CC BY
12
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив, серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина t.XVI. ISSN 1311-9427. Научна сесия „Медицина и дентална медицина", 31 Октомври - 1 Ноември 2014. Scientific researches of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, Vol.XVI, ISSN 1311-9427 Medicine and Stomatology Session, 31. October- 1. November 2014.
ЕФЕКТИ НА ГАЛАНТАМИНА ВЪРХУ ПРОЦЕСИТЕ НА ОБУЧЕНИЕ И ПАМЕТ НА ИНТАКТНИ ПЛЪХОВЕ -ТЕСТ ЗА АКТИВНО ОБУЧЕНИЕ Даринка Димитрова и Дамянка Гетова Катедра по фармакология и клинична фармакология, МФ, Медицински Университет - Пловдив
EFFECTS OF GALANTAMINE ОN LEARNING AND MEMORY PROCESSES IN NAÏVE RATS - ACTIVE AVOIDANCE TESTS Darinka Dimitrova and Damianka Getova Deparment of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine Medical University - Plovdiv
Abstract
Galantamine is a phenanthrane alkaloid, a competitive and reversible cholinesterase inhibitor used for treatment of mild to moderate Alzheimer's disease. Galantamine has unique mechanism of action includes allosteric modulation of alpha-4/beta-2 and alpha-7 nicotinic receptors in central nervous system. Interaction between galantamine and receptors protects neurons from glutamate neurotoxic action and inhibits apoptosis.
The aim of our study was to compare the effects of three different doses galantamine on learning and memory processes in rats using active avoidance test. The male rats (8 per group) were chronically treated with: 1st Saline 0.1 ml/100g body weight (controls) per os ; 2nd Galantamine hydrobromide 0.1 mg/kg per os; 3rd Galantamine hydrobromide 0.5 mg/kg per os; 4th Galantamine hydrobromide 1.0 mg/kg per os. All groups of animals were trained in shuttle-box active avoidance test 60 minutes after drug application. It was used original made standard apparatus (Ugo Basile, Italy) with training parameters for rats. In active avoidance test the learning session was performed 5 days and consisted of 30 trials, memory retention session was done 7 days later. The following behavioral parameters were observed: number of correct responses (avoidances), number of escapes from foot shocks and number of intertrial crossings.
The comparison between the groups was made by Instat computer program using analysis of variance. The mean and standard error of mean for each group was calculated. A two-way ANOVA for repeated measurements was used to compare different groups with the respectve controls. A p-value p<0.05 was considered representative of a significant difference.
In active avoidance test the rats treated with galantamine significantly increased the number of conditioned stimuli responses (avoidances) and unconditioned stimuli responses (escapes) on learning sessions in comparison with control group. This effect was dose-independent. The most improving effect had doses 0.1 mg/kg and 1.0 mg/kg galantamine. The animals learned the task, but not kept it. Our results allow us to conclude that galantamine improve learning better than memory. The doses used also increased the exploratory activity represented by significantly increased number of intertrial crossings in rats.
Въведение
Галантаминът в химично отношение представлява 4a,5,9,10,11,12-hexahydro-3-methoxy-11-methyl-6H-benzofuro[3a,3,2ef][2]benzazepin-6-ol,hydrobromide.
Той е умерен по сила холинестеразен инхибитор от растителен произход. Получаван е първоначално от листа и луковици на растението Galanthus woronowii, а по-късно от Galanthus nivalis. В нашата страна се е произвеждал чрез сложна екстракция от листата и цветовете на блатното кокиче Leucojum aestivum от сем. Amaryllidaceae. Сега се получава по синтетичен път.
Инхибирайки ензима ацетилхолинестераза галантаминът увеличава нивото на невротрансмитера ацетилхолин, химичното вещество в мозъка, критично отговорно за обучението и паметта. Той има уникален механизъм на действие, включващ алостерична модулация на alpha-4/beta-2 и alpha-7 никотинови рецептори в мозъка (Akaike et al., 2010). Взаимодействието на галантамина с рецепторите предпазва невроните от глутаматна невротоксичност и инхибира апоптозата (Coyle et al., 2007). Доказано е също, че хроничната нискостепенна стимулация на никотиновите рецептори предпазва от бета-амилоидна токсичност, намалявайки продукцията на бета-амилоиден протеин (Kihara et al., 1998).
