CC BY
14
УДК 619:616-097.3
Яненко У.М., к.вет.н., ст. науковий ствроб^ник © ulyanakuzyk@yandex.ru 1нститут еетеринарног медицины НААН Украгни, м. Киге
ДОСЛ1ДЖЕННЯ Р1ВНЯ АНТИЛ1ЗОЦИМНО1 АКТИВНОСТ1 (АЛА) ПАСТЕРЕЛ, ЩО БУЛИ 1ЗОЛЬОВАН1 В1Д Р1ЗНИХ ЕКОЛОГ1ЧНИХ Н1Ш
Дослгджено антил1зоцимну актиетсть пастерел що е одним гз маркер1е персистенцп мтрооргашзм1е. Зроблено пор1еняння щег характеристики етзоотичних ¡золят1е,еидыених е1д ргзних об'ектге дослгдження I музейних (люфтгзоеаних) культур. Встаноелено, що показник антил1зоцимног актиеност1 для одтег популяцИм1крооргашзм1е маер1зт показники I залежить е1д умое перебуеання збудника е наеколишньому середоеищ1.
Ключовi слова: л1зоцим, персистенттсть, пастерели.
Персистенттсть - це здатшсть патогенних та умовно-патогенних мiкроорганiзмiв до виживання в органiзмi господаря [1], е одшею з найважливших проблем у регулюванш переб^ шфекцшних процеав. Рiзновидностi перебування збудника хвороби в органiзмi хазяша безпосередньо пов'язаш iз властивiстю мiкроорганiзмiв до антилiзоцимноl активностi, яка сприяе 1х життедiяльностi. Вiд ще! властивостi залежить переб^ хвороби в гострiй, пiдгострiй, хрошчнш та латентнiй формах. Найбiльшу небезпеку представляють собою тварини, в органiзмi яких збудники хвороб циркулюють без прояву клiнiчних ознак за И життя (пастерелоносп)[2].
Р. тиИвЫёа сероварiв А та О е збудниками ентероколтв та пневмонiй сiльськогосподарських тварин, тому потребують всебiчного дослiдження 1х патогенних властивостей, а також пошуку методiв 1х виявлення i диференщацп. Однiею з суттевих ознак патогенност та здатностi до персистенцп патогенних та умовно-патогенних мiкроорганiзмiв у макроорганiзмi е продукування бактерiями субстанцiй, що шактивують фактори неспецифiчного протиiнфекцiйного захисту: лiзоциму, комплементу, iнтерферону, а також специфiчного захисту - iмуноглобулiнiв тощо [3]. Наявнiсть у бактерiй таких факторiв як лiзоцимна активнiсть забезпечуе 1м селективнi переваги росту i розмноження в живому органiзмi. Дослщження антилiзоцимноl активностi (АЛА) дозволяе визначити рiвень патогенностi пастерел по вщношенню до захисних сил органiзму. Антилiзоцимну активнiсть дослiджують з метою аналiзiв методiв лiкування i прогнозування переб^у патологiчного процесу, який обумовлений мжрооргашзмами, що викликають дане захворювання.
Пошук засобiв впливу на цю ознаку пастерел вiдкривае великi перспективи у профшактищ та терапп продуктивних тварин.
Мета дослщження. Виявлення антилiзоцимноl активной у епiзоотичних iзолятiв i музейних культур пастерел, що видшялись з рiзних екологiчних нiш (хворих сшьськогосподарських тварин, клiнiчно здорових тварин, кормiв
© Яненко У.М., 2011
тваринного походження, 6aKTepianbHO забрудненого грунту пасовищ та предмеив догляду за тваринами).
Матер1али та методи. У дослвд використали 42 етзоотичних культури пастерел, що були видшенш з пaтологiчного мaтерiaлу, отриманого з господарств центрального та схщного регюшв Укра!ни вiд птицi (курчата, кури, голуби); с/г тварин (телята, поросята, доро^ свиш); iз кормiв тваринного походження, продуктiв забою, та грунту.
Паралельно з епiзоотичними культурами було проведено визначення особливостей персистентно! активност музейних, референтних штaмiв пастерел, яю зберiгaються в лабораторп ВСЕ.
Бактерюлопчш дослiдження проводили згiдно з „Настановою з лабора-торно! дiaгностики пaстерельозiв тварин та птаив" [4] i включали в себе мжроскопш мaзкiв та мaзкiв-вiдбиткiв iз патолопчного мaтерiaлу, культурaльнi (пасажування видiлених культур на поживних середовищах (4-5 рaзiв)) та вивчення бiохiмiчних властивостей, трипанофлавшова проба, бiопроби та серотитзацп на бших мишах (за Картером).
