CC BY
12
УДК 636.09:616.99:636.4
Стибель В.В., д. вет. н., професор Данко М.М., астрант © Лье1еський нацюнальний утеерситет еетеринарног медицины та б1отехнологт
iмет С.З. Гжицького
ДОСЛ1ДЖЕННЯ МУТАГЕННОГО ТА ГЕНОТОКСИЧНОГО ПОТЕНЦ1АЛУ ISOSPORA SUIS В ОРГАН1ЗМ1 ПОРОСЯТ
Проведено до^дження з еиечення мутагенного та генотоксичного еплиеу Isospora suis за розеитку патологiчного процесу е органiзмi поросят. За допомогою мжроядерного тесту естаноелено, що у поросят, експериментально теазоеаних ооцистами I. suis у дозi 50 000, зростала ктьюсть еритроцитiе з мжроядрами на 7-му та 14-ту добу теазп. За еизначення мутагенног актиеностi гомогенату 50 000 теазтних ооцист I. suis у тестi Еймса естаноелено, що натиена концентращя тдукуеала рееерст на обох штамах Salmonella thyphimurium: ТА-98 у 2,7 i ТА-100 у 2,3 рази еищу, шж у конmролi. За розеедення гомогенату теазтних ооцист у 10 i 100 разiе тдукцт генних мутацт не еияелено. Отриман дан сеiдчаmь про те, що гомогенат теазтних ооцист I. suis мктить бiологiчно актиен речоеини, ям еолодтть мутагенною актиетстю слабког сили (за шкалою муmагенносmi 1 бал) i потенцтно здатн тдукуеати зеоротн генн мутацп до гктидин незалежносmi е штамах S. typhimurium ТА-98 i ТА-100 за типом змщення рамки зчитуеання та типом замти пар осное.
Ключоei слова: Isospora suis, мутагеншсть, мжроядерний тест, тест Еймса, поросята.
Вступ. Одним з найбшьш важливих генетичних аспекпв взаемовщношень у системi паразит-хазяш необхщно вважати мутаненний вплив паразита на спадковий апарат соматичних та генеративних кл^ин хазяша.
Вщомо, що найпростiшi також володшть мутагенним впливом на спадковий апарат кл^ин хазяша. G.K. Manna et al. встановили, що внутршньочеревне введення мишам-альбшосам лши Swiss культурального середовища Entamoeba histolytica стимулююе тдвищення хромосомних аберацш, кшькосп еритроцитсв з мжроядрами у юстковому мозку [1].
За даними З.Н. Соболь i А.В. Степанова, у мишей, швазованих Lamblia muris, вiдмiчають збшьшення юлькост еритроциив з мжроядрами пол> та нормохроматофшьних еритроциив, а також аберантних, ппоплощних, гшерплощних кл^ин лiмфоïдного ряду в юстковому мозку [2, 3, 4]. Паразитування Leishmania donovani у мишей викликае змши числа хромосом, еритроциив з мжроядрами, еритроциив в юстковому мозку i призводить до збшьшення сперматозовдв зi змшою форми головки [5].
© Стибель В.В., Данко М.М., 2011
Мутагенний потенщал BÍpycÍB, бактерш та найпростДших е беззаперечним, внаслщок близького контакту з ядерним апаратом клiтин ссавцiв i здатшстю безпосередньо впливати на нього продуктами свое! життедiяльностi.
Цитогенетичнi методи найчутливiшi щодо встановлення мутагенного впливу чинникДв довкiлля та дозволяють рееструвати змДни на хромосомному i геномному рiвнях оргашзацп спадково! шформаци [6]. Одним iз цитогенетичних методiв експрес-оцiнки генетично! небезпеки ксенобiотикiв in vivo у ссавцДв е мiкроядерний тест [7]. Останшм часом цей метод отримав широке застосування у гуманнiй та ветеринарнш медицинi для визначення мутагенно! ди чинникiв довкiлля [8, 9] i рекомендований Мiжнародним Агентством щодо захисту навколишнього середовища як високочутливий спосiб виявлення мутагенiв i канцерогешв [10].
МДкроядро - це фрагмент ядра в еукарютичнш клiтинi, яке позбавлене повного геному, необидного для i! виживання. Воно е патолопчною структурою i може спостерiгатися в кттинах будь-яких тканин. Зазвичай мДкроядра утворюються в результат неправильного ходу клДтинного подiлу або фрагментаци ядра в процесД апоптозу.
МДкроядерний тест у соматичних клiтинах як скриншг-тест був запропонований у 70-х роках 20-го столДття [11-14] для вивчення ди кластогенних i анеугенних чинниюв середовища на клДтини кДсткового мозку i периферично! кровД. ВДн е вщносно новим, але вже загальноприйнятим цитогенетичним методом оцДнки мутагенно! ди агентДв рДзно! природи. За допомогою цього методу проведено тестування на мутагенну актившсть велико! кшькосп хДмДчних, фДзичних i бюлопчних агентДв, тест застосовуеться вже на першому етапД перевДрки потенцшних мутагешв i канцерогешв [15].