Галантаминът антагонизира инхибиращия ефект на скополамина върху обучението и паметта на мишки при тест в Т-лабиринт (Busquet et al., 2012). Той осъществява този ефект самостоятелно или в комбинация с мемантин (медикамент, принадлежащ към друга фармакологична група). Това позволява употреба на двата медикамента в малки дози, снижавайки по този начин риска от появата на токсични реакции.
Прилагането на галантамин води до подобряване на паметта, обучението, вниманието и концентрацията, повишаване на качеството на живот на пациентите с Алцхаймерова болест (Bond et al., 2012).
Цел на нашето проучване беше да сравним ефекта на три дози галантамин върху процесите на обучение и памет на интактни плъхове.
Материал и методи
Всички експерименти са проведени съгласно Изискванията и Правилата за работа с лабораторни животни: Разрешително №49/30.06.2011 от БАБХ към Министерство на земеделието и храните и Протокол №3/05.07.2012 от Комисията по Научна етика към Медицински Университет - Пловдив.
Използвани бяха 32 броя бели мъжки плъхове порода Wistar с начално тегло 220-240 гр., отглеждани при стандартни лабораторни условия (08.00-20.00 светлина, със свободен достъп до храна и вода). Брой животни в група n=8.
1. Експериментални групи: I-ва група - Saline 0.1 ml/100g b.w. per os (controls); II-ра група - Galantamini hydrobromidum 0.1mg/kg i.p.; III-та група - Galantamini hydrobromidum 0.5mg/kg per os; IV-та група - Galantamini hydrobromidum 1.0mg/kg per os.
2. Методът за изследване на процесите на обучение и памет е активно оучение с наказателно подкрепление - Shuttle-box test. Състои се от 5-дневна обучителна сесия и 7 дни по-късно ретест за памет. Всяко животно прави 30 последователни тренировки в рамките на един експериментален ден. Отчитат се следните показатели - брой условни отговори, брой безусловни отговори и брой междутренировъчни преминавания.
Използва се оригинално конструиран апарат за експериментална работа на италианската фирма Ugo Basile. Изследваните параметри се отчитат автоматично.
3. Изследваното съединение Galantamini hydrobromidum (Sopharma) се въвежда чрез сонда 60 минути преди тренировките.
Статистически анализ
Получените данни бяха обработени статистически с компютърна програма Instat по метода на вариационния анализ (ANOVA за многократни измервания). За всеки показател при всяка група бяха определени средната аритметична стойност и стандартната й грешка (mean ± SEM). Сравняването на резултатите за всеки показател спрямо съответната контролна група беше извършено с помощта на Turkey-Kramer тест за многократни сравнения. 92
Резултати При шатъл-бокс теста за активно обучение контролната група плъхове увеличиха значимо броя условни отговори (авойданси) на 4-ти и 5-ти ден обучение (Р<0.05), спрямо първи ден (Фигура 1). Животните, третирани с най-малката (0.1 mg/kg) и най-голяма (1.0 mg/kg) дози галантамин значимо увеличиха броя условни отговори на 3-ти ден от обучителната сесия (Р<0.05), в сравнение с контролната група от същия ден. Плъховете, получили галантамин в доза 0.5 мг/кг, също показаха увеличен брой условни отговори по време на обучителната сесия в сравнение с контролните групи от същите дни, но той не беше статистически значим (Фигура 1).
При ретеста за памет, проведен на 12-ти ден от началото на експеримента контролите повишиха статистически достоверно броя условни отговори (Р<0.05), в сравнение първи ден. Животните и в трите експериментални групи с галантамин не промениха значимо броя условни отговори в сравнение с групата приемала физиологичен разтвор от същия ден (Фигура 1).
Фигура 1. Ефекти на галантамина по теста за условно избягване с наказателно подкрепление (шатъл бокс) на плъхове. Брой условни отговори (авойданси).
1 2 3 4 5 12
Дни на тестиране
ПБаИпе_ШGal 0.1 mg_HGal 0.5 mg_HGal 1.0 mg
оР<0.05 - спрямо контрола първи ден; *Р<0.05 - спрямо контролната група от същия
ден.
Плъховете от контролната група не промениха значимо броя безусловни отговори (избягвания) по време на 5-те дни обучение (Фигура 2).
Животните, получили най-малката доза 0.1 мг/кг галантамин показаха статистически значимо нарастване на броя безусловни отговори през цялата обучителна сесия (от 1-ви до 5-ти ден тестиране) (Р<0.05) в сравнение с контролата от същия ден. Експерименталната група, третирана с най-високата доза галантамин 1.0 мг/кг повишиха статистически значимо броя на безусловните отговори през петте дни на обучителната асесия, съответно на 3-ти ден (Р<0.05), а на 1-ви, 2-ри, 4-ти и 5-ти ден (Р<0.01), спрямо групата с физиологичен разтвор от съответния ден (Фигура 2).