Антилiзоцимну aктивнiсть мiкрооргaнiзмiв визначали чашечним методом вщстроченого aнтaгонiзму за О. В. Бухаршим зi спiвaвт. [5]. Дослвдш штами зaсiвaли на чашки Петрi з 1,5 % - ним МПА що мiстив лiзоцим бшку курячого яйця в рiзних концентращях вiд 1 мкг/см3 до 10 мкг/см3, на який точково, бaктерiaльною петлею, зaсiвaли 1млрд завис добово! агарово! дослщно! культури мiкрооргaнiзмiв. Контролем слугував МПА з додаванням стерильного фiзрозчину зaмiсть лiзоциму. Пiсля культивування в термостaтi за температури 37° С протягом 24 годин вирощеш культури пастерел iнaктивувaли парами хлороформу впродовж 40 хв. i другим шаром наносили на всю поверхню чашки 0,7 % МПА з вмютом 1млрд. завису добово! агарово! вдикаторно! культури Micrococcus luteus ГИСК 2665. Визначення рiвня АЛА проводили по наявноси або вiдсутностi росту тест-культури навколо дослiдно! колонiй.
Для прискорення методу визначення АЛА пастерел нами був розроблнгтй патент, в якому дефiцитний лiзоцим замшили люобактом (лiзоцимом хлориду) [6].
Результати дослщження. При вивченнi aнтилiзоцимно! активноси дослiдили 42 iзоляти пастерел, видшених з пaтологiчного мaтерiaлу тваринного походження, вщ птицi, кормiв, продуктiв харчування та об'eктiв довкiлля. 1з них типувались як P. multocida серовару А - 24 iзоляти, як сеовару В - 4 iзоляти, серовару D - 7 iзолятiв, ще три штами P. multocida були музейними. Зведеш дaнi по результатам визначення aнтилiзоцимноl aктивностi пастерел наведено у виглядi дiaгрaми (рис.) i вони свiдчaть, що явище aнтилiзоцимно! aктивностi притаманне всiм дослщженим культурам. Показники aнтилiзоцимно! aктивностi коливались в межах вiд 0 до 10 мкг/см3.
%
eo so 4o 30-
2o 10 o
0 - 3 мкг,/см3
4 - e мкг/см3
7- 10 мкг/см3
АЛА
■ P.multicida(A) □ P.multocida (D) □ P.multocida (B)
Рис. PiBeHb АЛА дослщжених культур пастерел
Сеpед пaстеpел низький покaзник aнтилiзоцимноï aктивностi вщ 0 до 3 мкг/смЗ виявили у 9 кyльтyp пaстеpел: 5 (20 %) кyльтyp P. multocida (А) i 4 (50 %) P. multocida (D), ^ичому y цьому piвнi не виявлено нi жоднох' P. multocida сеpовapy В. Покaзник aнтилiзоцимноï aктивностi, який ввaжaли зa сеpеднiй, вiд 4 до 6 мкг/смЗ, ( в сеpедньомy 4,5 мкг/смЗ) зaфiксyвaли у 12 кyльтyp:7 (28 %) кyльтyp P. multocida (А), 2 (40%) P. multocida (В) i 3 (38,6 %) P. multocida (D). Високий покaзник АЛА вщ ? мкг/смЗ до 10 мкг/смЗ ( в сеpедньомy ?,? мкг/смЗ) спостеpiгaли у 1? кyльтyp пaстеpел: 13 (52%) кyльтyp P. multocida (А), 3 (60%) P. multocida (В) i 1 (12,5 %) P. multocida (D). Сеpеднiй погазник зтачення aнтилiзоцимноï a^m^^i по дослiдженомy виду мiкpооpгaнiзмiв стaновив 6,02 мкг/смЗ.
Низький piвень АЛА пpитaмaнний пaстеpелaм якi пеpебyвaють тpивaлий чaс позa оpгaнiзмом твapини чи птищ, у коpмax твapинного поxодження, гpyнтi, тpивaле кyльтивyвaння мyзейниx штaмiв. Сеpеднiй piвень АЛА xapaктеpний для пaстеpел, що iзолювaлись вiд твapин з xpонiчним пеpебiгом зaxвоpювaння i вщ клiнiчно здоpовиx твapин. Високий piвень АЛА влaстивий мiкpооpгaнiзмaм, що iзолювaлись пpи гостpомy i пiдгостpомy пеpебyгy зaxвоpювaння.
Резyльтaти дослiджень вкaзyють нa зaлежнiсть бiологiчниx влaстивостей збуднига вiд мiсця його видiлення [?] .