Тест Еймса - генетичний тест з використанням бактерш Salmonella typhimurium в якостД тест об'екту i призначений для оцДнки мутагенного потенщалу хДмДчних сполук. Суть методу полягае в реестрацп здатностД речовини, що дослДджуеться, або И метаболтв, Дндукувати реверс-мутаци вДд ауксотрофностД до прототрофностД за гДстидином у тестерних штамДв S. typhimurium, якД несуть his-мутаци i не здатш синтезувати гДстидин. Методика була описана в рядД робДт на початку 1970-х рокДв Брюсом Еймсом i його групою в КалДфорншському УшверситетД [16, 17].
1зоспороз е найбшьш розповсюдженим протозойним захворюванням поросят-сисушв i завдае значних економДчних збиткДв [18].
Метою наших дослДджень було вивчення показникДв мДкроядерного тесту в еритроцитах периферично! кровД поросят-сисушв за розвитку експериментального Дзоспорозу та визначення потенцшно! мутагенностД гомогенату швазшних ооцист Isospora suis у тест Еймса.
Матер1ал i методи. Для проведення експериментальних дослДджень було вщДбрано по 8 поросят триденного вДку з двох приплодДв, з яких було сформовано, вщповщно до загальних правил за принципом аналогДв, дослДдну та контрольну групу. Поросят дослДдно! групи заражали суспензДею швазшних ооцист I. suis у
кшькост 50 000 на тварину. Накопичення, споруляцш та визначення швазшно! дози проводили за методикою Long et al. (1976) з деякими модифжащями [19].
Кров для дослщжень з виявлення мжроядер в еритроцитах вщбирали з вушно! вени поросят до та на 7-му, 14-ту, 21-шу та 28-му добу тсля зараження. Виявлення мутагенно! ди iнвазiйних ооцист I. suis за мжроядерним тестом проводили за методикою W. Schmid [14].
За визначення мутагенно! активност гомогенату 50 000 швазшних ооцист I. suis у тест Еймса [20] дослщження проводили у трьох концентращях -нативнш, кратно зменшенш у 10 i 100 разiв на штамах Salmonella typhimurium: TA-98, який рееструе мутацiï за типом змщення рамки зчитування i ТА-100, який рееструе мутацiï за типом замши пар основ. Наявшсть мутагеноï ди враховували за iндукцiею обернених мутацш вiд ауксотрофностi за гiстидином до прототрофност. Для контролю у дослщах з метаболiчною активацiею для штаму ТА-98 застосовували амiнофлуорен, який вводили у концентрацп 10 мкг/чашку та для штаму ТА-100 циклофосфан, який вносився у кшькост 100 мкг/чашку. 1нкубацш проводили впродовж 48 годин.
Результати дослщження. Проведеним дослщженням з вивчення можливого мутагенного та генотоксичного ефекту I. suis за розвитку патологiчного процесу в органiзмi поросят встановлено, що у поросят, експериментально iнвазованих ооцистами I. suis у дозi 50 000, зростала кiлькiсть еритроцитiв з мжроядрами (табл. 1). В еритроцитах периферичноï кровi мiкроядра виявляли з рiзною частотою у неоднаковi доби дослщу. Статистично вiрогiдне зростання кiлькостi еритроцитв спостерiгали на 7-му та 14-ту добу експерименту. Максимальну кiлькiсть еритроцитв з мiкроядрами було зафiксовано на 7-му добу дослщження - 7,4±1,04, що у 5,3 рази перевищувало показник контрольноï групи (Р<0,001). На 14-ту добу експерименту кшьюсть еритроцитв з мiкроядрами (5,7±1,12) була у 3,4 рази вищою, нiж у тварин контрольно!' групи (Р<0,01). На 21-шу та 28-му добу швазп кшьюсть еритроцитв з мжроядрами перевищувала показники контрольноï групи поросят, вщповщно, у 2,2 та 1,75 рази.
Таблиця 1.
