CC BY
44
Для корреспонденции
Костылева Елена Викторовна - кандидат технических наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии
новых продуцентов гидролитических ферментов ВНИИПБТ -
филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 111033, Российская Федерация, г. Москва,
ул. Самокатная, д. 4б
Телефон: (495) 362-33-71
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-4775-303X
Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Минеева Д.Т., Цурикова Н.В.
Эффективность ферментного препарата на основе нового мутантного штамма Bacillus subtilis-96 при гидролизе белков молочной сыворотки
Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии -филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033, г. Москва, Российская Федерация
All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology - a branch of the Federal Research Center of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 111033, Moscow, Russian Federation
Белки молочной сыворотки и куриного белка характеризуются высокой пищевой ценностью, но при этом они обладают антигенными свойствами, что ограничивает их применение в производстве специализированных пищевых продуктов для диетического питания. Существенному снижению аллергенности белков способствует ферментативный гидролиз, эффективность которого зависит от специфичности используемых протеаз.
Цель работы - определение эффективности ферментного препарата (ФП-96) на основе штамма Bacillus subtilis-96 при гидролизе белков молочной сыворотки и яичного белка в сравнении с коммерческими препаратами бактериальных протеаз - алкалазой, нейтразой и протосубтилином.
Материал и методы. В качестве субстратов использовали концентраты сывороточного и яичного белка. Для гидролиза применяли коммерческие фер-
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2022-2024 гг. (тема № 0410-2022-0006).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Минеева Д.Т., Цурикова Н.В. Эффективность ферментного препарата на основе нового мутантного штамма Bacillus subtilis-96 при гидролизе белков молочной сыворотки и яичного белка // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 2. С. 72-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-2-72-80 Статья поступила в редакцию 19.10.2021. Принята в печать 14.03.2022.
Funding. The research was carried out at the expense of a subsidy for the fulfillment of the state assignment under the Program of Fundamental Scientific Research of the State Academies of Sciences for 2022-2024 (topic No. 0410-2022-0006). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
For citation: Kostyleva E.V., Sereda A S., Velikoretskaya I.A., Mineeva D.T., Tsurikova N.V. Efficiency of an enzyme preparation obtained from a new mutant Bacillus subtilis-96 strain in the hydrolysis of whey and egg white proteins. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (2): 72-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-2-72-80 (in Russian) Received 19.10.2021. Accepted 14.03.2022.
и яичного белка
Efficiency of an enzyme preparation obtained from a new mutant Bacillus subtilis-96 strain in the hydrolysis of whey and egg white proteins
Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Mineeva D.T., Tsurikova N.V.
ментные препараты - алкалазу, нейтразу и протосубтилин, а также опытный образец ферментного препарата на основе нового мутантного штамма Bacillus subtilis-96 с сопоставимыми значениями протеолитической активности. Гидролиз проводили при концентрации субстратов 100 г/дм3 в течение 3 ч при 55 °С или в течение 24 ч при 50 °С. После гидролиза реакционную смесь инкубировали при 90 °С в течение 15 мин для инактивации ферментов. В полученных гидролизатах определяли содержание пептидов с молекулярной массой <10 кДа. Гидролиз основных аллергенных белков оценивали по исчезновению соответствующих белковых полос на электрофореграммах супернатантов гидролизатов. Результаты. Все исследуемые препараты показали высокую эффективность при гидролизе белков молочной сыворотки и обеспечили выход низкомолекулярных пептидов на уровне 18,8-22,8% через 3 ч гидролиза и 39,4-41,6% через 24 ч. В электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия показано присутствие остаточного количества белка с молекулярной массой около 14 кДа, соответствующей а-лактоальбумину, через 3 ч гидролиза препаратом нейтральной протеазы - нейтразой. Препараты, содержащие сериновую протеазу, в том числе ФП-96, обеспечили более интенсивный гидролиз белков молочной сыворотки. При гидролизе яичного белка нейтраза, наоборот, показала наибольшую эффективность. ФП-96 практически не уступал нейтразе как по выходу низкомолекулярных пептидов, так и по интенсивности расщепления основных аллергенных белков. Эффективность препаратов с превалирующим содержанием сериновой протеазы (алкалазы и протосубтилина) была существенно ниже. Заключение. Оптимальное соотношение нейтральной и сериновой протеаз в составе препарата ФП-96, полученного на основе нового отечественного продуцента протеаз B. subtilis-96, обеспечивает высокую эффективность и универсальность его действия при гидролизе белков молочной сыворотки и яичного белка. Рекомендованы параметры технологии гидролиза с препаратом ФП-96, обеспечивающие интенсивное преобразование основных иммуногенных белков молочной сыворотки и белка куриного яйца до растворимых и низкомолекулярных фракций (продолжительность 3 ч при температуре 55 °С и дозировке препарата не менее 2 ед протеолитической активности на 1 г субстрата) и повышение эффективности последующей ультрафильтрации при получении белковых гидролизатов, включаемых в состав специализированных пищевых продуктов.
Ключевые слова: белок молочной сыворотки; белок куриного яйца; протеазы; гидролиз
Whey and hen egg white proteins are characterized by high nutritional value, but possess antigenic properties, which limit their use in the production of dietary products. Enzymatic hydrolysis decreases significantly the allergenicity of proteins. The efficiency of hydrolysis depends on the specificity of the proteases used.
The aim of this work was to determine the effectiveness of EP-96 enzyme preparation obtained from Bacillus subtilis-96 culture liquid in the hydrolysis of whey and egg white proteins in comparison with commercial bacterial proteases preparations - Alcalase, Neutrase, and Protosubtilin.
