CC BY
46
УДК 535.37, 546.59
Ю.В. Барбашов1,2, А. Д. Залесский1,2, А. А. Астафьев2, А. А. Горенберг2,
А. В. Айбушев2, О. М. Саркисов2, В. А. Надточенко3, О. А. Кокшарова4,
И. А. Хмель4
1 Московский физико-технический институт (государственный университет)
2Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН 3Институт проблем химической физики РАН 4Институт молекулярной генетики РАН
Двухфотонная люминесценция цианобактерий АпаЪаепа sp. РСС 7120 в присутствии эндогенно образованных золотых наночастиц
Обнаружена и исследована двухфотонная люминесценция и генерация второй гармоники в цианобактериях Anabaena sp. РСС 7120 с эндогенно образованными наночастицами золота. В системе с Au наночастицами уровень двухфотонной люминесценции существенно выше, чем в контрольных образцах цианобактерий без золотых наночастиц. Показано, что усиленная двухфотонная люминесценция связана с усилением ближнего электромагнитного поля модами локализованного поверхностного плазмон-поляритона Au наночастиц. Обсуждается возможность применения Au наночастиц для визуализации биологической ткани в сканирующем многофотонном люминесцентном микроскопе при возбуждении в ближнем ИК-диапазоне титан-сапфировым фемтосекундным лазером.
Ключевые слова: двухфотонная люминесценция, генерация второй гармоники, золотые наночастицы, цианобактерии, поверхностный плазмон-поляритон.
Введение
В настоящее время исследование нелинейных оптических свойств наночастиц, тонких пленок или небольших агломератов наночастиц благородных металлов является актуальной темой, что обусловлено их применениями в визуализации биологической ткани и в оптоэлектронных устройствах [1]. Долгое время металлы рассматривались как нелюминес-цирующие объекты, так как квантовый выход их люминесценции существенно ниже 10-10. Однако в 1969 году Мурадян впервые обнаружил слабую однофотонную фотолюминесценцию шершавой поверхности золота с квантовым выходом порядка 10-10 [2]. 30 лет спустя было установлено наличие однофотонной люминесценции у наночастиц золота с размером до 5 нм [3]. Недавно была обнаружена двухфотонная люминесценция и генерация второй гармоники в наноскопических объектах золота или серебра при возбуждении фундаментальной гармоникой в ближнем ИК-диапазоне титан-сапфирового лазера. Это явление связано с усилением падающего электромагнитного поля световой волны в ближнем поле наночастиц и в зазорах между наночастицами из-за возбуждения плазменных мод локализованного плазмонного резонанса [4, 5, 6, 7]. Эффекты усиления многофотонной люминесценции и генерации высших гармоник, связанные с плазмонным резонансом металлических наночастиц, представляют в настоящее время значительный интерес для многофотонной микроскопии биологических объектов [1, 8].
Целью данной работы является экспериментальное исследование двухфотонной люминесценции цианобактерий Anabaena sp. РСС 7120, содержащих эндогенно образованные наночастицы золота, и изучение вопроса о возможности применения наночастиц золота в качестве контрастирующего агента для двухфотонной сканирующей микроскопии бактериальных клеток при возбуждении образца фундаментальной гармоникой фемтосекундного титан-сапфирового лазера.
Экспериментальная часть
Материалы
HAuC14Aldrich (99.99%). Na2EDTA, K2HP04,MgS04,CaCl2, FeCl3, Na2C03, H3BO3, MnCb, ZnS04, Na2Mo04 • 2H20, CuS04 • 5H20, Co(N03)2 • 6H2O марки хч.
Спектрофотометрия
Спектры поглощения суспензии клеток с золотыми наночастицами и без них получены в 1 мм кювете при комнатной температуре на спектрофотометре Shimadzu. Оптические изображения клеток получены с использованием микроскопа Leica с масляно-иммерсионным объективом 100х N.A. 1.4 в неполяризованном и поляризованном свете.
Растровая электронная микроскопия
Электронно-микроскопические изображения клеток были получены под растровым электронным микроскопом высокого разрешения JSM-7001F производства фирмы JEOL.
