CC BY
60
Доставка генов в органы с помощью невирусных систем направленного транспорта с различной гидрофобностью и с лактозной адресной группой
Е.В. Богданенко 1, М.Я. Ибрагимова 2, Э.Т. Зиннатуллина 2, Р.И. Шакирова 2,
А.Ю. Храмова 2, Р.И. Жданов 12
1 НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
Gene transfer to mice organs using non-viral systems for targeted delivery with different hydrophobicity and with lactose addressing group
E.V. Bogdanenko 1, M.Ya. Ibragimova 2, E.T. Zinnatullina2, R.I. Shakirova 2, A.Y. Khramova 2, R.I. Zhdanov1-2
1 SRI of General Pathology and Pathophysiology of RAMS, Moscow
2 Kazan (Volga region) federal university, Kazan
В работе исследовано биораспределение липоплексов, сформированных из веществ холеним I-III, содержащих один, два или три остатка холестерина, и эукариотической 14С-ДНК и(или) репортерных генов, в органах мышей в зависимости от трех способов введения комплексов (внутрибрюшинно, в воротную вену печени или почечную артерию). Показано, что при внутрибрюшинном введении биораспределение (между селезенкой и кишечником) не зависит от липидного состава липосом, а при внутривенном и артериальном может определяться природой липида. Достигнута также эффективная трансфекция in vivo и экспрессия репортерного гена при введении липоплекса на основе лактозолипида IV и препарата дихоленим (1:1 по массе) в воротную вену печени. Гистохимически и спектрофотометрически показана экспрессия этого гена (не ниже 0,3 мкг/г ткани) в легких, печени и селезенке. Введение холестеринового фрагмента в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики липоплексов: создает оптимальное соотношение гидрофобность/гидро-фильность, стабилизирует их, обеспечивает оптимальное значение константы мицеллообразования. Описанные липоплексы перcпективны для направленной доставки генов в органы и ткани.
Ключевые слова: биораспределение липоплексов, холеним I-III, лактозолипид IV.
Biodistribution of lipoplexes formed of cholenim substances I-III, containing one, two or three cholesterol moieties, and eukaryotic ’’‘’^DNA and(or) reporter gene into mice organs using a variety of administration routes (intraperitoneally, i.p.; portal vein or left renal artery) is studied in this paper. It is shown that biodistribution doesn't depend on lipoplex lipid composition under i.p. administration, and depends on lipid nature under vein and artery administration. Effective in vivo transfection and reporter gene expression are demonstrated under portal vein administration of lipoplex formed of dicholenim IIandlactosylatedlipid IV(1 to 1 mass ratio). In the case, the fi-Gal gene expression (above 0,3 mcg/ g of tissue) is demonstrated in lungs, liver and spleen histochemically and spectrophotometrically. Introduction of cholesterol moieties into oligoethylenimine structure results in optimal hydrophilicity/hydrophobicity ratio, their stabilization, and optimal value of critical constant of micelle formation. There are certain outlooks due to usage of the lipoplexes described for targeted gene delivery.
Key words: biodistribution of lipoplexes, cholenim
substances I-III, lactosylated lipid IV.
Генная терапия является одним из перспективных направлений для лечения широкого спектра наследственных заболеваний и патологических состояний [1—3]. Ключевой стадией этой биомедицинской технологии является перенос терапевтического гена в соответствующие ткани и клетки с помощью вирусных или невирусных векторных систем [4—6]. Самыми эффективными системами переноса генов в целях генотерапии оказались вирусные векторы [7], характеризующиеся высокой тканеспецифичностью. Тем не менее, они обладают некоторыми ограничениями и недостатками, среди которых самыми серьезными являются иммуногенность при повторных инъекциях [8] и возможность инсерционного мутагенеза [2]. Будущие векторные системы для генного переноса, вероятно, либо будут создаваться на основе клеток, например, стволовых [9, 10], в варианте генно-клеточной терапии, либо будут сочетать в себе
e-mail: [email protected]
свойства вирусных и невирусных систем [11]. На современном этапе развития основной проблемой в технологиях генной терапии является проблема адресной доставки терапевтических генов в целевые ткани и клетки и их контролируемая эффективная экспрессия [12]. Поэтому поиск эффективных невирусных систем для направленного транспорта генов в протоколах генотерапии остается актуальной задачей.