Material and methods. Whey and egg white protein concentrates were used as substrates. Commercial enzyme preparations Alcalase, Neutrase, and Protosubtilin, and an experimental sample of EP-96 preparation obtained from Bacillus subtilis-96 culture liquid were used for hydrolysis. Hydrolysis was carried out at a substrate concentration of 100 g/L for 3 h at 55 °C or for 24 h at 50 °C. After hydrolysis, the reaction mixture was incubated at 90 °C for 15 min to inactivate the enzymes. The content of peptides with a molecular weight of less than 10 kDa was determined in the obtained hydrolysates. The hydrolysis of the main allergenic proteins was assessed by the disappearance of the corresponding protein bands on the hydrolysate supernatants electrophoregrams.
Results and discussion. All the studied preparations showed high efficiency in the hydrolysis of whey proteins and provided the yield of low molecular weight peptides at the level of 18.8-22.8% after 3 h of hydrolysis and 39.4-41.6% after 24 h. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis showed a residual amount of protein with a molecular weight of about 14 kDa, corresponding to a-lactoalbumin, after 3 h of hydrolysis when using Neutrase. The preparations containing serine protease, including EP-96, provided more intensive hydrolysis of whey proteins. In the hydrolysis of egg white protein, Neutrase showed the greatest efficiency. The efficiency of EP-96 was comparable to Neutrase both in the yield of low molecular weight peptides and in the intensity of cleavage of the main allergenic proteins. The effectiveness of preparations with predominant content of serine proteases - Alcalase and Protosubtilin was significantly lower.
Conclusion. The optimal ratio of neutral and serine proteases in the EP-96, obtained on the basis of the B. subtilis-96 strain, provided the high efficiency and its versatility in the hydrolysis of the main allergenic proteins of whey and egg white. The parameters of the hydrolysis technology using EP-96 are recommended, which provide intensive conversion of the main immunogenic proteins of whey and egg white to soluble and low molecular weight fractions (duration 3 h at a temperature of 55 °C and the proteolytic activity of the preparation is not less than 2 units per g of substrate) and an increase of subsequent ultrafiltration efficiency in the production of protein hydrolysates for foods for special dietary uses. Keywords: whey protein; egg white; proteases; hydrolysis
Белки куриного яйца (БКЯ) и молочной сыворотки характеризуются высокой пищевой ценностью и оптимальным аминокислотным составом, они широко используются для производства белковых гидролиза-тов, предназначенных для создания специализированных пищевых продуктов для диетического лечебного и профилактического питания [1-3].
Белки молочной сыворотки представлены главным образом р-лактоглобулином с молекулярной массой (ММ) около 18,3 кДа (как правило, в виде димера
с ММ 35-40 кДа), а-лактальбумином с ММ 14,2 кДа и бычьим сывороточным альбумином с ММ 66,4 кДа. Также к сывороточным белкам относятся лактоферрин с ММ 80 кДа (составляет <3% сывороточных белков) и иммуноглобулины, общее содержание которых не превышает 10% [4, 5]. Наибольшее значение для пищевой промышленности имеют р-лактоглобулин и а-лактальбумин, доля которых в сывороточных белках составляет в среднем 70-80%. Аминокислотный состав этих белков наиболее близок к аминокислотному со-
ставу мышечной ткани человека, а по содержанию незаменимых аминокислот и аминокислот с разветвленной цепью (валина, лейцина и изолейцина) они превосходят все остальные белки животного и растительного происхождения и считаются «золотым стандартом» белка в специализированном питании [4-6].
Главными компонентами БКЯ являются овальбумин с ММ 45 кДа (составляет около 54% от всех белков БКЯ), кональбумин, называемый также овотрансферрином, с ММ 77,9 к Да (12%), овомукоид с ММ 28 кДа (11%), лизоцим с ММ 14,3 кДа и овомуцин с ММ растворимой части 8,3 кДа, нерастворимой - 23 кДа (по 3,5% от всех БКЯ) [7-11]. Яичный белок отличается высоким содержанием аминокислот с разветвленной цепью и серосодержащих аминокислот, его аминокислотный скор составляет 100, чистая утилизация белка - 97%. Яичный белок снижает уровень холестерина, способствует усвоению железа и увеличению мышечной массы, благодаря чему его часто используют в спортивном питании [12, 13].
Основные белки молочной сыворотки и яичного белка обладают выраженными антигенными свойствами, что ограничивает их применение в производстве диетических продуктов [5, 14, 15]. Для снижения или устранения антигенности наиболее часто используют сочетание ферментативного гидролиза с технологией мембранной ультрафильтрации и/или нанофильтрации или термообработкой [16]. При этом ключевым этапом большинства известных технологий получения белковых гидролизатов для специализированных пищевых продуктов является ферментативный гидролиз, в результате которого антигенность снижается на несколько порядков по сравнению с исходным белком [17]. Так, в работе С.Н. Зорина и соавт. обработка концентрата белков молочной сыворотки панкреатином позволила снизить аллергенность в 2,3х103 раз, а алкалазой -в 4,7х104 раз [16]. В исследованиях в. ННСеЬгапС и соавт. в результате комбинированной обработки яичного белка протеазами и нагреванием иммунореактивность яичного белка была полностью устранена [8].
Помимо гипоаллергенности, гидролизаты в сравнении с нативными белками обладают улучшенными физиологическими и физико-химическими свойствами: они легче усваиваются, что снижает нагрузку на пищеварительную систему, растворимы в широком диапазоне рН и термоустойчивы [18, 19]. В результате гидролиза основных белков молочной сыворотки и БКЯ образуются биоактивные пептиды, проявляющие антимикробные, гипотензивные, иммуностимулирующие и антиоксидант-ные свойства, что повышает биологическую ценность гидролизатов [19, 20].