Условия роста Au наночастиц
В работе был использован штамм цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120, выращенный на минимальной среде BG11 в 250 мл колбах при 25 °С и постоянном освещении. Состав среды на 1л (в г): Na2EDTA 0.001; К2НРО4О.О4; MgS04 • 7Н2О 0.075; CaCb • 2ЩО 0.036;
лимонная кислота 0.006; FeC^ • 6Н2О 0.003; Na^03 0.02. Раствор микроэлементов (в г):
3 3 2 2 4 2 2 4 2 4 2
3 2 2
4
мМ0,25 мМ. Пробы отбирались и хранились в кельвинаторе при -70 °С.
Расчет спектров золотых наночастиц
Расчет экстинкции, спектров поглощения и рассеяния золотых сферических наночастиц проводили в рамках теории Ми [13]. Сечения Qj = a%f(к'г2) (г - радиус наночастицы, ai СООТВ. сечение) ЭКСТИНКЦИИ Qeæi) поглощения Qabs и раССвЯНИЯ Qsca (Qext = Qabs + Qsca)j а также усиление поля Е в окрестности наночастиц определяли из расчета коэффициентов Ми с использованием MatLab функций пакета SPlaC package vl.0[9].
Расчет усиления поля в димере золотых наночастиц
Расчеты были выполнены с помощью численного метода решения уравнений Максвелла, записанных в конечных разностях (FDTD)[10]. Экспериментальные данные по золотым наночастицам были взяты из базы данных SOPRA [11]. Для корректного описания распределения полей в зазоре между наночастицами во всех расчетах использовалась численная сетка с шагом 0.25 нм.
Многофотонный люминесцентный микроскоп
Для возбуждения флуоресценции использовался фемтосекундный титан-сапфировый лазер (Tsunami, Spectra-Phvsics). Частота следования импульсов 80 MHz, длительность импульсов до 50 фс. Максимальная мощность лазера (средняя по времени) - 0,8 Вт. Диапазон перестройки длины волны генерации от 720 до 1000 нм, в данной работе использовали дину волны 840 нм. Луч возбуждения, после прохождения поляризатора, заводился в объектив инвертированного флуоресцентного оптического микроскопа Olympus IX 71 через дихроическое зеркало (Newport) и фокусировался на поверхность образца, закреплённого на предметном столике микроскопа. Было обнаружено, что высокая мощность падающего излучения может приводить к перфорации стенки образца, поэтому излучение, падающее на объектив, ослаблялось с помощью системы поляризатора и полуволновой пластины до величины в 3 мВт. В работе использовался масляно-иммерсионный объектив Olympus ЮОх
UPLSAPO с числовой апертурой 1,4. Диаметр получаемой в фокальной плоскости лазерной перетяжки составлял 0,5 мкм. Флуоресценция образца собиралось этим же объективом и направлялась на CCD-камеру Sony Exwave HAD. Изображение получали следующим образом: область сканирования разбивалась на определённое число пикселей (64 х 64 = 4096), образец перемещался сканирующей платформой относительно фокуса объектива, так что сфокусированный пучок последовательно попадал на каждый из пикселей и сигнал флуоресценции регистрировался CCD-камерой. Работа камеры была синхронизирована с движением сканирующей платформы. В результате сканирования получалась совокупность спектров в нашем примере 4096, которые преобразовывались в единое изображение программой обработки данных Megaspee, написанной в нашей лаборатории в среде разработки Lab View.
Результаты и их обсуждение
Добавление НАиС14 в концентрации metricconverterProductID0,25 мМ0,25 мМ к суспензии цианобактерий Anabaena sp. РСС 7120, приводящее к эндох’енному образованию наночастиц золота, используется как метод введения наночастиц золота в клетку бактерии. В данной работе механизм роста наночастиц не рассматривается. На рис. 1 представлены электронно-микроскопические изображения цианобактерий с наночастицами золота. Средний диаметр наночастиц, определенный с помощью анализа этих изображений, составил 17 ± 4 нм. Разрешение микроскопа близко к 5 нм, поэтому нельзя исключить возможность образования и более мелких наночастиц с размером менее 5 нм.