Пpедстaвленi дослiдження покaзaли, що вс дослiджyвaнi кyльтypи мiкpооpгaнiзмiв володши aнтилiзоцимною aктивнiстю. Кiлькiснa оцiнкa aнтилiзоцимноï aктивностi покaзaлa, що мiкpооpгaнiзми видшеш вiд твapин iз вaжким пеpебiгом зaxвоpювaння, xapaктеpизyються бiльш виpaженою влaстивiстю iнaктивyвaти лiзоцим, що виpaжaлося вищою концентpaцieю iнaктивовaного лiзоцимy, внесеного до сеpедовищa кyльтивyвaння. Тaк, сеpеднiй piвень aнтилiзоцимноï влaстивостi у штaмiв пaстеpел, видiлениx вiд поpосят у якиx клiнiчний пpояв зaxвоpювaння вiдсyтнiй, був мiнiмaльним i стaновив 4,5 ± 0,6 мкг/см3. Бiльш високим вш був у кyльтyp, iзольовaниx вщ xвоpиx iз xpонiчним ступенем пеpебiгy зaxвоpювaння - 5,5 ± 5,0 ± 0, ? мкг/см3. У кyльтyp, якi були видiленi вщ гpyпи поpосят i телят з пiдгостpим пеpебiгом
захворювання, piBeHb експресп цього фактору персистенци був досить високим i становив 8,14 ± 0 ,3 мкг/см3.
Висновок. Отримаш данi пiдтверджують участь факторiв персистенци пастерел у mTOreHe3i пневмонiй та ентероколтв поросят i телят, демонструють зв'язок бiологiчних властивостей збудника з характером переб^у iнфекцiйного процесу. Нижча вираженiсть дано! ознаки у мiкроорганiзмiв при легкому перебiгу захворювання вщображае дисбаланс у системi паразит-господар i свiдчить про незавершенiсть селекцп штамiв бактерiй, здатних iнактивувати лiзоцим.
Висвiтлений матерiал дае широкi перспективи використання АЛА, як одного з маркерiв персистенци в еколого-епщемюлопчно!, саштарно-ппешчно! i клшчно! практицi, де необхщна всебiчна оцiнка бiологiчних валастивостей взолюемих культур пастерел.
Л1тература
1. Биомолекулярные основы патогенности бактерий / Ю.В. Езепчук - М. : Наука, 1974. - С. 4-5.
2. Яненко У.М. Виявлення свиней-пастерелоноспв за допомогою РНГА / У. М. Яненко // Науковий вюник Нащонального аграрного ун-ту. - 2000. - Вип. 28.
- С. 228-230.
3. Сидорчук Л. I. Антилiзоцимна актившсть провiдних збудникiв хронiчного уретриту / Л. I. Сидорчук// Буковинський медичний вюник. - Чершвщ, 2009. -Т. 13. - № 2 . - С. 45-48.
4. Настанова з лабораторно! дiагностики пастерельозiв тварин та птах1в / М. С. Павленко, В. М. Манченко, А. Ф. Ображей, А. I. Завiрюха. - М., 1995. - 9 с.
5. Бухарин О. В., Васильев Н. В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине.
- Томск, 1974. - 209 с.
6. Споаб визначення антилiзоцимноl активност бактерш P. multocida iз використанням люобакту (лiзоциму хлориду). Патент на корисну модель № 40629. Укра!на. МПК(2009) d2N 1/00 У.М.Яненко. Заявл.18.07.2008; 0публ.27.04.2009, Бюл.№ 8.- 4с.
7. Фильчаков И. В. Персистенция бактерий: механизмы и иммунная реактивность организма/ И. В. Фильчаков, А. М. Зарицкий// Сучасш шфекцн. -2003. - № 3. - С. 71 - 82.
Summary
Yanenko U.M. PhD, leading scientist IVM NAAS of Ukraine
THE INVESTIGATION OF ANTILYSOCIM ACTION LEVEL OF PASTEURELLA, ISOLATED FROM DIFFERENT ECOLOGICAL AREAS /
It was conducted the investigation of antilysocimal action (ALA) of pasteurella isolates. Thia feature counted as one of the microorganism 's persistention marker. It was curried out the comparative characterization of ALA from different isolates from biomaterials and museum (lyophylisated) strains. It was stated what index of antilysocimal activity for the same population of the microorganisms had different level and it depended from environmental conditions impact on causative agent.
Key words: lysocim, pathogenesity, escherichia, pasteurella, salmonella
Стаття надшшла доредакцИ 6.04.2011