Кшьккть еритроцитв i3 мпкроядрами (ЕМЯ) у периферичнш кров1
поросят, iнвазованих ооцистами I. suis, %0 (M±m, n=8)
Групи тварин ЕМЯ/1000 еритроцитв
До швази Шсля швазування
7 доба 14 доба 21 доба 28 доба
Контрольна 0,8±0,07 1,4±0,16 1,7±0,26 1,9±0,38 1,2±0,44
Дослщна 0,6±0,03 7,4±1,04*** 5,7±1,12** 4,2±0,96 2,1±0,54
Примггки: ** - Р<0,01; *** - Р<0,001
За визначення мутагенноï активност гомогенату 50 000 iнвазiйних ооцист I. suis у тест Еймса (табл. 2) дослщження проводили у трьох концентращях -нативнш, кратно зменшенш у 10 i 100 разiв. Встановлено, що нативна концентращя шдукувала реверсш на обох штамах Salmonella thyphimurium: ТА-98
w Л
S ^
(Я ë
H p
ä я о
Я
s
я
£ тз
о о
я о
(Я
я о\
ев »
w S
ю
я о
H си Я
с Sc я о
(Я
о
и о Й
В'
H
er
w Й тл g н
II' s I
g Cd
3 P»
H S >
M
oo о о
h d > S.
° 3
w a p в.
H
я я о
ю
"I о 2 о
ti си Я
5
я'
(Я
о H
О s ^ о
^ H
Яс Я
S я S Я
о о с я
о н
S g
р с. Ol и
о s
2 р с. 5
w 2 2
В Й ^ н
(В о р
Я TI (В
s о Я Я
'тЗ н о о н.
« Я
Я я
о н Я
£
о\
о'
и
о
ч
2'
я
о
Р> H Я (Л
я
я л я
о g
•5 о
ti
В я о
W
ъ о о н
р «
5'
er
S.
о'
н er
CD >73 Я
■а
о ß я
H
<<
я о
>73
о о sa н
си «
о Я си >73 Я 2 си Я H
тЗ О
sa р
сг Я о
я'
(Я
8 о
(Л
ё я
X о о с я
о
н
Р
ся g.
сл ^
О
й.
ОЛ
О
О
о о
Cd s
о В о
03
я s
Гомогенат ¡нва ^йних ооцист I. suis Зразок
ТА-100 ТА-98 Тест-штам
азид Na дауномщин 1 103ИТИВНИЙ KOHTpOJ
о о о - о Я о ■а я fi H й ш ■а я н g щ » 3 ^ и м' го я tr 1,5 мкг/чашку о о о - о Я О ■а я го H w M ГО s ■Ö a S я щ » H та Cd м' го я tr 6 мкг/чашку Розведення
ON К» 00 ЧО ON ON К» U) ON ON и> ON U) о Кшыасть колошй ревертанпв
00 К> К» (Л (Л 4^ U) К» К» (Л K> 4^ U) 00 NJ
ON 00 (Л U) к» ON и> ON О (Л к» 00 (Л ON К> ЧО K>
U) 1—' "ь- О Н- 82,7± 3,3 123,3± 5,6 54,7± 3,7 т'от T0'¿8S 32,0± 2,7 40,7± 3,4 58,7± 4,7 22,0± 2,1 270,6± 12,2 XI 1
Ч*) Ч*) о Чл Ъо к» 4*)
о о - к» о о - УГутагеншсть (бали
s
Vi H SS 1 л В
В
»
»
я н в оэ
3.
о'
н сг"
1 о 2
0
1 л
в в'
03 »
ш Вс В В И о о в в
о H
с.
се*
H >
I
о о
W р
H
я я о
(В
я я
Sa >73
1 «
Я w Л
Я ^
(Я
ё я
Sa
н р
н Я
я
0
2 w
1
Я Я
я
£ тЗ
о о Я о
(Л
s
s -5
м
0 U Р
01 «
о
о Я
и я
w Р
^ ьн
В Ё -Е. «
о
о н я
H
" С
о я о 2
W со
з. ё
л ~
§ й р
я
?! H Я (Я
я
2 s à
Ol
Е я н §
со H
g 2
р н
Я В.
У1 Я ^ О
a-tí ei й
3 3 § В-
£ н-
3 В
1 а
Яс Я Я X о о с я
о H
ю
H >
■
о
о
^
ю
'тЗ
(В
ñ я 2
2 о я
Я H Я (в
» в
3. о
(Л
о
и о Й
В'
H er
О р о w
тз s
S 2
I
%
« S. G. X 5
TI (В
Я Я Я
g о
§
я н
н
I
Яс
00 р
ЧО
р
oo q Я
H ^
(В
Я
я о
5 р
«
н я w я.
о сл H с S м"
я
ев о
Яс Я Я
X
о о с я
о H
w
w w
S й
й (В
Я Я Sa
TI
о 2
0
TI (В
Я
s
!
Сй
s »
CS Ä s
РЧ §
s i
то ä
O
51
s -s о* РЧ
о
Po О
Р3
Oí
rs
S s ä a
Inj
Л1тература
1. Manna G.K., Sadhukhan A., Data S. Mutagenic potential of the human intestinal amoaeba Entamoeba histolytica assayed in mice as model // Cytology.- 1991.-Vol. 56.- № 4.- P. 313-616.
