных с ОТПП установлена активация процессов ПОЛ (повышение уровня МДА и АГП), снижение показателей антиоксидантной защиты (ОАА, активность СОД и Кат) и содержания СМсж. У крыс с ОТПП, без или с введение культураль-ной среды 199, выявлено повышение всех изученных
показателей функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови, а именно, кислородзависимой (повышение НСТ-сп., НСТ-ст. н/з, НСТ-ст. о/з, КАн, КАо, КО) и фагоцитарной активности (повышение ФИ, ФЧ и ИФА).
При количественном сопоставлении числа нарушенных исследованных лабораторных параметров выявлено, что отравление ЧХУ в течение 5 дней приводит к изменению 100% показателей, характеризующих биохимические синдромы поражения гепатоцитов, развитие оксидантного стресса и нейтрофилов периферической крови.
При анализе по уровню с делением глубины нарушений по степеням, что более показательно и значимо по сравнению с абсолютными цифрами выявлено, что
I степень нарушений имели 7 (21,9%), а II и III соответственно 12 (37,5%) и 13 (40,6%) показателей, что требует введения применения фармакологических или других методов коррекции (табл. 1).
Применение КЖФБ у животных с ОТПП снижало количество измененных показателей до 23 (71,9%), при этом их деление по глубине изменений сдвигалось в сторону показателей с I степенью нарушений (39,1%), а изменения II и III степени выявлено соответственно в 34,4% и 9,4% исследованных параметров. Использование КЖКГ оказалось более эффективным, так как в условиях токсического поражения печени изменения показателей с I степенью коснулись 78,1%, а
II и III соответственно 28,1% и 3,1%. КЖАГ оказала еще большее позитивное влияние на изменения метаболических лабораторных параметров: 31,3% показателей изменено с I степенью и 15,6% со II (табл. 1).
Таблица 1
Сравнительное влияние культуральных жидкостей аллогенных, ксеногенных гепатоцитов и фибробластов на параметры функциональной активности гепатоцитов, нейтрофилов и метаболический статус периферической крови при остром токсическом поражении печени
Условия Измененные Измененные показатели по степени расстройств
эксперимента показатели I II III
Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %
Введение ЧХУ 32 100 7 21,9 12 37,5 13 40,6
Введение ЧХУ и КЖФБ 23 71,9 9 39,1 11 34,4 3 9,4
Введение ЧХУ и КЖКГ 25 78,1 15 46,9 9 28,1 1 3,1
Введение ЧХУ и КЖАГ 15 46,9 10 31,3 5 15,6 - -
Далее мы сравнили эффективность влияния белков культуральных жидкостей аллогенных, ксе-
ногенных гепатоцитов и фибробластов на лабораторные параметры, характеризующие наличие острого токсического поражения печени (табл. 2).
Таблица 2
Сравнительное влияние белков культуральных жидкостей аллогенных, ксеногенных гепатоцитов и фибробластов на параметры функциональной активности гепатоцитов, нейтрофилов и метаболический статус периферической крови при остром токсическом поражении печени
Условия Измененные Измененные показатели по степени расстройств
эксперимента показатели I II III
Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %
Введение ЧХУ 16 100 2 12,5 5 31,3 9 56,3
Введение ЧХУ и белков КЖФБ 13 81,3 6 37,5 3 18,8 4 25
Введение ЧХУ и белков КЖКГ 10 62,5 3 18,8 5 31,3 2 12,5
Введение ЧХУ и белков КЖАГ 7 43,8 5 31,3 2 12,5 - -
Выявлено, что белки КЖАГ обладают наибольшей корригирующей эффективностью в отношении показателей функционально-метаболической активности гепатоцитов и оксидантного статуса. Меньшей эффективность обладают белки КЖКГ, еще в меньшей мере корригируют нарушенные метаболические параметры белки КЖФБ. После применения белков КЖАГ из 100% измененных под влияние ЧХУ показателей осталось 43,8%, из которых с I степенью 31,3% и со II степенью 12,5%. Меньшей эффективность обладают белки КЖКГ, еще в меньшей мере корригируют нарушенные метаболические параметры белки КЖФБ (табл. 2).
Выводы. Таким образом, при анализе корригирующей активности КЖ или белков КЖ фибробластов, ксено- и аллогенных гепатоцитов на развитие биохимических маркеров острого токсического поражения печени, нарушение функциональной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови, внутриэритроцитарного метаболизма, активацию свободно-радикального окисления, по степени возрастания эффективности установлена следующая последовательность: культуральная жидкость фибробластов или белков КЖФБ ^ культуральная жидкость ксеногенных гепатоцитов или белки КЖКГ ^ культураль-ная жидкость аллогенных гепатоцитов или белки КЖАГ.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Евсеева М.Н., Шептулина А.Ф., Рубцов Ю.П. Перспективы создания аутологичных гепатоцитов для лечения печеночной недостаточности // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2015. №6. С. 49-57.
[2] Терехова С.В., Литвинова Е.С., Быстрова Н.А., Гаври-люк В.П. Иммунометаболический статус у интактных животных при введении культуральной жидкости аллогенных гепатоцитов, гептрала и мексикора // Врач-аспирант. 2012. Т. 52. № 3.2. С. 315-319.