При теста за памет контролните плъхове не показаха съществена промяна в броя на безусловните отговори в сравнение с обучителната сесия. Опитните групи, третирани с двете по-ниски дози галантамин (0.1 мг/кг и 0.5 мг/кг) показаха статистически достоверно увеличение на броя избягвания (Р<0.05), спрямо контролата от същия ден. Плъховете, получили най-високата доза галантамин (1.0 мг/кг) повишиха значимо броя на безусловните отговори (Р<0.01), в сравнение с 12-ти ден контрола (Фигура 2).
Фигура 2. Ефекти на галантамина изследвани по теста за обучение с наказателно подкрепление (шатъл бокс) на плъхове. Брой безусловни отговори (ескейпи).
2 3 4 5
Дни на тестиране
□ эаПпе_ВСа! 0.1 тд_BGal 0.5 тд_ШСа! 1.0 тд
*Р<0.05 и **Р<0.01 - спрямо контролната група от същия ден.
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
12
Контролните плъхове не показаха статистически достоверни разлики в броя междутренировъчни преминавания както по време на обучителната сесия, така и при теста за съхранение на паметовите следи (Фигура 3).
Животните, третирани с най-ниската доза 0.1 мг/кг галантамин увеличиха статистически значимо броя на междутренировъчните преминавания на 2-ри (Р<0.05),
3-ти (Р<0.01), 4-ти и 5-ти (Р<0.05) дни обучение в сравнение с контролите за същите дни. Плъховете получили средната доза 0.5 мг/кг галантамин не показаха нарастване на броя междутренировъчни преминавания през 5-те дни обучение, спрямо контролата за съответните дни. Експерименталните животни третирани с 1.0 мг/кг галантамин значимо повишиха броя междутренировъчни преминавания на 1-ви (Р<0.05), 2-ри (Р<0.01), 3-ти,
4-ти и 5-ти ден (Р<0.05) от сесията за обучение, в сравнение с контролата от съответните дни (Фигура 3).
При теста за съхранение на паметовите следи, проведен на 12-ти ден от началото на експеримента, само плъховете получили двете по-ниски дози галантамин (0.1 и 0.5 мг/ кг) показаха статистически значимо увеличен брой междутренировъчни преминавания (Р<0.05), спрямо контролата от същия ден. Групата, получавала най-високата доза от 1.0 мг/кг галантамин не промени съществено броя на междутренировъчните преминавания, в сравнение с групата третирана само с физиологичен разтвор за съответния ден (Фигура 3).
Фигура 3. Ефекти на галантамина изследвани по теста за обучение с наказателно подкрепление (шатъл бокс) на плъхове. Брой междутренировъчни преминавания.
□ заИпе ВСа! 0.1 тд ВСа! 0.5 тд ВСа! 1.0 тд
*Р<0.05 и **Р<0.01 - спрямо контролната група от същия ден.
Обсъждане
Интересен е фактът, че при теста за активно обучение животните получили най-малката и най-голяма дози галантамин, съответно 0.1 мг/кг и 1.0 мг/кг, показват най-добри резултати по средата на обучителния процес, но не ги съхраняват трайно. Тази тенденция за обучение се наблюдава ясно и по броя безусловни отговори (избягвания) направени от същите експериментални групи, но много по-силно изразени при дозата 1.0 мг/кг през всички дни на обучителната сесия и при теста за памет. Галантамина и в трите приложени от нас дози показа само тенденция за формиране на трайни паметови следи с помощта на наказателно подкрепление.
Нашите резултати са в подкрепа на получените от други автори данни (Iliev и съавт., 2000) за подобряващия ефект на галантамина върху обучението, приложен еднократно в двойно по-голяма доза на плъхове с модел на исхемия (оклузия на каротидната артерия) и тествани също в шатъл-бокс. Техните данни потвърждават, че галантамина може директно да повлияе ранните патологични механизми на увреждане на ЦНС. Подобряващи ефекти на галантамина и такрина върху паметовите функции на стари плъхове при тест за пасивно обучение са открити също от Rispoli и съавт. (2006). Това е резултат от повишените нива на ацетилхолина и стимулация и алостерична модулация на никотиновите рецептори в някои мозъчни региони играещи ключова роля в когнитивните процеси (Francis P, 2005). Галантаминът също предпазва кортикалните неврони от оксидативния стрес индуциран от бета-амилоидния пептид (Melo et al., 2009).