Для получения белковых гидролизатов используют ферментные препараты (ФП) животного, растительного и микробного происхождения. От выбора ФП во многом зависит экономическая эффективность процесса и качество получаемых гидролизатов. Для получения частичных гидролизатов (со средней степенью гидролиза) широко применяют ФП бактериальных протеаз. В ряде
экспериментов по гидролизу БКЯ и молочной сыворотки отечественные и зарубежные исследователи успешно использовали ФП сериновой протеазы (алкалазу) и ФП нейтральной протеазы (нейтразу) [2, 4, 16, 19, 21, 22]. В некоторых экспериментах по гидролизу молочных белков использовали отечественный препарат протосубти-лин, включающий сериновую и нейтральную протеазу и предназначенный для применения в кормопроизводстве [20, 23].
Ранее из коллекции промышленных продуцентов протеаз ВНИИПБТ нами был выбран штамм Bacillus subtilis 18 № 359, синтезирующий нейтральную протеазу бацил-лолизин и сериновую протеазу субтилизин BPN' в оптимальном соотношении, что обеспечивает эффективный гидролиз белковых субстратов с получением гидроли-затов со сниженной горечью [24]. На основе B. subtilis 18 № 359 в результате 2 этапов ультрафиолетового мутагенеза и одного этапа гамма-облучения нами был получен штамм B. subtilis-96 с увеличенной более чем в 2 раза общей протеолитической активностью при сохранении соотношения основных компонентов протео-литического комплекса [24].
Цель исследования - определение эффективности ФП на основе нового штамма B. subtilis-96 при гидролизе белков молочной сыворотки и яичного белка в сравнении с коммерческими ФП бактериальных протеаз -алкалазой, нейтразой и протосубтилином.
Материал и методы
В качестве белковых субстратов использовали концентрат сывороточного белка (КСБ) («ООО Миксэм», РФ) с содержанием белка 80%; концентрат яичного белка (АО «Птицефабрика Роскар», РФ) по ГОСТ 303632013 с содержанием белка 85%.
В работе использовали коммерческие ФП Алкалазу 2,4L и Нейтразу 0,8L (Novozymes A/S, Дания) и Прото-субтилин (ООО ПО «Сиббиофарм», РФ) с общей протео-литической активностью, определенной в соответствии с ГОСТ 20264.2-88 «Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности» (30 °С, рН 7,2), соответственно 400±30, 220±15 и 250±15 ед/мл (г). Препараты алкалаза и нейтраза рекомендованы производителем (Novozymes A/S) для применения в пищевой промышленности, в том числе для гидролиза белков молочной сыворотки и БКЯ. Протосубтилин предназначен для применения в кормопроизводстве, однако он был взят в исследование, так как является на данный момент единственным отечественным препаратом бактериальных протеаз. ФП хранили в соответствии с рекомендациями производителей - при 4 °С в пределах срока годности.
Лабораторный образец концентрированного ФП на основе B. subtilis-96 с общей протеолитической активностью 382±20 ед/г (ГОСТ 20264.2-88) был получен в результате распылительной сушки супернатанта куль-туральной жидкости штамма B. subtilis-96.
Гидролиз проводили в термостатируемом шейкере «New Brunswick™ Innova® 40/40R » (Eppendorf, Германия) с перемешиванием (250 об/мин) при концентрации субстратов 100 г/л. Дозировка ФП составляла 2 ед. протеолитической активности, определенной по ГОСТ 20264.2-88, на 1 г субстрата, что соответствует 1% ФП Алкалаза/г субстрата. Гидролиз КСБ проводили при рН 6,2 в течение 3 ч при 55 °С или 24 ч при 50 °С. Перед гидролизом раствор КСБ инкубировали 20 мин при 80 °С для повышения атакуемости белка про-теазами.
Гидролиз БКЯ проводили при рН 6,0 в течение 3 ч при 55 °С или 24 ч при 50 °С. Предобработку субстрата проводили инкубированием раствора БКЯ при 45 °С в течение 20 мин, согласно методике, разработанной D.Y. Cho и соавт. [21].
Для предотвращения микробной контаминации в вариантах с длительным гидролизом (24 ч) в реакционную смесь вносили 0,1% 0,59 М раствора ампициллина. Для инактивации и снижения антимикробной активности ампициллина к концу эксперимента применяли термообработку в течение 15 мин при 90 °С и инкубирование реакционной смеси при повышенной температуре (50 °С) в течение 24 ч. Удаление остаточных количеств ампициллина проверяли путем титрования полученных гидролизатов на чашках Петри с тест-культурой (суспензия спор Bacillus subtilis) по отсутствию влияния на интенсивность роста микроорганизма.
Следует отметить, что применение ампициллина представляется возможным только в лабораторной практике при проведении длительных экспериментов и не планируется в производственных условиях.
После гидролиза реакционную смесь инкубировали при 90 °С в течение 15 мин для инактивации ферментов. Данный режим обеспечивает отсутствие протеолитиче-ской активности в реакционной смеси. Далее гидроли-заты центрифугировали при 10 750g в течение 5 мин. В полученных супернатантах определяли содержание низкомолекулярного белка (НМБ) с ММ <10 кДа. Для этого из супернатантов удаляли белковую фракцию с ММ выше 10 кДа, используя для этого 20% раствор трихлоруксусной кислоты, осадок отделяли центрифугированием и в полученном растворе определяли концентрацию белка по методу Лоури. Содержание НМБ выражали в процентах по отношению к концентрации общего белка в субстрате.
Содержание общего белка в реакционной смеси и над-осадочной жидкости при гидролизе белковых субстратов определяли методом Кьельдаля по ГОСТ 23327-98 «Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка».
Статистическую обработку результатов, полученных не менее чем в 3 повторностях, проводили, используя программу Excel Microsoft.
Электрофоретический анализ белков супернатантов полученных гидролизатов проводили в 12% (для гидролизатов БКЯ) или 15% (для гидролизатов КСБ) по-
лиакриламидном геле, приготовленном на буфере, содержащем 25 мМ трис-глицин, pH 8,3 и додецилсульфат натрия (ДДС-Na) в концентрации 1 мг/см3, в системе Mini Protean Tetra System (Bio-Rad, США). Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим G-250 (Amresco, США).
