CC BY
65
УДК 579.083.13
А. Б. Маргулис, С. А. Рыжкин, А. Н. Слесарева, Н. В. Белоногова, В. Я. Пономарев, О. Н. Ильинская
ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ОБЛУЧЕНИЯ
НА РЕНТГЕНО-КОМПЬЮТЕРНЫХ ТОМОГРАФАХ
Ключевые слова: токсичность, мутагенность, генотоксичность, ферменты, рентгено-компьютерные томографы.
Исследованы биологические эффекты облучения на рентгено-компьютерных томографах. Показано снижение количества колониеобразующих единиц для штамма Salmonella typhimurium ТА 100 в облученных вариантах по сравнению с контрольным. Мутагенные эффекты для исследуемых режимов облучения не выявлены.
Keywords: toxicity, mutagenicity, genotoxicity, enzymes, X-ray computer tomographs.
Investigated the biological effects of radiation on X-ray computed tomography. Shown to reduce the number of colony-forming units for Salmonella typhimurium strain TA 100 in the irradiated variants compared to the control. Mutagenic effects of exposure to the test modes haven't been identified.
Введение
Среди вопросов, представляющих научный интерес, не многие приковывают к себе столь постоянное внимание общественности и вызывают так много споров, как вопрос о действии радиации на человека. К сожалению, достоверная научная информация по этому вопросу очень часто не доходит до пациентов, поэтому им приходится пользоваться всевозможными слухами. Радиация действительно смертельно опасна. При больших дозах она вызывает серьезнейшие поражения тканей, а при малых - может вызывать рак и индуцировать генетические дефекты, которые, возможно, проявятся у детей и внуков человека, подвергшегося облучению, или у его более отдаленных потомков [1].
Для основной массы населения самые опасные источники радиации - вовсе не те, о которых больше всего говорят. Наибольшую дозу человек получает от естественных источников радиации. Радиация, связанная с развитием атомной энергетики, составляет лишь малую долю радиации, порождаемой деятельностью человека; значительно большие дозы мы получаем от других, вызывающих гораздо меньше нареканий форм этой деятельности, например - от применения рентгеновских лучей в медицине [1].
В настоящее время в клинической практике используются различные типы томографов, разные направления, углы размазывания и проекции томографии. Созданные для компьютерной томографии аппараты, от достаточно простого и дешевого до весьма дорогих и работающих в реальном масштабе времени, позволяют применить метод как в поликлинических условиях при проведении диспансеризации, так и в специализированных стационарах. Вместе с тем, возможности продольной томографии в практическом здравоохранении реализуются недостаточно.
Целью настоящей работы было выяснение оценки генотоксических эффектов облучения на рентгено-компьютерных томографах.
Материалы и методы исследования
Протокол облучения биологического материала представлен в таблице 1.
Таблица 1 - Исследуемые дозы облучения
11'j4tfl Ипнше > П4 mum. ml нмг чш-mi-M 1 hmmuitcib <tojn AT. мГр ÜLP,
«4.4TW ('.«Л I.-A fr, с г (ижн .1, M« К. -П
/ ilandwl £Ф ПО ЗОО Ii dir OJ rtJ 55,7 WJ
2 АЫ1'т» eii native БФ 120 зоо 0,5 hetk- 0,5 ftj 4,4 62.6
3 Litm/hir spine БФ 135 301) 1,0 hetu 0,5 64 45 t5№
Оценка токсичности биологических, химических соединений и различных физических воздействий по отношению к тестерным микроорганизмам - обязательный этап, необходимый для подбора диапазона оптимальных концентраций и доз, при тестировании их на генотоксичность и мутагенность.
Экспериментальная часть
1. За 12-15 ч. до проведения эксперимента делают пересев культуры тестерного штамма Salmonella typhimurium TA 100 с косяка в 5 мл ЬВ-бульона для получения "ночной" культуры.
2. 2% ЬВ-агар разливают в чашки Петри.
3. Делают разведения "ночной" культуры в водопроводной воде.
4. Растопленный 0.6% ЬВ-агар разливают стерильно по 3 мл в пробирки и ставят в водяную баню при 45°С.
5. В пробирки с 3 мл полужидкого 0.6% ЬВ-агара вносят 0.1 мл бактериальной суспензии нужного разведения и 0.1 мл раствора вещества в исследуемой концентрации (в нашем случае опытным вариантом служили облученные образцы). Раствор перемешивают и наслаивают на нижний 2% ЬВ-агар в чашки Петри. В контроле вместо раствора вещества добавляют 0.1 мл растворителя (в случае облучения опытных образцов добавления растворителя в контроль не требовалось). После 24ч. инкубации при 37°С подсчитывают число колоний, выросших на чашках Петри в опытном и контрольном вариантах. Для оценки степени токсичности исследуемого вещества (в нашем случае - доз облучения) используют критерий "выживаемость" тестерного штамма при действии определенной дозы вещества.