Локомоторната активност, демонстрирана чрез междутренировъчните преминавания, не се промени съществено при контролната група плъхове. Стимулиращият ефект на галантамина върху ЦНС и периферната активация на никотиновите рецептори доведе до двукратно и трикратно по-голяма спрямо контролата двигателна активност на опитните животни приели 0.1 и 1.0 мг/кг галантамин през целия обучителен период. Трайно увеличена двигателна активност, съхранена при теста за памет наблюдавахме при най-малката доза галантамин.
При хора тази подобрена двигателна активност спомага за изпълнение на ежедневни дейности като способността на пациентите да се мият, хранят и обличат сами, което облекчава тях самите и тяхните близки. Това е доказано при клинични проучвания (Iraizoz et al., 1999). Лекуваните с галантамин пациенти започват да се изразяват по-добре, стават по-концентрирани и имат подобрена краткосрочна памет. Тези подобрения се наблюдават още в края на първата година от началото на терапията.
През последните години към галантамина се проявява голям клиничен интерес. Обобщените данни от няколко клинични проучвания допълват, че към галантамин прилаган в продължение на 2 години не се е развил толеранс (Lanctot et al., 2009).
Всички тези факти взети заедно, добавяйки към клиничната ефективност добра поносимост и значително по-ниска цена, в сравнение с тази на ривастигмин или донепезил, вероятно ще направят галантамина предпочитано лекарствено средство за лечение на лека и средно тежка степен на Алцхаймерова болест.
Представените експериментални данни са част от научен проект Н0-03/2012 г., финансиран от Медицински Университет - Пловдив.
Литература:
1. Akaike A, Takada-takatory Y, Kume T, Izumi Y (2010). Mechanisms of neuroprotective effects of nicotine and acetylcholinesterase inhibitors: role of alpha4 and alpha7 receptors in neuroprotection. J Mol Neurosci., 40(1-2): 211-216.
2. Bond M, Rogers G, Peters J, Anderson R, Hoyle M, Miners A, Moxham T, Davis S, Thokala P, Wailoo A, Jeffreys M, Hyde C (2012). The effectiveness and cost-effectiveness of donepezil, rivastigmine and memantine for treatment of Alzheimer's disease: a systematic review and economic model. Health Technol Assess., 16(21):1-470.
3. Busquet P, Capurro V, Cavalli A, Piomelli D, Reggiani A, Bertorelli R (2012). Synergic effects of galantamine and memantine in attenuating scopolamine-induced amnesia in mice. J Pharmacol Sci., 10: 1-5.
4. Coyle JT, Geerts H, Sorra K, Amatniek J (2007). Beyond in vitro data: a review of in vivo evidence regarding the allosteric potentiating effect of galantamine on nicotinic acethylcholine receptors in Alzheimer's neuropathology. J. Alzheimer's Dis., 11:491-507.
5. Francis P (2005). In the interplay of neurotransmitters in Alzheimer's disease. CNS Spectr., 10(18): 6-9.
6. Iraizoz I, Guijarro JL, Gonzalo LM, de Lacalle S (1999). Neuropharmacological changes in the nucleus basalis correlate with clinical measures of dementia. Acta Neuropathol (Berl), 98(2): 186-196.
7. Kihara T, Shimohama S, Urushitani M, Sawada H, Kimara J, Kume T (1998). Stimulation of alpha4beta2 nicotinic acethylcholine receptors inhibits beta-amyloid toxicity. Brain Res., 792: 331-334.
8. Lanctot KL, Rajaram RD, Herrmann N (2009). Therapy for Alzheimer's disease: How effective are current treatments? Ther. Adv. Neurol., Dis., 2(3): 163-180.
9. Melo JB, Sousa C, Garçâo P, Oliveira CR, Agostinho P (2009). Galantamine protects against oxidative stress induced by amiloid-beta peptide in cortical neurons. European Journal of Neuroscience, 29: 455-464.
10. Rispoli V, Marra R, Costa N, Scipione L, Rotiroli D, De Vita D, Liberatore F, Carelli V (2006). Choline pivaloil ester strengthened benefit effects of Tacrine and Galantamine on electroencephalographic and cognitive performances in nucleus basalis magnocellularis-lesioned and aged rats. Pharmacol Biochem Behav., 84(3): 453-467.