Результаты и обсуждение
В исследованиях по получению белковых гидроли-затов из яичного и молочного белка наиболее часто используют ФП Алкалаза 2,4L и Нейтраза 0,8L. Так, применение нейтразы было наиболее эффективно при получении из молочной сыворотки биоактивных пептидов, способствующих усвоению железа [22], алкалазу успешно использовали для получения из молочной сыворотки пептидов, обладающих антиоксидантными и противовоспалительными свойствами [25, 26]. Эти ФП использовали для получения на основе КСБ гидроли-затов, обладающих различными физико-химическими свойствами [27]. При гидролизе яичного белка данные ФП также показывали высокую эффективность [2, 21]. Так, по сравнению с различными другими ФП (флаво-зим, протамекс, нейтраза, фицин, коллупулин) алкалаза показала наибольшую эффективность по выходу амин-ного азота и степени гидролиза яичного белка при рН 6,0 и 50 °С [2].
Все исследуемые ФП достаточно эффективно гидро-лизовали белки молочной сыворотки (табл. 1, рис. 1). Уже через 3 ч гидролиза основные белки-аллергены КСБ: ß-лактоглобулин и а-лактальбумин, были практически полностью прогидролизованы до низкомолекулярных пептидов. Исследуемые ФП обеспечивали выход низкомолекулярных продуктов гидролиза на уровне 18,8-22,8% через 3 ч гидролиза и 39,4-41,6% через 24 ч. Различия между вариантами по выходу НМБ при длительном гидролизе не превышали 6%, при кратковременном - 10%.
Известно, что основными компонентами наиболее широко используемых в промышленности препаратов бактериальных протеаз являются щелочные сериновые протеазы - субтилизины и/или нейтральные металло-протеазы - бациллолизины. Они обладают различной специфичностью действия, что, в свою очередь, определяет глубину и эффективность гидролиза, а также свойства получаемых продуктов гидролиза [21, 23]. Использованные в нашем эксперименте ФП характеризуются различным соотношением сериновой и нейтральной протеазы. В Алкалазе присутствует только сериновая протеаза, в Нейтразе - только нейтральная металлопротеаза, Протосубтилин и ФП-96 содержат сериновую и металлопротеазу в различных соотношениях [23]. Несмотря на незначительную разницу в эффективности гидролиза КСБ при использовании разных ФП, можно отметить незначительную тенденцию к более высокому содержанию НМБ в гидроли-затах с увеличением доли сериновой протеазы в ФП (см. табл. 1).
А/А
26,65
16,9 14,4 6,5 | 3,5 1,4
M 1
Б/B
26,65
А/А
M 1
3 4 5
16,9 14,4 6,5
3,5 1,4
И
м 1
Б/B
«Мм
М 1 2 3 4 5
116,0
5
5
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов кратковременного - 3 ч (А) и длительного - 24 ч (Б) гидролиза концентрата сывороточного белка
М - молекулярный маркер; 1 - контроль (без гидролиза); 2 - обработка алкалазой; 3 - обработка протосубтилином; 4 - обработка нейтразой; 5 - обработка ФП-96.
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов кратковременного -3 ч (А) и длительного - 24 ч (Б) гидролиза белка куриного яйца
М - молекулярный маркер; 1 - контроль (без гидролиза); 2 - обработка алкалазой; 3 - обработка нейтразой; 4 - обработка протосубтилином; 5 - обработка ФП-96.
Fig. 1. Electropherogram of the products of short-term - 3 h (A) and long-term - 24 h (B) hydrolysis of whey protein concentrate
M - molecular marker; 1 - control (without hydrolysis); 2 - treatment with Alcalase; 3 - treatment with Protosubtilin; 4 - treatment with Neutrase; 5 - treatment with EP-96.
Fig. 2. Electropherogram of the products of short-term - 3 h (A) and long-term - 24 h (B) hydrolysis of egg white protein
M - molecular marker; 1 - control (without hydrolysis); 2 - treatment with Alcalase; 3 - treatment with Protosubtilin; 4 - treatment with Neutrase; 5 - treatment with EP-96.
Данные ДДС-электрофореза показывают (см. рис. 1), что после 3 ч гидролиза нейтразой в гидролизате присутствовало остаточное количество белков с ММ около 14 кДа, соответствующей а-лактальбумину. Присутствие сериновой протеазы в ФП-96 обеспечило более высокую эффективность его действия при гидролизе КСБ по сравнению с нейтразой - на уровне алкалазы и про-тосубтилина.
При гидролизе яичного белка наблюдалась обратная зависимость, причем специфичность протеаз значительно влияла на эффективность гидролиза (табл. 2, рис. 2): алкалаза в наименьшей степени гидролизовала яичный белок, нейтраза и ФП-96 наиболее быстро и эффективно расщепляли основные аллергенные белки и обеспечивали высокий выход НМБ. Выход НМБ при использовании ФП-96, полученного на основе нового мутантного штамма В. subtilis-96, после 3 ч гидролиза на 80% превышал результат, полученный
при использовании алкалазы, и на 10,5% - результат, полученный в варианте гидролиза с протосубтилином. При длительном гидролизе (в течение 24 ч) эффективность ФП-96 по выходу НМБ на 40% превышала эффективность алкалазы и на 14,4% протосубтилина. При этом ФП-96 практически не уступал нейтразе - при кратковременном гидролизе эффективность ФП-96 по выходу НМБ составляла 89% по отношению к эффективности нейтразы, а при длительном гидролизе - 93%.
