CC BY
8
УДК 615.387:612.41(477)
DOI: 10.15587/2313-8416.2017.118384
ДОСЛ1ДЖЕННЯ КР1ОЧУТЛИВОСТ1 КЛ1ТИН ПУПОВИННО1 КРОВ1: ЗВ'ЯЗОК З ОКРЕМИМИ АНТИГЕННИМИ ДЕТЕРМ1НАНТАМИ ГРУП КРОВ1
©Т. О. Калиниченко, М. Ю. Аношина, Р. П. Павлюк, В. В. Балан
Стаття присвячена пошуку можливих зв 'язюв мiж окремими характеристиками фенотипу донора пу-повинно'1 кровi (АВ0 i резус - належнктю) та збереженктю miтинного контенту при щ/iоконсервуван-hí. Виявлено iснування таких зв 'язюв 3i стштстю еритроцитiв та еритро'1'дних клтин-попередниюв ге-мопоезу. Прогнозування ризиюв зниження якостi при збер^ант дозволить попереджати розвиток не-гативних на^дюв шляхом впровадження додаткових заходiв крюзахисту Ключовi слова: пуповинна кров, крюконсервування, АВ0 -групова тарезус-належнють
1. Вступ
Одним з прюритетних напрямшв сучасно! ме-дицини, зокрема виробничо! трансфузюлоги, е ство-рення низькотемпературних баншв крюконсервова-них компоненпв кровi та гемопоетично! тканини.
Китчт результати застосування трансплан-тацшних та трансфузшних медичних технологш тю-но пов'язанi з якiстю донорського матерiалу, що збе-рiгаеться в умовах наднизьких температур. На жаль, як об'екти крюконсервування, клггинш системи кровi та гемопоетично! тканини зазнають руйнiвного впли-ву фiзико-хiмiчних чиннишв пiд час технологiчного процесу, що, не зважаючи на прогрес, все ще призво-дить до значних кшькюно-яшсних втрат [1, 2]. Часто це е результатом особливостей реакци клiтин з рiзною гiстологiчною оргашзащею та специфiчнiстю !х про-тиди стрес-факторам процесу заморожування-ввдтаю-вання [3]. Тому, для розвитку та вдосконалення мето-дiв крiоконсервування клiтинних суспензш необхiдне деталiзоване вивчення можливих зв'язшв збереженос-тi клiтин в умовах крюконсервування з !х окремими шдиввдуальними характеристиками, що i стало шдг-рунтям актуальностi проведених дослiджень.
2. Лггературний огляд
Сьогоднi, як i рашше, пошук нових методiв крюконсервацп клiтинних суспензiй базуеться на ви-вченнi механiзмiв крiопошкодження i крюзахисту у процес заморожування та деконсерваци [4]. Техно-логii крiоконсервування гемопоетично! тканини (пу-повинно! кровi, шсткового мозку, стовбурових клiтин периферично! кров^, що iснують на сьогоднiшнiй день й базуються на класичних тдходах до крюзахи-сту, на жаль, мають обмеженi можливостi кiлькiсного виходу життездатних клiтин пiсля розморожування. Так, життездатшсть ядровмiсних клiтин з цих дже-рел, що зберiгають тд захистом 5-10 % диметилсу-льфоксиду, в середньому складае 75,3-84,3 % [5, 6]. Очевидно, що стутнь крюпошкодження та втрата
клгшн безпосередньо залежать вiд !х природних ада-птацiйних властивостей.
У цьому зв'язку бiологiчна роль рецепторiв груп KpoBi може бути набагато бшьшою, нiж здаеться. Загалом, антигени груп кровi е або вуглеводами, або бшками. Вони приеднанi до рiзних компоненпв мем-брани еритроцита. Вуглеводи, що е антигенами груп кровi АВ0, з'являються в результат! сери реакцш, у яких ензими каталiзують трансфер вуглеводних оди-ниць. Навпаки, антигени групи Rh являють собою бш-ки. Так, антиген D кодуеться геном RHD. Деякi люди мають версш цього гена, що не продукуе антиген D, тому бшок RhD ввдсутнш на !х еритроцитах [7].