число колоний в опыте Выживаемость =.....................................х 100%
число колоний в контроле
Среды
ЬВ-бульон: триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 5 г, дистиллированная вода -1000 мл. 2% LB-агар: LB-бульон - 1000 мл, агар - 20 г. 0,6% LB-агар: LB-бульон - 1000 мл, агар - 6 г.
В нашем случае разведение культуры делали до 10-5. Полученные результаты представлены на рисунке (число КОЕ/ч.Петри).
Все сконструированные Эймсом с соавторами [2] тестерные штаммы исходно получены из штамма Salmonella typhimurium дикого типа LT2. Для повышения чувствительности этих штаммов к химическим мутагенам и канцерогенам в геном бактерий введены некоторые добавочные маркеры.
Оценку мутагенности проводили в тесте Эймса на мутантном штамме S. typhimurium TA 100 - his G46, rfa, uvr-, pkm 101, bio-. Мутация в гисти-диновом опероне (his-) вызывает ауксотрофность по этой аминокислоте у мутантов. Штамм ТА 100 регистрирует мутации типа замены пар оснований (his G46). Мутация в гене uvr B приводит к нарушению процесса эксцизионной репарации, благодаря чему возникшее повреждение ДНК остается неисправленным и, таким образом, увеличивается чувствительность тестерного штамма к некоторым мутагенам. Делеция в гене uvr B проходит также и через ген bio. При rfa-мутации ("шероховатые колонии") нарушается синтез липополисахаридов, в результате чего клетка теряет патогенность, а также возрастает проницаемость ее клеточной стенки и облегчается проникновение мутагенов в клетку. Штамм ТА 100 несет также плазмиду устойчивости к ампициллину pKm 101 и ген umu C, что увеличивает вклад ошибочной репарации в процесс мутагенеза, и, следовательно, чувствительность штамма [2,3]. В тесте на токсичность также использовали мутантный штамм S. typhimurium ТА 100.
Сущность теста заключается в том, что тес-терные штаммы бактерий Salmonella typhimurium культивируют на специальной среде, на которой могут расти лишь мутанты этих штаммов, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистиди-ну к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования ввести химический мутаген, или воздействовать физическим мутагеном (например, радиационное облучение), то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний.
Если число колоний-ревертантов в опыте и контроле достоверно различается менее, чем в 2.5 раза, то делается заключение об отсутствии мутагенной активности. Если фиксируют превышение от 2.5 до 10 раз, то делается заключение о наличии слабой мутагенной активности. Превышение от 10 до 100 раз говорит о средней мутагенной активности исследуемого соединения. Если фиксируют превышение более, чем в 100 раз, - вещество обладает сильной мутагенной активностью [4,5].
Проверке на мутагенность всегда предшествовала проверка токсичности облучения по отношению к тестерным штаммам для исключения воз-
можности получения ложноотрицательных результатов в испытаниях на мутагенность.
Условия культивирования Staphylococcus aureus: выращивание суточной культуры (24 часа) проводили на L-бульоне при 37°С.
Для определения гемолитической активности использовали кровяной агар с добавлением 5% суспензии эритроцитов барана. О величине общей гемолитической активности судили по размеру зон лизиса вокруг колоний S. aureus на кровяном агаре.
Для определения протеолитической активности использовали молочный агар: мясопептон-ный агар с добавлением 10 % пастеризованного молока. О величине протеолитической активности судили по размеру зон лизиса вокруг колоний S. aureus на молочном агаре.
Для определения лецитиназной активности использовали желточно-солевой агар (ЖСА): мясо-пептонный агар с добавлением 10% NaCl и 10% суспендированного желтка (желток одного яйца суспендируют в 200 мл 0,8% NaCl). О величине ле-цитиназной активности судили по зонам помутнения среды вокруг колоний S. aureus на ЖСА.
Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов в компьютерной программе "Microsoft-Excel".
Оценка токсических и генотоксических эффектов исследуемых доз облучения
Токсический эффект определяли по выживанию тестерного штамма в опытных вариантах по сравнению с контрольным [4,5]. Ранее аналогичные исследования нами были проведены в отношении химических соединений фуранонового ряда [6]. Тестер-ным штаммом в опыте служила Salmonella typhimurium TA 100.
В ходе работы было зарегистрировано снижение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) приблизительно в 5 раз для облученных вариантов (рис. 1).