В работе впервые исследовано биораспределение липоплексов, сформированных из веществ холеним I-III и эукариотической 14С-ДНК, в тканях экспериментальных животных (мышей) в зависимости от трех способов введения комплексов (внутрибрюшинно, в воротную вену печени и почечную артерию). Достигнута также эффективная трансфекция in vivo и экспрессия репортерного гена при введении липоплекса на основе лактозолипида IV и препарата дихоленим
в воротную вену печени. Введение холестеринового фрагмента в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики липоплексов: создает оптимальное соотношение гидрофобность/гидрофильность, стабилизирует их, обеспечивает оптимальное значение константы мицеллообразования, и перспективно для направленной доставки генов.
Материал и методы
Все использованные в работе реагенты были химически чистые, вода очищалась системой миллиQ. Растворители перед применением перегоняли. В качестве липидов в работе использовались фос-фатидилхолин (ФХ), холестериновые производные ^три(этиленпропилен)имина, искусственные сперминоподобные соединения — монохоленим I, дихоленим II, и трихоленим III [12] и гликолипид IV (лак-тозилированное производное дипальмитоилового эфира янтарной кислоты) [14].
Липосомы были получены по методу упаривания из обращенной фазы при ультразвуковой обработке [15]. В качестве растворителя использовали хлороформ или диэтиловый эфир. Пленку липида гидратировали стерилизованной водой или физиологическим раствором при встряхивании с последующей обработкой взвеси на ультразвуковом дезинтеграторе (4°С, 5 мин) и получали суспензию полиби-слойных липосом. Полибислойные липосомы для трансфекции in vivo были сформированы из смеси, содержащей ФХ (70 мол. %), дихоленим II (10 мол. %),) и лактозолипид IV (20 мол. %). Растворы исходных липидов хранили при -80°С, а липосомы — при 4°С под азотом и использовали в течение двух недель [16].
Тотальная 14С-тимидин меченая общая ДНК была получена из эукариотических клеток линии НГУК-1, выращенных на среде с 14С-тимидином (15 мкКи/мл, Изотоп, Россия) как описано ранее [17]. 14С-ДНК обрабатывали ультразвуком при частоте 22 кГц (УЗДН-2Т, Россия, 15 мин с 30 с остановкой после каждой минуты озвучивания при 0°С, 10 циклов) с образованием фрагментов 4—6 т.п.о. длиной (данные электрофореза). Радиоактивность ДНК определяли спустя 1 ч после добавления сцинтилляционной жидкости ЖС-8 к жидким пробам, находившимся в пластиковой пробирке. Репортерная плазмида рСМV-SPORT-pGsi, (Bio Life Tech, Cat. No. 10586-04) — получена из лаборатории N. Duzgunes, Pacific Univercity, San Francisco (США).
Исследование эффективности генного переноса in vivo формировали нуклеолипосомные комплексы (липоплексы), смешивали радиоактивную или плаз-мидную ДНК с холенимами или липосомами и инкубировали смесь в течение 30 мин. Комплексы вводили мышам линии ICR массой 36—40 г возрастом 4—6 мес. внутрибрюшинно, в воротную вену печени или почечную артерию. Липоплексы вводились мышам по методикам, описанным ранее [6, 16].
Вещества холеним I-III вводились мышам в различных соотношениях с 14С-тимидин меченой ДНК, а липоплексы, состоявшие из ДНК и липосом ФХ/ лактозилированный липид IV, имели соотношение этих составляющих 1:1 (100 мкг ДНК и 100 мкг липосом; 50—100 мкг/мышь). Через сутки после введений животных забивали и извлекали у них внутренние органы, которые сначала взвешивали, а затем лизировали 0,6 N раствором КОН при 37°С.