На сьогодшшнш день, не дивлячись на знання щодо варiабельностi структури вуглеводних антиге-шв системи АВ0 та !х пол!морфних р!вшв експресй' у тканиннiй та екзокриннш секрецiях, мало що вщомо про Гх бюлопчну важливiсть, функцш та потенцiал застосування у медициш [8]. Вони мають тюш зв'язки з генним, тканинним р!внями, а також з ензи-матичними, бюх!м!чними, та !мунними реакцiями [9]. Так, АВ0 система характеризуеться присутнютю або вщсутшстю двох вуглеводних антигешв (А та В) на мембран еритроцитiв та регулярних антитiл (анти-А, анти-В, анти-А,В) у плазмi кров!. Вуглеводш рецеп-тори груп кров! синтезоваш з прекурсор!в олпосаха-рид!в типу 2, як! е неввд'емною частиною мембрани еритроципв та експресоват попередниками еритроципв. Однак, ri, що синтезуються з прекурсорних ол!госахарид!в типу 1 е зовшшшми, у зв'язку з тим, що вони походять з печшки, тдшлунково! залози, нирок та тонко! кишки. Вони транспортуються з мю-ця синтезу до плазми i попм адсорбуються у мембрану еритроципв [8, 10].
Вуглеводна вар!абельшсть цих групових систем е залученою у мехашзми, пов'язаш з чутливютю до шфекцш, вродженими та набутими !мунними в!дловь дями, онколопчними захворюваннями, трансплантащ-ею солвдних оргатв, дефщитом фактор!в згортання
kpobí, а також е важливими при здiйсненнi трансплан-тацiй оргашв та трансфузш K0Mn0HeHTÍB kpobí [11]. Наприклад, люди з типом kpobí 0 (I) мають тенденц1ю до бшьш низьких рiвнiв факторiв VIII та фон Вшлеб-ранда [12]. Також зазначеш рецептори залученi у про-цес антитiлоопосередкованого вщгоргнення при тран-сплантацй' солiдних органiв [13]. I, навпаки, модуляцiя iмунноi ввдповщ реципiента в умовах АВ0-несумiсноi трансплантацп може мати позитивний ефект щодо ефективностi приживлення [14]. Однак, щ механiзми поки що лишаються не з'ясованими.
Системи груп kpobí мютять антигени, що кон-тролюються одним геном або декшькома тiсно пов'язаними локусами. Системи е генетично вщо-кремленими. Однiею з самих складних е система груп kpobí Rh [15], яка характеризуеться високим по-лiморфiзмом генiв, що кодують ii. Багаточисельнi ге-нетичнi перебудови двох тюно пов'язаних мiж собою гешв RHD i RHCE продукували пбридш, що кодують мiрiади рiзних Rh-антигенiв. У той час, коли 6i-льшiсть типiв груп kpobí визначаеться антигенами еритроципв, що вiдрiзняються однiею або двома амь нокислотами, система Rh вмщуе антиген D, що ввд-рiзняеться вiд С/с та Е/е антигешв 35 амшокислота-ми. З ще1" причини Rh(D)-антиген е потужним стимулятором iмунноi вiдповiдi у виглядi значних гемоль тичних реакцiй при трансфузiях та гемолотичнш хворобi новонародженого [16]. При цьому резус-антигени, на сьогодш, все ще трактуються як бшки з недостатньо вивченою функцiею.
Одним з небагатьох дослвджених моментiв е транспортування амонш через мембрану еритроцита, а також пiдтримка ii цшсносп. Бiлки Rh знаходяться у тюному зв'язку з глшопротешом мембрани еритроцита - RhAG. Функцiя комплексу Rh-RhAG може включати транспортування амонш або двоокису вуг-лецю. Структурно RhD i RhCE е трансмембранними мультипрохiдними бiлками i невiд'емною частиною мембрани. Бшок RhCE кодуе С/с-антиген у другш зо-внiшньоклiтиннiй петл^ а також Е/е-антиген - у чет-вертiй. Також вiн кодуе багато iнших Rh-антигенiв, наприклад Сw, Cx. У свою чергу RhD-бшок кодуе D-антиген. Таким чином, Rh-антигени експресуються як частина бiлкового комплексу на мембранi еритроцита. Цей комплекс виражений тiльки у клгшнах еритроiдноi лiнii. Склад комплексу невадомий, але вважають, що вш представляе з себе тетрамiр з двох молекул Rh-асоцшованого глiкопротеiна (RhAG) та двох молекул Rh^irniB [15]. RhAG повинен бути присутшм, щоб направляти Rh-антигени на мембрану еритроцита. У разi його вiдсутностi m один з Rh-антигенiв не виражений. Вш пов'язаний з бiлками Rh, займаючи бiля 35 % ]_'х первинноi' послiдовностi, i яв-ляе собою той же тип трансмембранного бшка. Однак вiн не е полiморфним i не переносить саш Rh-антигени [17]. Бшки Rh можуть бути RhD (таю, що несуть D-антиген) або RhCE (таю, що несуть С або с-антиген та Е або е-антиген). Невiдомо, чи можуть RhCE та RhD знаходитись в одному комплекс^ але у D-негативних iндивiдуумiв комплекс буде мiстити тшьки RhCE [15].