ли
Контроль 12 3
Образцы
Рис. 1 - Число КОЕ S. 1урЫтигшт на ч.Петри в облученных вариантах по сравнению с контролем
Далее мы определяли мутагенные эффекты исследуемых доз облучения. Результаты представлены на рисунке 2.
Мутагенных эффектов не наблюдали, однако это может быть связано с высокими токсическими эффектами выбранных режимов облучения. Воз-
можно, при работе с меньшими дозами мутагенные эффекты могли быть зарегистрированы.
Рис. 2 - Число колоний-ревертантов в тесте Эймса в облученных вариантах по сравнению с контролем
Оценка выживаемости и физиолого-биохимических параметров золотистого стафилококка при действии облучения
Для определения ферментативной активности провели высев на кровяной агар для определения гемолитической активности, на молочный агар для определения протеолической активности, на желточно-солевой агар (ЖСА) для определения лецитиназной активности. Ни в одном из вариантов изменения ферментативных активностей по сравнению с контролем не наблюдали.
В то же время наблюдали снижение числа КОЕ в образцах, подвергшихся обработке, в 1.5-2.5 раз по сравнению с контролем (рис. 3).
□ Кровяной агар
□ ЖСА
I ■ Пш п
Таким образом, нами показано, что микроорганизмы реагируют на облучение рентгено-компьютерных томографов в режимах, применяемых для работы в медицинских учреждениях, в связи с чем необходимы исследования подобных воздействий на собственную микрофлору человека.
Публикация подготовлена в рамках поддержанного РГНФ и Правительством Республики Татарстан научного проекта №14-16-16002.
Литература
1. Маньковская, О.Л. Компьютерная томография - больше пользы или вреда? [Текст] / О. Л. Маньковская // АВС-Д1АГНОСТИКИ, - 2010. - Т. 69. - C.74.
2. Ames, B. N. An improved bacterial test system for defection and classification of mutagens and carcinogens [Text] / B. N. Ames, F. D. Lee, W. E. Durston // Procl. Nac. Akad. Sci.- USA.- 1973.- V.70, N3.- P. 782.
3. Maron, D.M. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test [Text] / D.M. Maron, B.N. Ames // Mutat. Res.- N113.- 1983.- P.174-210.
4. Фонштейн, Л. М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем [Текст] / Л. М. Фонштейн, С. К. Абилев, Е. В. Бобринев; Методические указания.-Москва, 1985.- 34с.
5. Маргулис, А.Б. Методы генетической токсикологии /
A.Б. Маргулис, Н.С. Карамова, О.Н. Ильинская // Учебно-методическое пособие.- Казань: КФУ, 2012.- 36 с.
6. Митько, В.Е. Токсические и генотоксические эффекты новых синтезированных фуранонов и их галогенирован-ных производных [Текст] / В.Е. Митько, А.Б. Маргулис,
B.Я. Пономарев, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская // Вестник Казанского технологического университета.-2013.- Т.16, №11.- С.211-213.
Варианты
80
60
40
20 -
0
К
3
Рис. 3 - Изменение количества КОЕ 8.иигвин на ч. Петри после облучения по сравнению с контролем
© А. Б. Маргулис - к.б.н., доцент каф. микробиологии К(П)ФУ, anna.margulis@kpfu.ru; С. А. Рыжкин - к.м.н., доц. каф. общей гигиены с курсом радиационной гигиены Казанский ГМУ Минздрава России, rsa777@inbox.ru; А. Н. Слесарева - вед. специалист лаб. радиационного контроля ООО "РЕНИР", anngls.mt@gmail.com; Н. В. Белоногова - асп. каф. микробиологии К(П)ФУ; В. Я. Пономарев - к.т.н., доцент каф. технологии мясных и молочных продуктов КНИТУ, v.y.ponomarev@gmail.com; О. Н. Ильинская - д.б.н., проф., зав. каф. микробиологии К(П)ФУ, olga.ilinskaya@kpfu.ru;
© A. B. Margulis - PhD, assistant professor. Department of Microbiology, Kazan Federal University, anna.margulis@kpfu.ru; S. A. Ryzhkin - assistant professor of general hygiene with a course of radiation hygiene, Kazan State Medical University Russian Ministry of Health, rsa777@inbox.ru; A. N. Slesareva - a leading specialist, Laboratory of Radiation Control LLC "RENIR", anngls.mt@gmail.com; N. V. Belonogova - Post-graduate student Department of Microbiology, Kazan Federal University; V. Ya. Ponomarev - Ph.D., assistant professor. Department of meat and dairy products technology of KNRTU, v.y.ponomarev@gmail.com; O. N. Ilinskaya - Ph.D., Professor, Head of Department of Microbiology, Kazan Federal University, ol-ga.ilinskaya@kpfu.ru.