О 10 20 30 40
диаметр(нм)
Рис. 1. Изображение группы клеток цианобактерий АпаЪаепа яр. РСС 7120 с эндогенно образованными наночастицами золота. Наночастицы золота выглядят в виде светлых точек на поверхности стенки клетки. Гистограмма размера наночастиц золота на данном снимке
На рис. 2А показано, что образование золотых наночастиц приводит к существенному изменению спектра оптической плотности суспензии цианобактерий АпаЪаепа ер. РСС 7120, а именно: появляется широкий пик на 582 нм, связанный с плазмонным резонансом золота. Этот пик существенно сдвинут в красноволновую область спектра по сравнению с предсказаниями теории Ми. На рис. 2Б, В, Г изображены рассчитанные по теории Ми спектры сферических золотых наночастиц с диаметрами 17 нм, 30 нм и 45 нм. В случае наноначастиц ереднм'о размера (17 нм) основной вклад в экстинкцию (оптическую плотность) вносит поглощение, в то время как вклад рассеяния становится существенным лишь для самых крупных наночастиц (45 нм). Экспериментально измеренный ник 582 нм существенно сдвинут но сравнению с расчетным пиком 531нм для самых крупных наночастиц. Кроме это!'о, пик 582 нм существенно шире расчетных пиков по теории Ми. Эти
расхождения указывают на появление в системе наночастиц золота в цианобактериях низкочастотных плазменных мод, не характерных для сферически-симметричных наночастиц. Низкочастотные плазменные моды могут быть обусловлены взаимодействием нлазмонов соседних наночастиц и отклонением индивидуальных наночастиц от сферической формы [12, 7, 5, 13]. Из рис. 1 видно, что в клетках цианобактерий наночастицы золота отличаются от сферической формы и образуют кластеры, поэтому можно считать, что эти факторы вносят значительный вклад в результирующий спектр.
Рис. 2. Спектры наночастиц золота эндогенно образовавшихся в цианобактериях АпаЪаепа яр. РСС 7120 (А) и спектры наночастиц золота, рассчитанные согласно теории Ми (Б, В, Г). А. 1 спектр контрольного образца суспензии цианобактерияй АпаЪаепа яр. РСС 7120 без наночастиц золота. 2 спектр суспензии цианобактерияй АпаЪаепа яр. РСС 7120 с наночастицами золота. Б, В, Г диаметр наночастиц золота равен 17, 30 и 45 нм соответственно. Метка А поглощение, Б рассеяние иЕ - экстинкция. Е = А + Б. Сечение равно <г*/ (этт2), г — радиус наночастицы, <гг соответственно сечение экстинкции Е, поглощения А или рассеяния Б
Из сравнения электронно-микроскопического изображения (рис. ЗГ) и изображения, полученного с помощью сканирующего люминесцентного микроскопа при возбуждении фемтосекундным лазером на длине волны 840 нм (рис. ЗА), можно заключить, что наблюдаемый объект клетка цианобактерии. Также стоит отметить, что интенсивность люминесценции цианобактерий из контрольного образца без нано частиц золота существенно ниже (рис. ЗВ). На рис. ЗБ изображен профиль интенсивности люминесценции по линии среза, показанной на рис. ЗА. Увеличение сигнала ближе к краям клетки обусловлено дополнительным вкладом боковых стенок.
Спектры люминесценции цианобактерий с нано частицами золота и без них представлены на рис. 4. Интегральная интенсивность люминесценции в контрольном образце клеток оказалась приблизительно на порядок ниже. Также на рис. 4 представлен спектр двухфотонной люминесценции золотых нано частиц на поверхности стекла при возбуждении в ближнем ИК-диапазоне [13]. Стоит отметить, что люминесценция цианобактерий
Рис. 3. Изображение клеток цианобактерий АпаЪаепа яр. РСС 7120. А - изображение, полученное с помощью сканирующего люминесцентного микроскопа образца с золотыми наночастицами. Интенсивность люминесценции в спектральном диапазоне от 400 до 680 нм. Возбуждение на длине волны 840 нм. Б - профиль интенсивности люминесценции, сняты по линии, показанной на вставке А. В - контрольный образец клеток без золотых наночастиц. Г. изображение отдельных клеток с золотыми наночастицами, полученное с помощью растрового электронного микроскопа