Готовые лизаты нейтрализовывали 0,6 N раствором HClO4. При использовании для генного переноса веществ холеним сцинтилляционную жидкость добавляли к жидкой нейтрализованной пробе. В случае использования лактозилированных липосом пробы наносили на фильтры, которые после просушивания и помещения во флаконы заливали сцинтилляцион-ной жидкостью. Подсчет радиоактивности велся в счетчике «Rakbeta». Проводили пересчет содержания метки на единицу массы органа [16, 17]. Доставка плазмиды рСМV-SPORT-p-Gаl для достижения экспрессии гена р-галактозидазы в органах мышей осуществлялась липосомами, состоящими из ФХ и дихоленима (1:1 по массе), и в комплексе со смешанными липосомами состава ФХ / лактозолипид / дихоленим (100 мкг ДНК на 100 мкг липосом).
Результаты и обсуждение
Перед исследованием биораспределения невирусных систем доставки генов на основе холенимов I-III in vivo нами была оценена их активность в генном переносе на культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы НГУК-1 с использованием стандартных методов [6].
Эффективность трансфекции клеточных культур. На рисунке представлены данные по эффективности трансфекции плазмиды pCMV-SPORT-p-Gal в клетках НГУК-1 с помощью геносом на основе препаратов моно-, ди- и трихоленим I-III при различных соотношениях ДНК/холеним.
Рис. 1. Эффективность трансфекции клеток НГУК-1 с помощью липоплексов веществ холеним и плазмидной генетической конструкции pCMV-SPORT-p-Gal (пг/105 клеток) при различных соотношениях ДНК/холеним.
Ордината - эффективность экспрессии, пг/105 клеток, абсцисса - величина соотношения масс ДНК/холеним
Максимальный уровень экспрессии гена в этих клетках был достигнут для комплекса ДНК/монохоле-ним в соотношениях 2:1 или 1:1 — 32—35 пикограмм белка на 105 клеток. Для геносом ДНК/дихоленим в соотношениях 2:1 и 1:1 уровень экспрессии был 17 и 25 пг на 105 клеток соответственно. Уровень экспрессии гена р-галактозидазы в клетках НГУК-1 был существенно меньше, чем в случае с клетками РС-12 [13]. Наибольшая эффективность экспрессии — 187 и 113 пг (пикограмм)/105 клеток — была достигнута для монохоленима и дихоленима соответственно при соотношении ДНК/холеним 1:0,5. Для препарата три-холеним наибольшая эффективность генного переноса достигается при соотношении ДНК/олигокатион 1:0,3 — 56,6 пг/105 клеток, наименьшая — для вещества III при соотношении 1:1,5 (7,5 пг/105 клеток) (см. рис.). Эти результаты означают, что чем больше холестериновых остатков содержит холеним, тем меньшее его количество необходимо для достижения оптимума трансфекции. Эти данные коррелируют с физико-химическими свойствами соединений НИ.
Биораспределение 14С-тимидин меченой ДНК. В таблице представлены результаты — доля метки (% срт) от общего счета во всех органах — изучения биораспределения [14С]-ДНК после внутрибрюшин-ного введения ее липоплексов с препаратами ди-и трихоленим (соотношение (масса) 1:1) (строки 1 и 2). ДНК во всех случаях распределялось в основном между селезенкой и кишечником. Биораспределение липоплексов [14С]-ДНК с препаратом I аналогично. Это соответствует опубликованным данным по использованию катионных липосом и других медиаторов трансфекции при этом способе введения.
При введении комплекса [14С]-ДНК (50 мкг) с веществом дихоленим II в соотношении 1:1 в почечную артерию наблюдается не более, чем двухкратное увеличение включения метки в оперированную почку по сравнению с интактной (табл.). При
этом максимальное включение метки наблюдалось в сердце, на втором месте — легкие, как и при разных вариантах внутривенного введения. Это можно объяснить тем, что капиллярная сеть почки негустая, а кровоток в них очень быстрый, так что кровь быстро попадает в венозную систему и сердце. При изменении соотношения масс между [14С]-ДНК (15 мкг) и дихоленим II на 2:1 распределение резко меняется. ДНК практически не обнаруживается в интактной почке, а также в селезенке и кишечнике. На первом месте по количеству аккумулированной [14С]-ДНК находится сердце, на втором — печень, на третьем — оперированная почка, и только на 4-м — легкие, что уже значительно отличается от распределения обычных катионных препаратов. Это подтверждает тропность вещества II к печени при определенных способах введения ее комплексов с ДНК.