Из данных рис. 2 очевидно, что основная часть яичного белка представлена овальбумином с ММ 45 кДа. За 3 ч гидролиза расщепляется основная часть оваль-бумина, лишь в варианте с алкалазой полоса около 45 кДа осталась достаточно интенсивной и наблюдалось большое количество промежуточных продуктов гидролиза овальбумина с ММ выше 10 кДа. Во всех вариантах, кроме алкалазы, следует отметить
Таблица 1. Содержание низкомолекулярного белка (пептидов с молекулярной массой <10 кДа) в гидролизатах концентрата сывороточного белка, % к общему белку
Table 1. The content of low molecular weight protein (peptides with molecular weight <10 kDa) in whey protein concentrate hydrolysates, % of total protein
Таблица 2. Содержание низкомолекулярного белка (пептидов с молекулярной массой <10 кДа) в гидролизатах белка куриного яйца, % к общему белку
Table 2. The content of low molecular weight protein (peptides with molecular weight <10 kDa) in egg protein hydrolysates, % of total protein
Ферментный препарат (ФП) Enzyme preparation (EP) Время гидролиза / Hydrolysis time
3 ч / 3 h 24 ч / 24 h
Без ФП / Without EP 3,0±0,1 5,0±0,2
ФП-96 / EP-96 20,3±1,1 40,5±2,1
Алкалаза / Alcalase 21,6±1,1 41,6±2,1
Нейтраза / Neutrase 19,8±0,9 39,4±1,9
Протосубтилин / Protosubtilin 21,8±1,1 41,1 ±2,2
Ферментный препарат (ФП) Enzyme preparation (EP) Время гидролиза / Hydrolysis time
3 ч / 3 h 24 ч / 24h
Без ФП / Without EP 9,0±0,4 11,8±0,5
ФП-96 / EP-96 32,5±1,6 34,1 ±1,5
Алкалаза / Alcalase 18,1 ±1,0 24,4±1,1
Нейтраза / Neutrase 36,5±1,7 36,7±1,7
Протосубтилин / Protosubtilin 29,4±1,4 29,8±1,4
А/А
о <s га С: га >ч
7П
6-
5-
^ о
CD to \0 -Q
\о с^ о jfc о; с s о з- о га
eg а.
^
CD Р
4-
3-
2-
1 -
Б/B
7-,
rt.
Л
■ Тз
6-
^ о
CD СО VO -Q
5-
4-
3-
IV
V
: С : О г о
L.s
2-
1 -
I
II
IV
■ Осадок / Sediment □ Супернатант / Supernatant
Рис. 3. Содержание общего белка в осадке и в супернатантах гидролизатов концентрата сывороточного белка, полученных в результате кратковременного (А) и длительного (Б)гидролиза
I - контроль (без гидролиза); II - ФП-96; III - алкалаза; IV - нейтраза; V - протосубтилин.
Fig. 3. The content of total protein in the sediment and supernatants of hydrolysates of whey protein concentrate obtained as a result of short-term (A) and long-term (B) hydrolysis
I - control (without hydrolysis); II - EP-96; III - Alcalase; IV - Neutrase; V - Protosubtilin.
0
0
I
III
II
V
быстрое исчезновение белковой полосы выше 66,2 кДа, предположительно, соответствующей кональбумину с ММ 77,7 кДа.
Через 24 ч гидролиза в варианте с ФП-96 наблюдались две слабые полосы нерасщепленного белка на уровне 40-45 кДа, в варианте с нейтразой - более интенсивная полоса с ММ около 45 кДа, в варианте с протосубтилином в гидролизате присутствовало заметно больше нерасщепленного белка и продуктов частичного гидролиза с ММ 35-45 кДа. В варианте с использованием алкалазы, помимо полос на уровне 40-45 кДа, наблюдалось большое количество промежуточных продуктов гидролиза с ММ более 10 кДа. Данные рис. 2 свидетельствуют о том, что наиболее интенсивно аллергенные белки проги-дролизовались в вариантах с использованием ФП-96 и нейтразы.
Данные по соотношению содержания общего белка в осадочных фракциях и супернатантах полученных гидролизатов (рис. 3) показали, что достаточно большое количество белка КСБ находилось в растворимой форме. В наибольшей степени содержание белка в осадочной фракции снизилось в результате обработки ФП, содержащими сериновую протеазу: алка-лазой, протосубтилином, ФП-96 - содержание белка в нерастворенной форме в данных вариантах уже через 3 ч гидролиза сокращается на 40-45% по отношению к контролю (без ФП). Наименее эффективной при гидролизе нерастворимых белков КСБ оказалась нейтраза, при использовании которой концентрация белка в осадке снизилась только на 24%.
После термоинактивации ферментов в гидролизатах БКЯ содержится значительно больше нерастворимого
белка по сравнению с гидролизатами КСБ. Из полученных данных (рис. 4) видно, что в наибольшей степени переходу нерастворимых белков БКЯ в супернатант способствовали препараты, содержащие нейтральную металлопротеазу, - нейтраза и ФП-96. Количество нерастворимого белка после 3 ч обработки БКЯ данными препаратами снизилось более чем на 30%. Наименее эффективен был препарат сериновой протеазы - ал-калаза, при использовании которого в растворимой фракции оказалось менее 50% белка как через 3 ч, так и через 24 ч гидролиза.
Таким образом, на основании полученных данных и с учетом экономической целесообразности для процесса гидролиза белков молочной сыворотки и БКЯ препаратом ФП-96 на основе нового отечественного продуцента протеаз можно рекомендовать ускоренный гидролиз в течение 3 ч при температуре 55 °С для исключения необходимости внесения антибиотиков, при дозировке препарата из расчета 2 ед протеолитиче-ской активности на 1 г субстрата. Данные параметры процесса обеспечивают интенсивное преобразование основных иммуногенных белков молочной сыворотки и БКЯ, увеличение содержания растворимых и низкомолекулярных белковых фракций в гидролизатах, что повысит эффективность ультрафильтрации при получении белковых гидролизатов, включаемых в состав специализированных пищевых продуктов.
Выбранные параметры позволят при обработке КСБ получить гидролизаты, содержащие более 90% растворимого белка, в том числе более 20% низкомолекулярных пептидов. В гидролизатах БКЯ растворимый белок составляет около 55%, более 30% белка представлено низкомолекулярными пептидами.
