Эффект радиоадаптивного ответа после воздействия рентгеновского излучения и гамма-квантов на лимфоциты периферической крови здоровых доноров Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 03.02.00

ЭФФЕКТ РАДИОАДАПТИВНОГО ОТВЕТА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ГАММА-КВАНТОВ НА ЛИМФОЦИТЫ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ

12 3

© 2017 Л. В. Цховребова , А. В. Агаджанян , Г. П. Македонов

1канд. биол. наук, ассистент кафедры биологии и общей генетики

e-mail: tskhovrebova lv@pfur.ru 2 канд. биол. наук, ассистент кафедры биологии и общей генетики e-mail: ann-aghaj anyan@yandex.ru

Медицинский институт, Российский университет дружбы народов, Москва, РФ

3канд. мед. наук, в.н.с. e-mail: makedonov39@mail.ru

ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Проведено исследование радиоадаптивного ответа (РАО) на лимфоцитах клинически-здоровых доноров с использованием Х-лучей как адаптирующей дозы (0,05 Гр) и у-квантов как повреждающей дозы (2 Гр) в Gj-фазе митотического цикла. В качестве критериев оценки защитного действия радиоадаптивного ответа был применен анализ хромосомных аберраций и микроядер (МЯ). Защита малыми дозами радиации в клетках клинически здоровых взрослых доноров четко отразилась в снижении выхода микроядер и аберраций хроматидного типа. Полученные результаты помогли нам сформировать стратегию будущих исследований механизма действия радиоадаптивного ответа.

Ключевые слова: радиоадаптивный ответ, Х-лучи, у-кванты, хромосомные аберрации, микроядра, лимфоциты периферической крови.

Радиоадаптивный ответ (РАО) - это изменения уровня повреждений в геноме/клетке после воздействия мутагенов в адаптирующей малой дозе и повреждающей средней или большой дозе. Это явление было открыто G. Olivieri с соавторами в 1984 г. В работе Д.М. Спитковского [1992] дается следующее объяснение РАО: «Сущность реакции состоит в уменьшении числа повреждений, в частности различных типов хромосомных аномалий под воздействием высоких доз, но не летальных, если клетки предварительно были подвергнуты воздействию малых доз».

Классический вариант обработки лимфоцитов человека был проведен с использованием Н3-тимидина (4 сГр), который был своего рода хроническим облучением в малой дозе и затем Х-лучами в дозе 150 рад (1,5 Гр). Основным индуктором РАО служит редкоионизирующая радиация.

Однако возможно применение и других схем воздействия на клетки в адаптирующей и повреждающей дозе. Наиболее распространенным является использование следующей схемы: воздействие Х-лучей в малой дозе и последующее воздействие Х-лучей в большой дозе [Ishii, Watanabe 1996; Salone et al. 1996; Shadley, Dai 1992]. Мягкая термообработка (около 430С) и последующее воздействие Х-лучей дает примерно такой же адаптирующий эффект, как и малые дозы Х-лучей [Cai, Jiang 1995]. A. Wojcik и соавторами [1996] была предложена обработка Н3-тимидином (в диапазоне доз от 18,5 Бк/мл до 37 кБк/мл) и последующее воздействием Х-лучами.

T. Ikushima [1989] предложил обработку Н3-тимидином в адаптирующей дозе и воздействие у-облучения в повреждающей дозе.

Многие ученые исследовали зависимость РАО от фазы клеточного цикла на лимфоцитах человека, стимулированных ФГА, и было выявлено, что наиболее эффективным РАО был в тех случаях, когда клетки подвергались воздействию адаптирующей дозы в Gi-фазе [Wojcik, Streffer 1995] клеточного цикла или в фазе G2 [Cai, Liu1990], либо в поздней S/ранней G2 фазе [Shadley 1994]. Облучение повреждающей дозой происходило в этих же фазах. По литературным данным? довольно противоречивых взглядов придерживаются исследователи по поводу индукции РАО в G0 фазе клеточного цикла [Cortes et al.1994].