2. Соболь З.Н. Анализ результатов микроядерного теста у аутбредных мышей, спонтанно инвазированных Lamblia muris / Соболь З.Н., Степанов АВ.; Весшк Вщебскага дзярж уш-та. - 1998. - Т. 10.- № 4. - С. 58-61.
3. Степанов А.В. Мутагенное влияние лямблий и их метаболитов // Мед. Новости.- 1999.- № 3.- С. 61-62.
4. Степанов А.В. Мутагенное влияние лямблий на соматические клетки хозяина // Вестник БГУ. - 2000. - Сер. 2.- № 3. - С. 54-56.
5. Manna G.K., Sarkar A.K. Mutagenic potential of human kala-azar hemoflagellate in mouse // Curr. Sci. (India). - 1989. - Vol. 58.- № 22. - P. 1268-1271.
6. Бочков Н. П., Чеботарев А. Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. / АМН СССР. - М: Медицина, 1989. - 272 с.
7. Кужир Т.Д. Антимутагены и химический мутагенез в системах высших эукариот / Под. ред. Р.И. Гончаровой. - Мн.: Тэхналопя, 1999. - 267 с.
8. Fenech M., Holland N., Chang W.P. et al. The Human MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans // Mutat. Res. Fund, and Mol. Mech. of Mutagen. - 1999. - Vol. 428. - P.271-283.
9. Kirsch-Volders M., Sofimi Т., Aardema M., Albertini S., Eastmond D. Report from the in vitro micronucleus Assay Working Group // Mutat. Res. Envir. and Mol. Mutagen. - 2000. - Vol. 35. - P. 167-172.
10. Cimino M.C. New micronucleus guideline for the U.S. environmental protection agency. U.S. EA, office of Toxic Substances, Health and Environmental Review Division, Washington DC // Mutat. Res. Envir. and Mol. Mutagen. - 1991. -Vol. 17.- Suppl. 19.- P. 83.
11. Boller K., Schmid W. Chemishe Mutagenese beim Sauger. Das Knochermark des Chineschen Hamsters als in vivo-Test system. Haematologische Befunde nach Behandlung mit Trenimon // Humangenetik.- 1970.- Vol. 11.- P. 35-54.
12. Heddle J. A rapid in vivo test for chromosomal damage // Mutat. Res-1973.- Vol. 18.- № 2.- P. 187-190.
13. Schmid W. The micronucleus test // Mutat. Res.-1975.-Vol. 31- № 1.- P. 916.
14. Schmid W. The micronucleus test for cytogenetic analysis // Chemical Mutagens; Principle and Methodes for theur detection. Edited by: A. Hollaende (Plenum, New York).- 1976.- Vol. IV.- Ch. 36.- P. 31-53.
15. Ильинских Н. Н., Ильинских И. Н., Новицкий В. В., Ванчугова Н. Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность.- Томск: Изд. Томского ун-та, 1992.- 272 с.
16. Pounikar R., Dawande A.Y. Detection of potential carcinogens by Ames test // Asiatic J. Biotech. Res.- 2010.- Vol. 1.- P. 57-64.
17. Mortelmans K., Zeiger E. The Ames Salmonella/mi crosome mutagenicity
assay // Mutat. Res.- 2000.- Vol. 455.- P. 29-60.
18. Karamon J., Ziomko I., Cencek T. Inwazja Isospora suis u prosjat // Med. Wet.- 2007.- T. 63.- Nu. 12.- S. 1546-1550.
19. Long PL., Joyner P.L., Millard B.J., Norton C.C. A guide to laboratory techniques in the study and diagnosis of avian coccidiosis // Fol. Vet. Lat.- 1976.- Vol. 6.- Р. 201-207.
20. Tejs S. The Ames test: a methodological short review // Envir. Biotech.-2008.- Vol. 4 (1).- P. 7-14.
Summary
A study of the mutagenic and genotoxic effects of Isospora suis during the development of a pathological process in piglet. Micronucleus test shows that in pigs experimentally infected by 50 000 invasive oocyst of I. suis, increased the number of erythrocytes with micronucleus on the 7th and 14th day of invasion. In determining the mutagenic activity of homogenate of 50 000 invasive oocyst I. suis in the Ames test revealed that the concentration of native induced reversal of both strains Salmonella thyphimurium: TA-98 in 2,7 and TA-100 is 2,3 times higher than in controls. By breeding homogenate invasive oocyst in 10 and 100 times the induction of gene mutations have been identified. These data suggest that the infective homogenate of I. suis oocyst contains biologically active substances that possess mutagenic activity weak force (on a scale mutagenicity 1 point) and potentially able to induce reverse mutations to histidine independence in strains S. typhimurium TA-98 and TA-100 for type of shift reading frames and type of replacement pairs.
Key words: Isospora suis, mutagenicity, micronucleus test, Ames test, piglets.
Рецензент - д.вет.н., проф. Урбанович П.П.