А/А
g 6
: ■à'
s §
: о
' й > -о
5-
4-
3-
2-
1 -
Б/B
О
6п
il
i
il
i
il
« о = -Î3
5-
i
i
il
te
^ о
CD СО
\0 -Q
4-
3-
\o С ° Ä
^ s s p
о cö c-
2-
■Ü
1 -
IV
V
I _
il
à
Éi
ri
à
11
I
II
III IV
■ Осадок / Sediment □ Супернатант / Supernatant
à
ri
Рис. 4. Содержание общего белка в осадке и супернатантах гидролизатов белка куриного яйца, полученных в результате кратковременного (А) и длительного (Б) гидролиза
I - контроль (без гидролиза); II - ФП-96; III - алкалаза; IV - нейтраза; V - протосубтилин.
Fig. 4. The content of total protein in the sediment and supernatants of hydrolysates of egg white protein obtained as a result of short-term (A) and long-term (B) hydrolysis
I - control (without hydrolysis); II - EP-96; III - Alcalase; IV - Neutrase; V - Protosubtilin.
0
0
I
II
V
Заключение
Результаты исследований показали высокую эффективность ФП-96, полученного на основе нового мутант-ного штамма B. suЫШs-96, при гидролизе основных белков молочной сыворотки и яичного белка, обладающих сильным антигенным действием. Оптимальное соотношение нейтральной и сериновой протеаз в составе ФП-96 обеспечило универсальность действия
препарата при гидролизе исследуемых белковых субстратов. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности проведения дальнейших исследований по применению ФП-96 на этапе ферментативной обработки концентратов сывороточного и яичного белка в различных технологиях получения белковых гидро-лизатов для специализированных пищевых продуктов для диетического (лечебного и профилактического) питания.
Сведения об авторах
ВНИИПБТ - филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация): Костылева Елена Викторовна (Elena V. Kostyleva) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4775-303X
Середа Анна Сергеевна (Anna S. Sereda) - кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9097-3946
Великорецкая Ирина Александровна (Irina A. Velikoretskaya) - кандидат технических наук, научный сотрудник лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1851-1127
Минеева Дария Тимуровна (Daria T. Mineeva) - лаборант-исследователь лаборатории биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected]
Цурикова Нина Васильевна (Nina V. Tsurikova) - кандидат технических наук, заведующий лабораторией биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9609-0818
Литература
1. Janser R., Sato H. A response surface approach on optimization 16. of Hydrolysis parameters for the production of egg white protein hydro-lysates with antioxidant activities // Biocatal. Agric. Biotechnol. 2015.
Vol. 4. P. 55-62. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bcab.2014.07.001
2. Noh D.O., Suh H.J. Preparation of egg white liquid hydrolysate (ELH)
and its radical-scavenging activity // Prev. Nutr. Food Sci. 2015. Vol. 20, 17. N 3. P. 183-189. DOI: https://doi.org/10.3746/pnf.2015.20.3.183
3. Зорин С.Н. Ферментативные гидролизаты пищевых белков для специализированных пищевых продуктов диетического (лечебного и профилактического) питания // Вопросы питания. 18. 2019. Т. 88, № 3. С. 23-31. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2019-10026
4. Corrochano A.R., Buckin V., Kelly P.M., Giblin L. Invited review: whey proteins as antioxidants and promoters of cellular antioxidant pathways // J. Dairy Sci. 2018. Vol. 6. P. 4747-4761. DOI: https://doi. 19. org/10.3168/jds.2017-13618
5. Рытченкова О.В., Красноштанова А.А. Оптимизация процесса получения ферментативных гидролизатов белков молочной сыворотки с применением протеолитических ферментов // Фун- 20. даментальные исследования. 2011. Т. 8, № 3. С. 663-666.
6. Токаев Э.С., Баженова Е.Н., Мироедов Р.Ю. Современный опыт
и перспективы использования препаратов сывороточных белков 21. в производстве функциональных напитков // Молочная промышленность. 2007. № 10. С. 55-56.
7. Benede S., Molina E. Chicken egg proteins and derived peptides with antioxidant properties // Foods. 2020. Vol. 9, N 6. P. 735. DOI: https:// doi.org/10.3390/foods9060735 22.
8. Hildebrandt S., Kratzin H.D., Schaller R., Fritsche R., Steinhart H., Paschke A. In vitro determination of the allergenic potential of technologically altered hen's egg // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 12, pt 56.
N 5. P. 1727-1733. DOI: https://doi.org/10.1021/jf0725981 23.
9. Graszkiewicz A., Zelazko M., Trziszka T. Application of pancreatic enzymes in hydrolysis of egg-white proteins // Pol. J. Food Nutr. Sci. 2010. Vol. 60, N 1. P. 57-61.
10. Sujith P., Hymavathi T. Recent developments with debittering of protein hydrolysates // Asian J. Food Agro-Ind. 2011. Vol. 4, N 6. P. 365-381. 24.
11. Omana D.A., Wang J., Wu J. Ovomucin - a glycoprotein with promising potential // Trends Food Sci. Technol. 2010. Vol. 21, N 9. P. 455-463. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2010.07.001
12. Matsuoka R., Takahashi Y., Kimura M., Masuda Y., Kunou M. Heating has no effect on the net protein utilisation from egg whites
in rats // Sci. World J. 2017. Vol. 2017. Article ID 6817196. DOI: https:// 25. doi.org/10.1155/2017/6817196
13. Matsuoka R., Kimura M., Uno S., Shidara H., Kunou M. Egg white hydrolysate improves fatigue due to short-term swimming load test in mice // Food Sci. Nutr. 2018. Vol. 6, N 8. P. 2314-2320. DOI: https:// 26. doi.org/10.1002/fsn3.810
14. Caira S., Pizzano R., Picariello G., Pinto G., Cuollo M., Chianese L., Addeo F. Allergenicity of milk proteins // Milk Protein / ed. W.L. Hurley. London : IntechOpen, 2012. URL: https://www.intechopen.com/ chapters/38834 DOI: https://doi.org/10.5772/52086 27.