Известно, что защитный эффект радиоадаптивного ответа выражается в снижении уровня аберраций хромосом, в основном хроматидного типа. В связи с этим в качестве критериев оценки повреждения клеток, как правило, используют частоту возникновения различного типа структурных аберраций хромосом [Yu et al. 1995] и сестринских хроматидных обменов [Matsumoto et al. 2004]. В некоторых работах РАО был показан при изменении уровня микроядер [Yu et al. 2013]

Феномен РАО был выявлен в клетках различного типа: клетках крови, иммунной системы [Yu et al. 2007; Rzeszowska-Wolny et al. 2009]. РАО был изучен в экспериментальных исследованиях на культуре клеток HeLa [Ishii, Watanabe 1996; Ojima et al. 2001] и животных моделях [Liu et al. 2005; Cheda et al. 2004]. В работе [Yu et al. 2013] показано, что некоторые опухолевые клетки, например линии саркомы S180, резистентны к РАО и полностью отличаются по реакции от нормальных клеток.

Целью данной работы было изучение РАО на лимфоцитах периферической крови здоровых доноров после воздействия рентгеновского излучения в адаптирующей дозе и гамма-квантов в повреждающей дозе.

Материалы и методы

Обследованные лица. Все эксперименты были поставлены на четырех клинически здоровых донорах, проживающих на территориях, не загрязненных радионуклидами. Возраст обследуемых лиц варьировал в пределах от 32 до 53 лет. На момент обследования они не подвергались лучевой диагностике в течение года.

Условия эксперимента. Эксперименты проводили на первичной культуре лимфоцитов периферической крови in vitro.

Состав среды для культивирования был следующим: среда Игла 90%, сыворотка крупного рогатого скота 10%, глютамин 2 мМ, пенициллин 100 ед/мл, фитогеммаглютинин (ФГА) 2%. Клетки инкубировали при 370 С в течение 59 часов.

Через 4 часа после стимуляции ФГА клетки облучали рентгеновскими лучами (190 кВ, фильтр Cu 2мм) в дозе 0,05 Гр при мощности облучения 0, 0143 Гр/мин. либо вносили Н3-тимидин в дозе 2,5 кБк/мл (0,1 мК/мл) на 20 часов. Меченый нуклеотид отмывали непосредственно перед облучением средой Хэнкса. В работе был использован Н3-тимидин с удельной активностью 1,2 ТБ к/мМ.

Через 20 часов клетки облучали гамма-квантами в дозе 2 Гр при мощности дозы 6 Гр/мин (Со60). За 2 часа до фиксации в среду вносили колцемид в концентрации 0,07 мкг/мл. Обработку гипотоническим раствором 0,075 М KCl проводили в течение 15 минут при 370С. Клетки фиксировали этиловый спирт-уксусная кислота в соотношении 3:1.

Цховребова Л. В., Агаджанян А. В., Македонов Г. П. Эффект радиоадаптивного ответа

после воздействия рентгеновского излучения гамма-квантов на лимфоциты периферической крови здоровых доноров

Для контроля скорости прохождения клетками митотического цикла проводили подсчет митозов I и II циклов по окраске FPG. Единичные митозы II цикла наблюдались во всех вариантах эксперимента.

Анализ хромосомных аберраций и микроядер. Анализ хромосомных аберраций проводили путем микроскопирования монохромно окрашенных, с хорошим разбросом метафазных пластинок (Carl Zeiss, Германия). Поиск метафаз проводили под малым увеличением (10 х 10). Анализ осуществляли под большим увеличением (100 х 10) с использованием иммерсии [Method... 1974; Biological dosimetry... 1986]. Анализировали 250-350 метафазных пластинок с 44-46 хромосомами.

Одновременно с анализом аберраций хромосом было проанализировано число микроядер на 100 клеток и частота клеток с микроядрами. В каждом варианте эксперимента было проанализировано по 3000 клеток. Подсчет микроядер в одноядерных клетках проводили по модифицированной методике [Македонов, Цховербова 2002].