Результаты изучения распределения липоплексов [14С]-ДНК с веществом II при их введении в воротную вену печени мыши также представлены в таблице (строки 5—7). Максимальное содержание [14С]-ДНК при введении комплексов ДНК/дихоленим (1:1) оказалось в четырех органах: печени, селезенке, сердце и легких, почти по 20%, в 4 раза меньшие количества — в почках и кишечнике. При изменении соотношения ДНК/дихоленим II до 2:1 максимум [14С]-ДНК обнаруживается в печени, значительно уменьшается ее содержание в легких. Данные по биораспределению липоплексов [14С]-ДНК/холеним
I и [14С]-ДНК/холеним III (соотношение ДНК/холеним 1:1, доля метки (% срт) от общего счета во всех органах) при их введении в воротную вену мышей также представлены в таблице. Для вещества I максимальное содержание [14С]-ДНК было в селезенке и сердце (25 и 20%, соответственно), затем — в печени и почках (15%). В случае вещества III максимальное содержание [14С]-ДНК обнаружено в печени (25%), почках (20%) и крови (15%).
Содержание 14С-ДНК (кислотоосаждаемая фракция в тканях органов мышей ICR,
доля метки в % cpm от общего счета во всех органах) в органах через 24 ч после введения
липоплекса мышам
№ Способ введения липоплекса мышам Селезенка кишечник почки печень Сердце легкие кровь
Внутрибрюшинно
1 Монохоленим 70±14 18±4 3±0,5 0 7±2 3±0,5 -
2 Дихоленим 60±7 40±4 0 0 0 0 -
Почечная артерия
3 ДНК/Дихоленим, 1:1 по массе 10±4 2±0,3 23±4* 11 ±6** 10±4 36±4 10±4 -
4 ДНК/Дихоленим, 2:1 6± 1,5 0 * 3* ±* 20 40±5 26±4 10±4 -
Воротная вена печени
5 ДНК/Монохоленим, 1:1 25±4 11 ±3 15±3 17±3 21±4 13±3 6±1,5
6 ДНК/Дихоленим, 1:1 23±2 6±3 5±2 23±3 19±3 26±2 -
7 ДНК/Трихоленим, 1:1 15±3 10±2 20±4 26±4 8±2 11 ±2 16±3
Примечания: * — левая почка; ** — интактная, правая почка.
Таким образом, при весовом соотношении ДНК/ холеним 1:1 наиболее заметно различие в тропно-сти липоплексов между моно- и трихолестериновы-ми производными, а для дихоленима II характерно промежуточное распределение. Высокое содержание метки в крови для комплекса с холеним III может косвенно указывать на их сильное взаимодействие с клетками крови, а повышенное включение метки в печень, по-видимому, связано с тем, что в этом органе осуществляется утилизация разрушенных эритроцитов [18]. Изменение весового соотношения ДНК/ холеним в комплексе с 1:1 до 2:1 влияет на троп-ность к различным органам в тех же пределах, что и использование различных холенимов при одном и том же соотношении масс. Это объясняется тем, что вещество I при одном и том же весовом сотноше-нии с ДНК содержит в два раза больше катионных групп, чем вещество III. Однако количественное соотношение между гидрофобной и гидрофильной составляющими меняется противоположно, что может определять изменения в картине распределения.