АпаЪаепа яр. РСС 7120 с золотыми наночастицами характеризуется двухфотонными процессами. Экспериментально измеренный степенной показатель зависимости интенсивности люминесценции от мощности накачки равен 1.9 ± 0.2 (рис. 4Б). Спектр люминесценции цианобактерий с золотыми наночастицами близок по форме к спектру люминесценции чистых золотых наночастиц, за исключением области 410 440 нм, в которой для клеток с золотыми наночастицами наблюдается пик, по-видимому, относящийся ко второй гармонике фемтосекундного лазера (420 нм). Подобный пик, но с интенсивностью в 12 раз меньше наблюдается в спектре контрольного образца клеток без наночастиц золота. Ни в спектре низкоинтенсивной люминесценции контрольного образца, ни в спектре клеток с наночастицами золота никаких характерных спектральных пиков в области 440 680 нм не выявляется. В спектральном окне 440 680 нм наблюдается подобие широкополосного спектра люминесценции Аи наночастиц в цианобактериях и Аи наночастиц на стекле. Поэтому можно предположить, что в системе цианобактерий с эндогенно образовавшимися золотыми наночастицами в сигнале люминесценции присутствует усиленная люминесценция от биоматериала клеток плюс люминесценция золотых наночастиц. На рис. 5 показано изображение клеток цианобактерий в виде сигнала второй гармоники. Изображенный на рис. 4А интегральный сигнал двухфотонной люминесценции и сигнал второй гармоники на рис. 5 практически совпадают. Следует отметить, что в изображениях наблюдаются пятна повышенной интенсивности люминесценции, и характерно то, что положения этих пятен также совпадают. Качественно это совпадение объясняется тем обстоятельством, что область вблизи кластера золотых наночастиц характеризуется более высоким коэффициентом усиления поля, поэтому происходит дополнительное усиление люминесценции и генерации второй гармоники. Таким образом, золотые наночастицы выступают в качестве контрастирующего агента усиливают двухфотонную люминесценцию цианобактерий и Аи наночастиц, а также увеличивают генерацию второй гармоники органического биоматериала клетки.
Рис. 4. А - спектр люминесценции 1-цианобактерий АпаЪаепа вр. РСС 7120 с эндогенно образовавшимися Аи наночастиц, 2 - спектр люминесценции золотых наночастиц. Возбуждение фемтосекундными импульсами с длиной волны 840 нм. Б - зависимость интегральной интенсивности люминесценции от мощности возбуждения
Рис. 5. Изображение цианобактерий АпаЪаепа вр. РСС 7120 с золотыми наночастицами в виде второй гармоники фемтосекундного лазера
Указанные нелинейно-оптические механизмы связаны с усилением поля Е в ближнем поле золотых наночастиц. Представляет интерес вопрос о коэффициенте усиления поля Е в ближнем поле отдельных сферических наночастиц и в промежутке между наночастицами, например в димере, так как этот вопрос имеет практическое значение. При возбуждении плазмона локальное иоле Е^ос возле поверхности наночастицы будет существенно отличаться от падающего поля Ejn по амплитуде и ориентации вектора поля, а также будет существенно зависеть от частоты поля, поляризации и координаты относительно частицы [14]. В данной работе представляет интерес усредненное по сферической координате поле (< соs2в > = 1/3, < соs4в > = 1/5). На рис. 6 представлена зависимость параметра усиления поля < F_Loc > = < | Е Loe (и) |2 / | Ein |2 > от поляризации, расстояния до центра
<>
наночастицы. Однако от размера наночастиц существенно зависит пространственная локализация поля, оно более сильно локализовано возле мелких наночастиц. Как видно из этого <>
Характерный масштаб наиболее интенсивных полей вблизи сферической наночастицы равен размеру наночастицы а. Качественно рис. 6 демонстрирует, что существенное усиление
нелинейно-оптического воздействия на материал клетки локализовано в близкой окрестности наночастиц золота: ~ 2 нм для а = 17 нм и ~ 5-7 нм для а = 45 нм. Можно ожидать увеличения эффективности двухфотонного процесса взаимодействия света с веществом
стенки клетки в <Р_Ьос>2 ~ 42 . 16 раз в ближнем поле наночастиц. Экспериментально
измеренное усиление составило ~ 10-12. Из изображения наночастиц под электронным микроскопом (рис. 1) видно, что наночастицы достаточно разреженно покрывают материал клетки. Поэтому объем моды усиления ноля вокруг отдельных наночастиц по отношению к объему клетки не велик, И следует предположить механизм более СИЛЬНОГО усиления ПОЛЯ. Как видно из того же рис. 1 в реальной системе присутствуют ансамбли наночастиц, но-
<>
максимальных значений, чем те, что предсказывает теория Ми. На вставке к рис. 6 приведен коэффициент усиления, определенный как отношение \ЕЬос(ш) \/\Дм\- Коэффициент усиления достигает значений до 12, т.е. <Р_Ьос> ~ 122 = 144, и, следовательно, двухфотонный процесс имеет усиление в ~ 2 104 раз. В случае димера наночастиц характерный масштаб пространства локализации наиболее интенсивных полей (рис. 6) уже не диаметр наночастицы а, а расстояние между наночастицами (1. [13].