Статистический анализ. Достоверность различий определяли по t-критерию Стъюдента. При статистической обработке данных использовался пакет программ MS EXSEL и Statistika 6.

Результаты и обсуждение

Известно, что воздействие ионизирующего излучения на организм вызывает образование ионов из нейтральных атомов и молекул в клетке. При поглощении энергии кванта атомом или молекулой высвобождается электрон — происходит акт ионизации, при каждом акте ионизации высвобождается энергия в размере 33 эВ, что превышает энергию, требуемую для разрыва любых связей между атомами в молекуле. Ионизирующие излучения подразделяются по своей природе на электромагнитные и корпускулярные. Электромагнитные излучения — это рентгеновское излучение и у-излучение радиоактивных элементов [Ярмоненко 1988].

В эксперименте использовали только ионизирующее облучение: в качестве адаптирующей дозы - Х-лучи (рентгеновское облучение), в качестве повреждающей дозы - гамма-кванты.

Объектом исследования были выбраны лимфоциты периферической крови здоровых доноров. Выбор пал на лимфоциты потому, что, по многим литературным данным, для исключения влияния кинетики клеточного цикла культура должна быть синхронизирована. Лимфоциты периферической крови, стимулированные ФГА, являются именно такой культурой.

Кроме того, и адаптирующая и повреждающая дозы были применены в одной и той же фазе клеточного цикла, а именно в G1. Такая схема была выбрана потому, что все клетки в данном цикле характеризуются одинаковой радиочувствительностью. Тестом для оценки эффективности РАО послужили структурные мутации хромосом.

По данным, приведенным в таблице 1, видно, что в лимфоцитах, после различных типов обработок индуцируются аберрации как хромосомного, так и хроматидного типов. Преобладают аберрации хромосомного типа. Наибольшую часть аберраций хромосомного типа представляют дицентрические хромосомы, делеции и ацентрические кольца. Среди аберраций хроматидного типа наблюдались обмены и делеции.

По литературным данным, защитный эффект РАО выражается в практически полном снятии аберраций хроматидного типа (Wolff S, 1993). Предварительное рентгеновское облучение в дозе 5 сГр приводило к статистически значимому снижению выхода структурных мутаций хромосом, индуцированных последующим повреждающим облучением гамма-квантами в дозе 2 Гр. Так, делеции хроматидного типа снижались до уровня контроля (0,4 и 0 соответственно). Защитный эффект РАО отразился и на аберрациях хромосомного типа. Наблюдали значимые отличия в спектре хромосомных аберраций при воздействии адаптирующей и повреждающей доз. Наиболее выраженное снижение уровня аберраций коснулось ацентрических колец.

Параллельно с подсчетом аберраций мы анализировали число микроядер в эксперименте (табл. 2). Так как аберрации хроматидного типа практически не реализуются в микроядра либо реализуются с достаточно низкой частотой, то учитывают весь спектр индуцируемых хромосомных аберраций. Ранее в нашей работе был вычислен коэффициент перехода аберраций хроматидного типа в МЯ [Македонов, Цховербова 2002]. Частота микроядер, индуцированных у-квантами, составляла 15.4±18, большая часть из которых представляла собой именно аберрации хромосомного типа. Предобработка адаптирующей дозой Х-лучей имела значительный эффект в снижении выхода МЯ примерно в 1.5 раза и составляла 8.0±0,5. Эти показатели были также статистически значимы относительно уровня контроля.

По полученным результатам, представленным в таблицах, очевидно, что защита малыми дозами радиации в клетках клинически здоровых взрослых доноров четко выражена. Адаптирующее рентгеновское облучение в дозе 5сГр приводит к статистически значимому снижению выхода структурных мутаций хромосом без изменения их спектра. Наблюдение единичных митозов II цикла во всех вариантах эксперимента говорит о том, что ни у-кванты в дозе 2Гр, ни последовательное воздействие Х-лучей в дозе 5сГр с у-квантами не приводят к заметному изменению скорости прохождения клетками митотического цикла.