15. Shin M., Han Y., Ahn K. The influence of the time and temperature of heat treatment on the allergenicity of egg white proteins // Allergy Asthma Immunol. Res. 2013. Vol. 5, N 2. P. 96-101. DOI: https://doi. org/10.4168/aair.2013.5.2.96
Зорин С.Н., Сидорова Ю.С., Мазо В.К. Ферментативные гидро-лизаты белков молочной сыворотки и куриного яйца: получение, физико-химическая и иммунохимическая характеристики // Вопросы питания. 2020. Т. 89. № 1. С. 64-68. DOI: https://doi. org/10.24411/0042-8833-2020-10007
Зорин С.Н., Петров Н.А., Борисов А.Ю. Ферментолизаты белка молочной сыворотки: получение, физико-химическая и имму-нохимическая характеристика // Пищевая промышленность. 2019. № 4. С. 41-43.
Свириденко Ю.Я., Мягконосов Д.С., Абрамов Д.В., Овчинникова Е.Г. Научно-методические подходы к развитию технологии белковых гидролизатов для специального питания. Часть 1. Технология производства и технические характеристики гидро-лизатов // Пищевая промышленность. 2017. № 5. С. 48-51. Pokora M., Eckert E., Zambrowicz A., Bobak £., Szoltysik M., D^browska A. et al. Biological and functional properties of proteolytic enzyme-modified egg protein by-products // Food Sci. Nutr. 2013. Vol. 1, N 2. P. 184-195. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.27 Головач Т.Н., Курченко В.П. Гидролиз белков молока ферментативными препаратами и протеолитическими системами молочнокислых бактерий // Труды БГУ. 2012. Т. 7, ч. 1. С. 106-126. Cho D.Y., Jo K., Cho S.Y., Kim J.M., Lim K., Suh H.J. et al. Antioxidant effect and functional properties of hydrolysates derived from egg-white protein // Korean J. Food Sci. Anim. Resour. 2014. Vol. 34, N 3. P. 362-371. DOI: https://doi.org/10.5851/kosfa.2014. 34.3.362
Ou K., Liu Y., Zhang L., Yang X., Huang Z., Nout M.J. et al. Effect of neutrase, alcalase, and papain hydrolysis of whey protein concentrates on iron uptake by Caco-2 cells // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 8. P. 4894-4900. DOI: https://doi.org/10.1021/jf100055y Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Минеева Д.Т., Цурикова Н.В., Рубцова Е.А. Ферментные препараты бактериальных протеаз для получения белковых гидролизатов без горечи // Биотехнология. 2020. Т. 36, № 4. С. 42-48. DOI: https:// doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-4-42-48
Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Цурикова Н.В., Минеева Д.Т., Бобровенко Е.Ю. Получение нового штамма Bacillus subtilis-96 - продуцента протеолитических ферментов для пищевой промышленности // Пищевая промышленность. 2021. № 9. С. 35-36. DOI: https://doi.org/10.52653/PPI.2021. 9.9.012
Peng X., Kong B., Xia X., Liu Q. Reducing and radical-scavenging activities of whey protein hydrolysates prepared with Alcalase // Int. Dairy J. 2010. Vol. 20, N 5. P. 360-365. DOI: https://doi.org/10.1016/j. idairyj.2009.11.019
Carvalho-Silva L.D., Pacheco M.T., Bertoldo R., Veloso C.D., Teodoro L.O., Giusti-Paiva A. et al. Anti-inflammatory activities of enzymatic (alcalase) hydrolysate of a whey protein concentrate // Afr. J. Biotechnol. 2012. Vol. 11, N 12. P. 2993-2999. DOI: https://doi. org/10.5897/AJB11.2330
Dermiki M., Fitzgerald R.J. Physicochemical and gelling properties of whey protein hydrolysates generated at 5 and 50°C using Alcalase® and Neutrase®, effect of total solids and incubation time // Int. Dairy J. 2020. Vol. 110. Article ID 104792. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.idairyj.2020.104792
References
Janser R., Sato H. A response surface approach on optimization of Hydrolysis parameters for the production of egg white protein hydrolysates with antioxidant activities. Biocatal Agric Biotechnol. 2015; 4: 55-62. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bcab.2014.07.001 Noh D.O., Suh H.J. Preparation of egg white liquid hydrolysate (ELH) and its radical-scavenging activity. Prev Nutr Food Sci. 2015; 20 (3): 183-9. DOI: https://doi.org/10.3746/pnf.2015.20.3.183 Zorin S.N. Enzymatic hydrolysates of food proteins for specialized food products of dietary (therapeutic and prophylactic) nutrition. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (3): 23-31. DOI: https://doi. org/10.24411/0042-8833-2019-10026 (in Russian) Corrochano A.R., Buckin V., Kelly P.M., Giblin L. Invited review: whey proteins as antioxidants and promoters of cellular antioxidant pathways. J Dairy Sci. 2018; 6: 4747-61. DOI: https://doi.org/10.3168/ jds.2017-13618
Rytchenkova O.V., Krasnoshtanova A.A. Optimization of the process of obtaining enzymatic hydrolysates of whey proteins using proteolytic enzymes. Fundamental'nye issledovaniya [Fundamental Researches]. 2011; 8 (3): 663-6. (in Russian)
Tokaev E.S., Bazhenova E.N., Miroedov R.Yu. Modern experience and prospects for the use of whey protein preparations in the production of functional drinks. Molochnaya promyshlennost' [Dairy Industry].