<
О 20 40 60 ВО
расстояние (нм)
Рис. 6. Усиленно поля в окрестности сферической Ап наночастицы в зависимости от расстояния до центра наночастицы. Размер наночастицы указан на рисунке. На вставке показана зависимость коэффициента усиления поля в промежутке между золотыми наночастицам с диаметром 10 нм в зависимости от расстояния между наночастицами
Выводы
Золотые наночастицы, эндогенно образующиеся в цианобактериях АпаЬаепа ер. РСС 7120, способны выступать в качестве контрастирующего агента для двухфотонной люминесценции клеток в поле люминесцентного микроскопа при возбуждении фемтосекундным лазером на длине волны 840 нм.
Аи нано частицы в клетках привносят сигнал двухфотонной люминесценции, присущей металлическим наночастицам, а также усиливают генерацию второй гармоники и двухфотонную люминесценцию органического биоматериала.
Эффект усиления генерации второй гармоники и двухфотонной люминесценции в присутствии золотых наночастиц обусловлен усилением поля в ближнем поле золотых наночастиц плазмонным резонансом и усилением поля в кластерах золотых наночастиц.
Литература
1. Paresh Chandra Ray. Shape Dependent Second Order Nonlinear Optical Properties of Nanomaterials and Their Application in Biological and Chemical Sensing // Chem. Rev. -2010. - V. 110. - P. 5332-5365.
2. Mooradian A. Photoluminescence of Metals // Phvs. Rev. - 1969 - Lett. 22, N. 185.
3. Wilcoxon J.P., Martin J.E., Parsapour F., Wiedenman B. and Kelley D F. Photoluminescence from nanosize gold clusters // J. Chem. Phvs. - 1998 - V. 108. - P. 91379143.
4. Beversluis M.R., Bouhelier A., Novotny L. Continuum generation from single gold nanostructures through near-fieldmediated intraband transitions // Phvs. Rev. B. - 2003. - V. 68. - P. 115433.
5. Aiboushev A.V., Astafiev A.A., Lozovik Y.E., Merkulova S.P., Nadtochenko V.A., Sarkisov O.M., Willander M. Enhanced luminescence and two-photon absorption of silver nanoclusters // Phvs. Status Solidi. C. - 2009. - N6. - P. 162-166.
6. Zolotavin P., Permenova E., Sarkisov O., Nadtochenko V., Azouani R., Portes P., Chhor K., Kanaev A. Two-photon luminescence enhancement of silver nanoclusters photodeposited onto mesoporous Ti02 film // Chemical Physics Letters. - 2008. - V. 457 - P. 342-346.
7. Aiboushev A. V., Astafiev A. A., Lozovik Yu. E., Merkulova S. P., Nadtochenko V. A., Sarkisov О. M. Enhanced luminescence of silver nanoclusters in mesoporous film // Physics letters. - 2008. - V. 372, I. 31. - P. 5193-5197.
8. Zipfel W.R., Williams R.M., Webb W.W. Nonlinear magic: Multiphoton Microscopy in the Biosciences // Nature Biothechnologv. - 2003 - N. 21(11) - P. 1369-1377.
9. SPlaC: SERS and plasmonics Codes // http://www.victoria.ac.nz/raman/book/codes.aspx
10. Taflove A., Hagness S.C. Computational Electrodynamics: The Finite-Difference TimeDomain Method // Artech House. - 2005.
11. Sopra S.A. // http://www.sspectra.com/
12. Климов В.В. Наноплазмоника. - М.: Физматлит. - 2010.
13. Айбушев А.В. Фемтосекундная фотоника наноструктурированных систем Ag/Ti02 и Au/Ti02 // Диссертации на соискание ученой степени кандидата физикоматематических наук. - М., 2009.
14. Le Ru Е.С., Etchegoin P.O. Principles of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy and Related Plasmonic Effects. - Amsterdam: Elsevier. - 2009.
Поступила в редакцию 17.05.2011.