В целом данные исследования помогли сформировать стратегию будущих исследований механизма феномена радиоадаптивного ответа.

Библиографический список

Македонов Г.П., Цховребова Л.В. Количественный анализ индукции микроядер в лимфоцитах человека, культивированных in vitro (Предпосылки для создания модифицированного микроядерного теста) // Радиац. биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42. №5. С. 469-474.

Спитковский Д.М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и ее возможные приложения к трактовке медико-биологических последствий // Радиобиология. 1992. 32 (3). С. 382-400.

Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. М.: Высшая школа, 1988.

424 с.

Biological dosimetry: chromosomal aberration analysis for dose assessment // Technical Reports series № 260. Vienna: Int. Atomic Energy, 1986. P. 1-69.

Cai L, Jiang J. Mild hyperthermia can induce adaptation to cytogenetic damage caused by subsequent X-irradiation // Radiation Res. 1995. V. 143. P. 26-33.

Cai L, Liu S.Z. Induction of cytogenetic adaptive response of somatic and germ cells in vivo and in vitro by low dose X-irradiation // Int.J.Radiat.Biol. 1990. 58. Р. 181-194.

Cheda A, Wrembel-Wargocka J, Lisiak E, Nowosielska EM, Marciniak M, Janiak MK. Single low doses of X rays inhibit the develo pment of experimental tumor metastases and trigger the activities of NK cells in mice // Radiat Res. 2004. 161. Р. 335-340.

Цховребова Л. В., Агаджанян А. В., Македонов Г. П. Эффект радиоадаптивного ответа

после воздействия рентгеновского излучения гамма-квантов на лимфоциты периферической крови здоровых доноров

Cortés F, Domínguez I, Flores MJ, Piñero J, Mateos JC. Differences in the adaptive response to radiation damage in GO human lymphocytes conditioned with hydrogen peroxide or low-dose X-rays // Mutat Res. 1994. 311(1). Р. 157-163.

Ikushima T. Radio-adaptive response: characterization of a cytogenetic repair induced by low-level ionizing radiation in cultured Chinese hamster cells // Mutat Res. 1989. 227(4). Р. 241-246.

Ishii K, Watanabe M. Participation of gap-junctional cell communication on the adaptive response in human cells induced by low dose of X-rays // Int J Radiat Biol. 1996. 69(3). Р. 291-299.

Liu GW, Gong PS, Zhao HG, Wang Z, Lv WT, Jiang XY, Gong SL. Low dose radiation-induced apoptosis in mouse spermatogenic cells and p53 gene expression of adaptive response // Chin J Radiological Health. 2005. 14.

Matsumoto H, Takahashi A, Ohnishi T. Radiation-induced adaptive responses and bystander effects // Biol Sci Space. 2004. 18(4). Р. 247-254.

Method of human chromosome aberration analysis / еd. K. Buckton, H. Evans. WHO, Geneva, 1976. 64 p.

Ojima M, Ishii K, Hayashi T, Ito A. Induction of radio-adaptive response in colony formation by low dose X-ray irradiation // Physiol Chem Phys Med NMR. 2001. 33(1). Р. 4148.

Olivieri G, Bodycote J, Wolff S. Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine // Science. 1984. 223(4636). Р. 594-597.

Rzeszowska-Wolny J, Przybyszewski WM, Widel M. Ionizing radiation-induced bystander effects, potential targets for modulation of radiotherapy // Eur J Pharmacol. 2009. 625.156-164.

Salone B, Pretazzoli V, Bosi A., Olivieri G. Effect of 1 Gy X-rays in G1 phase on activation of cell cycle checkpoints in human lymphocytes: role played by chromosomal aberrations // Mutagenesis. 1997. 12(6). Р. 463-468.