[3] Онищенко Н.А., Люндуп А.В., Газизов И.М., Деев Р.В., Шагидулин М.Ю., Крашенинников М.Е., Аврамов П.В. Двухфазная динамика воздействия мезенхимальных мультпатентных стромальных клеток (ММСК) костного мозга на печень при моделировании фиброзирую-щего гепатита // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2011. Т. XIII. №3. С. 51-59.
[4] Терехова С.В., Быстрова Н.А., Литвинова Е.С., Гаври-люк Е.В. Коррекция аллогенными гепатоцитами имму-нометаболических нарушений при экспериментальной ишемии печени // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2012. Т. 11. № 2. С. 414-417.
[5] Забродский П.Ф., Громов М.С., Масляков В.В. Коррекция токоферола ацетатом и унитолом нарушений иммунного гомеостаза крыс при острой интоксикации тетрахлорметаном // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. Т. 78. №1. С. 30-33.
[6] Терехова С.В., Быстрова Н.А., Литвинова Е.С., Гаври-люк Е.В. Фармакологическая коррекция иммуномета-болических нарушений гептралом и мексикором у животных на фоне ишемического поражения печени // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. 2012. Т. 20. № 22-1. С. 179-182.
[7] Бердалинова А.К., Умбетов Т.Ж., Комекбай Ж.Е. Морфология печени при хронической интоксикации организма тетраборатом натрия // Наука и здравоохранение. 2015. № 3. С. 89-97.
[8] Медведева С.Ю., Мухлынина Е.А., Булавинцева Т.С., Данилова И.Г. Участие фактора стволовой клетки в ре-паративной регенерации печени при ее токсическом повреждении // Медицинская иммунология. 2015. Т. 17. С. 32.
ALLOGENEIC AND XENOGENEIC HEPATOCYTES AND ISOLATED FROM PROTEINS IN THE CORRECTION OF METABOLIC DISORDERS IN ACUTE TOXIC HEPATOPATHY
Razumova M.S., Litvinova E.S., Gavrilyuk E.V.
Kursk State Medical University, Kursk, Russian Federation
Annotation. The problem of diagnostics and therapy of acute liver diseases continues to be relevant in the present time due to the complexity of differential diagnosis and optimal choice of effective methods of treatment against the background of continuing growth in the number of patients with this nosology. The aim of the study was to determine the effectiveness of the culture fluid of the fibroblasts, xeno- and allogenic hepatocytes and isolated from proteins in the correction of metabolic disorders in acute toxic hepatopathy. The use of the culture fluid of hepatocytes allogeneic, xenogeneic hepatocytes and fibroblasts, and especially a dedicated one of their proteins in the acute toxic liver injury has allowed effective to treat the disorders of the metabolic status at the system level. Key words: culture liquid, allogenic hepatocytes, fibroblasts, xenogeneic hepatocytes.
REFERENCES
[1] Evseeva M.N., Sheptulina A.F., Rubtsov Yu.P. The prospects for the creation of autologous hepatocytes for treatment of liver failure // Rossiyskiy zhurnal gastroenterology, gepatologii, koloproktologii. 2015. №6. S. 49-57.
[2] Terekhova S.V., Litvinova E.S., Bystrova N.A., Gavrilyuk V.P. Immune and metabolic status in the intact animals with the introduction of the culture fluid of allogeneic hepato-cytes, Heptral and Mexicor // Vrach-aspirant. 2012. T.52. № 3.2. S. 315-319.
[3] Onishchenko N.A., Lyundup A.V., Gazizov I.M., Deev R.V., Shagidulin M.Yu., Krashe-ninnikov M.E., Avramov P.V. Two-phase dynamics impact multipotent mesenchy-mal stromal bone marrow cells on the liver when modeling fibroporous hepatitis // Vestnik transplantologii i is-kusstvennykh organov. 2011. T. XIII. №3. S. 51-59.
[4] Terekhova S.V., Bystrova N.A., Litvinova E.S., Gavrilyuk E.V. Correction allogeneic hepatocytes immunopatolog-icheskih disorders in experimental ischemia of the liver //
Sistemnyy analiz i upravlenie v biomeditsinskikh siste-makh. 2012. T.11. №2. S. 414-417.
[5] Zabrodskiy P.F., Gromov M.S., Maslyakov V.V. Correction of tocopherol acetate and unicolor disorders of immune homeostasis rats with acute carbon tetrachloride intoxication // Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2015. T.78. №1. S. 30-33.
[6] Terekhova S.V., Bystrova N.A., Litvinova E.S., Gavrilyuk E.V. Pharmacological correction of violations of im-munopatologicheskih Heptral and Mexicor in animals on a background of ischemic liver injury // Nauchnye vedomosti Belgorodskogo gosudar-stvennogo universiteta. Seriya: Meditsina. Farmatsiya. 2012. T.20. №22-1. S. 179-182.
[7] Berdalinova A.K., Umbetov T.Zh., Komekbay Zh.E. The morphology of the liver in chronic intoxication with sodium tetraborate // Nauka i zdravookhranenie. 2015. №3. S. 8997.
[8] Medvedeva S.Yu., Mukhlynina E.A., Bulavintseva T.S., Danilova I.G. Part of the factor of stem cells in reparative regeneration of the liver in its toxicity // Meditsinskaya im-munologiya. 2015. T. 17. S. 32.