Экспрессия гена p-галактозидазы как результат доставки липоплексами холеним. Амфифильные липосомы, состоящие из ФХ и дихоленим (1:1 по массе), были использованы для переноса плазмиды pCMV-SPORT-p-Gal при внутривенной инъекции, при соотношении ДНК/липид 1,6:1 (по массе). Через
2 сут. после переноса гена p-Gal инкубацией срезов органов с субстратом X-Gal, который под действием этого фермента разлагается с выделением яркосинего красителя индиго, удалось обнаружить экспрессию гена в легких и селезенке мышей гистохимически. Это свидетельствует, что наши липоплексы оказались способными проникать через эндотелий сосудов этих органов. Это соответствует распределению ДНК при использовании в генном переносе катионных липосом, что описано в литературе [18].
Мы наблюдали экспрессию гена p-Gal и при переносе плазмиды рСМV-SPORT p-Gsl липосомами ФХ / дихоленим/гликолипид IV (1:1,5 по массе). Гистохимическим методом мы обнаружили экспрессию этого гена преимущественно в клетках печени, она была невысокой и наблюдалась в основном в эпителии кровеносных сосудов и непосредственно вблизи от них, что может говорить о недостаточной проницаемости сосудов для комплексов. Для более точной оценки экспрессии гена p-Gal в органах мышей после введения комплекса плазмиды с липосомами гликолипид/ ФХ/ дихоленим мы измеряли активность этого фермента спектрофотометрически. Максимум ферментативной активности наблюдался в селезенке, и был почти равным в легких и печени. Большую роль в биораспределении может играть иммуногенность липоплексов [19], в частности, их опсонизация [20].
Таким образом, вещества холеним I-III и лакто-золипид IV, использованные нами для переноса радиоактивной и плазмидной ДНК в составе липосом,
ЛИТЕРАТУРА:
1. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная литература, 1997.
2. Gene therapy. In: Emery and Rimoin's Principles and Practice of Medical Genetics. Vol. 2. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins; 2006.
3. Северин Е.С., Жданов Р.И., редакторы. Специальные номера, посвященные проблемам генного переноса и генотерапии. Вопр. Биол. Мед. Фарм. Химии. 1999; 4.
изменяли их тропность по сравнению с обычными катионными липосомами и могут быть рекомендованы для создания систем направленной доставки генов в ткани и органы при системном введении. Эффект «первого прохода» [18], типичный для катионных липидов, отсутствовал при введении метки в комплексе с липосомами фосфатидилхолин/лакто-золипид IV, и был значительно снижен при введении комплекса ДНК с липосомами состава фосфатидил-холин/ лактозолипид IV/ дихоленим.
Выводы
1. Результаты по трансфекции in vitro с помощью веществ холеним показали, что чем больше холестериновых остатков содержит вещество, тем меньшее его количество необходимо для достижения оптимума трансфекции, что коррелирует с физикохимическими свойствами этих соединений.
2. Липоплексы на основе липосом ФХ/дихоленим распределялись в основном между легкими и печенью; введение в их состав лактозолипида приводило к максимуму накопления [14С]-ДНК в почках и печени и к экспрессии гена p-Gal в селезенке, печени и легких.
3. При введении в воротную вену печени с увеличением содержания холестериновых остатков и соотношения гидрофобность/гидрофильность в ряду от монохоленима к трихолениму уменьшается содержание [14С]-ДНК в селезенке и сердце, возрастает содержание в крови, печени и почках (в кишечнике и легких не меняется).
4. При трансфекции in vivo гена p-Gal в составе геносом на основе препарата дихоленим при введении в воротную вену печени количественно определена экспрессия гена p-Gal (не ниже 0,3 мкг/г ткани) в легких, печени и селезенке.
5. Изучены биораспределение [14С]-ДНК и трансфекция in vivo гена p-Gal в составе липоплекса на основе лактозолипида IV при введении в воротную вену печени. Гистохимически и спектрофотометрически обнаружена экспрессия этого гена. Максимум содержания метки наблюдается в почках и печени, а не в легких, что говорит о тропности лактозолипи-да к тканям этих органов.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов Минобрнауки РФ и КФУ № 12-26 и РФФИ 12-03-97089-рповолжье. Авторы благодарны академику А.И. Арчакову (НИИБМХ РАМН, Москва) и академику А.А. Кубатиеву (НИИОПП РАМН, Москва) за помощь и обсуждение, академику В.В. Власову (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск) за предоставление веществ холеним и профессору Ю.Л. Себякину (МИТХТ, Москва) за предоставление гликолипида.