Shadley JD, Dai G. Low dose X-ray induced cytogenetic adaptive responses in human lymphocytes // Low dose irradiation and biological defense mechanisms. Exc. Medica. Amsterdam-London-New-York-Tokyo. 1992. 283 р.

Shadley JD. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes // Radiat Res. 1994. 138(1 Suppl). Р. 9-12.

Wojcik A, Aghamohammadi S, Aillaud M, et al. Adaptive response to ionizing radiation in human lymphocytes: the problem of scoring aberrations in cells irradiated during asynchronous growth. Adaptive response to ionizing radiation in human lymphocytes: the problem of scoring aberrations in cells irradiated during asynchronous growth // Mutat Res. 1996. 366(2). Р. 137-143.

Wojcik A, Streffer C. Application of a multiple fixation regimen to study the adaptive response to ionizing radiation in lymphocytes of two human donors // Mutat Res. 1995. 326(1). Р. 109-116.

Yu H, Liu N, Wang H, Shang Q, Jiang P, Zhang Y. Different responses of tumor and normal cells to low-dose radiation // Contemp Oncol (Pozn). 2013. 17(4). Р. 356-362.

Yu HS, Xue HW, Guo CB, Song AQ, Shen FZ, Liang J, Deng C. Low dose radiation increased the therapeutic efficacy of cyclophosphamide on s(180) sarcoma bearing mice // J Radiat Res (Tokyo). 2007. 48. Р. 281-288.

Yu W, Wang M, Cai L, Jin Y. Pre-exposure of mice to low dose or low dose rate ionizing radiation reduces chromosome aberrations induced by subsequent exposure to high dose of radiation or mitomycin C // Chin Med Sci J. 1995. 10(1). Р. 50-53.

Таблица 1

Спектр и частота аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови после воздействия рентгеновских лучей (Х)

в адаптирующей дозе 0.05 Гр и у-облучении в повреждающей дозе (2 Гр).

Способы обработки Клетки с аберрациями (частота, % ± SEM) Аберрации на 100 клеток ± SEM Типы аберраций хромосом (частота на 100 клеток ± SEM)

Хроматидного Хромосомного

Обмены Делеции Делеции Ацентрические кольца Центромерные кольца Дицентрики Атипичные моноцентрики

у-кванты 59.8 ±5.2f 110 ±7.6' 2.2 ± 0.91,2 2.8 ± 1.22 22.4 ±2.71 22.6 ±2.71,2 14.0 ±0,62 42.8 ±3.3 3.2 ±1.4

Х-лучи + у-кванты 45.4±3.51 67.4 ±6.0* 1.6 ±0.71 0.4 ±0.01 13.2 ±0.61 9.0 ±0.81 7.6 ±2.5 34.8 ±2.7 1.8 ±0.7

Х-лучи 4.0 ±2.0f 6.3 ±2.1 0.8 ±0.2 0.2 ±0.01 1.0±0.2 1.0 ±0.2 0.8 ±0,2 2.0 ±0.8 0.3 ±0.01

Контроль 1.7 ±0.7 1.7 ±0.7 0.5 ± 0.02 0 1.3 ±0.5 0 0 0 0

Достоверное различие с контролем (р<0.01)

2 Достоверное различие между частотой аберраций после обработки у-квантами с аналогичными показателями после обработки Х-лучи+у-кванты

Таблица 2

Частота микроядер в лимфоцитах периферической крови после воздействия рентгеновских лучей (Х) в адаптирующей дозе 0.05 Гр и тестирующем у-облучении в дозе 2 Гр.

Способы обработки Частота клеток с микроядрами ± SEM Частота микроядер на 100 клеток ± SEM

у-кванты 14.0 ± 1.7* 15.4 ± 1.8*

Х-лучи + у-кванты 7.3 ± 0.6* 8.0 ± 0.5*

Х-лучи 0.7 ± 0.2* 0.7 ± 0.2*

Контроль 0.3 ± 0.2 0.3 ± 0.2

*Достоверные различия с контролем (р<0.01)

Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2017. № 2 (14)