2007; (10): 55-6. (in Russian)
Benede S., Molina E. Chicken egg proteins and derived peptides with antioxidant properties. Foods. 2020; 9 (6): 735. DOI: https://doi.
org/10.3390/foods9060735
Hildebrandt S., Kratzin H.D., Schaller R., Fritsche R., Steinhart H., Paschke A. In vitro determination of the allergenic potential of technologically altered hen's egg. J Agric Food Chem. 2008; 12 [pt 56 (5)]: 1727-33. DOI: https://doi.org/10.1021/jf0725981
Graszkiewicz A., Zelazko M., Trziszka T. Application of pancreatic enzymes in hydrolysis of egg-white proteins. Pol J Food Nutr. Sci. 2010; 60 (1): 57-61.
Sujith P., Hymavathi T. Recent developments with debittering of protein hydrolysates. Asian J Food Agro-Ind. 2011; 4 (6): 365-81. Omana D.A., Wang J., Wu J. Ovomucin — a glycoprotein with promising potential. Trends Food Sci Technol. 2010; 21 (9): 455-63. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2010.07.001
6
2
7
8
4
9
12. Matsuoka R., Takahashi Y., Kimura M., Masuda Y., Kunou M. Heating 20. has no effect on the net protein utilisation from egg whites in rats. Sci World J. 2017; 2017: 6817196. DOI: https://doi.org/10.1155/2017/6817196
13. Matsuoka R., Kimura M., Uno S., Shidara H., Kunou M. Egg white 21. hydrolysate improves fatigue due to short-term swimming load test
in mice. Food Sci Nutr. 2018; 6 (8): 2314-20. DOI: https://doi. org/10.1002/fsn3.810
14. Caira S., Pizzano R., Picariello G., Pinto G., Cuollo M., Chianese L., 22. Addeo F. Allergenicity of milk proteins. Ed. by W.L. Hurley. Milk Protein. London: IntechOpen, 2012. URL: https://www.intechopen.com/ chapters/38834 DOI: https://doi.org/10.5772/52086
15. Shin M., Han Y., Ahn K. The influence of the time and temperature of 23. heat treatment on the allergenicity of egg white proteins. Allergy Asthma Immunol Res. 2013; 5 (2): 96-101. DOI: https://doi.org/10.4168/ aair.2013.5.2.96
16. Zorin S.N., Sidorova Yu.S., Mazo V.K. Enzymatic hydrolysates of whey
and chicken egg proteins: preparation, physicochemical and immu- 24. nochemical characteristics. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (1): 64-8. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10007 (in Russian)
17. Zorin S.N., Petrov N.A., Borisov A.Yu. Whey protein fermentolysates: preparation, physicochemical and immunochemical characteristics. 25. Pishchevaya promyshlennost' [Food Processing Industry]. 2019; (4): 41-3. (in Russian)
18. Sviridenko Yu.Ya., Myagkonosov D.S.,Abramov D.V., Ovchinnikova E.G. Scientific and methodological approaches to the development of tech- 26. nology of protein hydrolysates for special nutrition. Part 1. Production technology and technical characteristics of hydrolysates. Pishchevaya promyshlennost' [Food Processing Industry]. 2017; (5): 48-51. (in Russian) 27.
19. Pokora M., Eckert E., Zambrowicz A., Bobak £., Szoltysik M., D^browska A., et al. Biological and functional properties of proteolytic enzyme-modified egg protein by-products. Food Sci Nutr. 2013; 1 (2): 184-95. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.27
Golovach T.N., Kurchenko V.P. Hydrolysis of milk proteins by enzymatic preparations and proteolytic systems of lactic acid bacteria. Trudy BGU [Works of BSU]. 2012; 7 (1): 106-6. (in Russian) Cho D.Y., Jo K., Cho S.Y., Kim J.M., Lim K., Suh H.J., et al. Antioxidant effect and functional properties of hydrolysates derived from egg-white protein. Korean J Food Sci Anim Resour. 2014; 34 (3): 362-71. DOI: https://doi.org/10.5851/kosfa.2014.34.3.362 Ou K., Liu Y., Zhang L., Yang X., Huang Z., Nout M.J., et al. Effect of neutrase, alcalase, and papain hydrolysis of whey protein concentrates on iron uptake by Caco-2 cells. J Agric Food Chem. 2010; 58 (8): 4894-900. DOI: https://doi.org/10.1021/jf100055y Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Mineeva D.T., Tsuriko-va N.V., Rubtsova E.A. Bacterial protease enzyme preparations for the production of non-bitter protein hydrolysates. Biotechnologiya [Biotechnology]. 2020; 36 (4): 42-8. DOI: https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-4-42-48 (in Russian)
Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Tsurikova N.V., Mineeva D.T., Bobrovenko E.Yu. Obtaining of new Bacillus subtilis-96 strain - a producer of proteolytic enzymes for the food industry. Pish-chevaya promyshlennost' [Food Processing Industry]. 2021; (9): 35-6. DOI: https://doi.org/10.52653/PPI.2021.9.9.012
Peng X., Kong B., Xia X., Liu Q. Reducing and radical-scavenging activities of whey protein hydrolysates prepared with Alcalase // Int. Dairy J. 2010. Vol. 20, N 5. P. 360-365. DOI: https://doi.org/10.1016/j. idairyj.2009.11.019 (in Russian)
Carvalho-Silva L.D., Pacheco M.T., Bertoldo R., Veloso C.D., Teodoro L.O., Giusti-Paiva A., et al. Anti-inflammatory activities of enzymatic (alcalase) hydrolysate of a whey protein concentrate. Afr J Bio-technol. 2012; 11 (12): 2993-9. DOI: https://doi.org/10.5897/AJB11.2330 Dermiki M., Fitzgerald R.J. Physicochemical and gelling properties of whey protein hydrolysates generated at 5 and 50°C using Alcalase® and Neutrase®, effect of total solids and incubation time. Int Dairy J. 2020; 110: 104792. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2020. 104792