4. Арчаков А.И., Жданов Р.И., редакторы. Специальный номер, посвященный актуальным вопросам генного переноса и генной терапии. Вопр. Мед. Химии. 2000.
5. Богданенко Е.В., Свиридов Ю.В., Московцев А.А. и др. Невирусный перенос генов in vivo в целях генной терапии. Вопр. Мед. Химии. 2000; 46(3): 226-45.
6. Zhdanov R.I., Bogdanenko E.V., Moskovtsev A.A. et. al. Liposome-mediated gene delivery: dependence on lipid structure, glycolipid mediated targeting, and immunological properties. Methods
in Enzymology (Academic): Liposomes, Part C: Gene transfer and therapy tN. Duzgunesh, ed.). 2003; 373: 433—65.
7. Прасолов В.С., Иванов Д.С. Ретровирусные векторы в генной терапии. Вопр. Мед. Химии. 2000; 46(3): 207—25.
8. Wilson J.M. Lessons learned from the gene therapy trial for ornithine transcarbamylase deficiency. Mol. Gen. Metab. 2009; 96(4): 151-7.
9. Салафутдинов И.И., Шафигуллина А.К., Ялвач М.Э. и др. Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибро-бластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2010; 5(2): 62-7.
10. Жданов Р.И., Агаджанян Н.А., редакторы. Избранные главы фундаментальной и восстановительной медицины, Казань: Изд-во Казанского федерального университета; 2012.
11. Богданенко Е.В., Ибрагимова М.Я. Невирусный перенос генов в экспериментальной генотерапии: учебное пособие. Казань: Изд-во Казанск. гос. ун-та; 2009.
12. Zhdanov R.I., Arslan A., Sahin F. Targeting gene delivery in gene cell and stem cell therapy. IUBMB Life 2009; 61(3): 310-11.
13. Жданов Р.И., Богданенко Е.В., Петров А.И. и др. Липоплек-сы на основе холестериновых производных олигоэтиленпропилени-минов в генном переносе in vitro и in vivo. Докл. Акад. Наук. 2005; 401(4): 550-55.
14. Богданенко Е.В., Жданов Р.И., Себякин Ю.Л. и др. Гликолипид с остатком лактозы — новый агент для адресной доставки ДНК в целях генной терапии. Докл. Акад. Наук. 2005; 401(5): 687—91.
15. Mozafari R., Zhdanov R.I. et al. Some protocols using
liposomes, dnapter 9, in: Mozafari R., Mortazavi S.M. editors. Nanoliposomes: From Fundamentals to Recent Developments;
2004.
16. Жданов Р.И., Богданенко Е.В., Ибрагимова М.Я. Методы невирусного переноса генов в целях генной терапии. Казань: Изд-во Казанск. гос. ун-та; 2009.
17. Sviridov Yu.V., Zhdanov R.I. Podobed O. V. et al. Lac -Z gene transfer into L929 cels and [14C] DNA distribution following intraperitoneal administration of new pH-sensitive lipoplex in mice. Cytobios 2001; 106(Suppl. 1): 7—14.
18. Lasic D. Liposomes in gene delivery. Boca Raton: CRC Press; 1997.
19. Kozlov L.V., Zhdanov R.I., Guzova V.A. et al. Action of nonviral gene delivery vectors on human complement system: low anticomplementary activity on lipoplexes based on LacZ plasmid and phospholipid/oligocation liposomes. Cytobios 2001; 106(Suppl. 1): 67—74.
20. Богданенко Е.В., Козлов Л.В., Жданов Р.И. Роль иммунной системы в биораспределении липоплексов in vivo. Mолекулярная медицина 2009; 7(1): 59—63.
Поступила 10.09.2012