З точки зору дослвдження крючутливосп важ-ливою е роль Rh-антигенiв у пiдтримцi цшсносп ери-
троцитарно! мембрани. Так, еритроцити, у яких ввдсу-THi Rh-антигени, мають особливу форму. При рвдюс-ному фенотипi Rhnull, спричиненому дшещею RHAG, еритроцити не експресують шякий з Rh -антигенiв (вони не можуть бути направлен на мембрану ериг-роципв). У цьому випадку вiдсутнiсть комплексу Rh змiнюe форму еритроцита, збшьшуе його осмотичну хрупкють та скорочуе тривалiсть життя клгтини [15]. Отже, кожен з гешв RHD та RHCE кодуе трансмемб-ранний проте!н довжиною понад 400 залишюв, що проходить через мембрану еритроцита 12 разiв. Тому, !х важливiсть для пiдтримки структури та цшсносп мембрани клiтини важко переоцшити. Окрiм того, антигени системи резус е трансмембранними проте!на-ми, структура яких дозволяе передбачити наявшсть функци iонних каналiв. Особливостi трансмембранно! транспортно! функцй у клiтинах оаб з рiзною групо-вою приналежшстю теоретично також можуть бути пов'язаними з адаптацшними резервами з точки зору ефективносп здiйснення механiзмiв крюзахисту.
Виходячи з того, що антигенш детермiнанти груп кровi виконують функцш транспортних молекул, каналiв для води, анюшв, iснуе ймовiрнiсть того, що вони можуть вщгравати ключову роль у мехашз-мах крюзахисту, зокрема, при проникненш у клиину крiозахисних речовин, а також у взаемоди цих речо-вин з мембранними структурами клiтини тощо. Деяш з них можуть мати виршальне значення для стабшь-ностi структури мембрани в умовах дп факторiв за-морожування-вiдтаювання.
3. Мета та задачi досл1дження
Мета дослiдження - дослвдити можливий зв'я-зок приналежносл зразкiв ПК до основних двох систем груп кровi АВ0 i Rhesus (з D-позитивними або D-негативними типами кровi) з чутливютю клiтин до факторiв крюконсервування.
Для досягнення мети були поставлен наступнi
задачi:
1. Оцiнити показники якост клiтинних компо-нентiв пуповинно! кров! в!д донор!в з р!зними АВ0 та Rh-фенотипами на етапах процесу крюконсервування.
2. Проанал!зувати наявшсть зв'язюв м!ж зазна-ченими фенотиповими характеристиками донора та шдивщуальними показниками крючутливосп еритроципв та комгтованих еритро!дних клттин-попереднишв гемопоезу у фракцй' ядровмюних клгтин пуповинно! кров! при !! повшьному заморожуванш шд захистом диметилсульфоксиду.
4. Матерiали i методи дослвдження
Об'ектом дослвджень були клиинш компонента пуповинно! кров! (ПК): еритроцитарний концентрат (ЕК), еритроцитарна маса (ЕМ), розморожена вь дмита еритроцитарна маса (РВЕМ), а також фракщя ядровмюних клгтин (ЯВК).
Загопвлю ПК проводили при ф!зюлопчних пологах за умови завчасного отримання шформова-но! згоди ваптно!. Еритроконцентрат (ЕК) отримува-ли з цшьно! стабшзовано! розчином ЦФДА-1 ПК з використанням методики прискорено! седиментацп еритроципв [18]. Середовище для заморожування го-тували на 10 % плазмозам!нюючому коло!дному роз-
чиш декстрину 40 («Реопол^люшн», Юрiя-Фарм, Украна). У якостi KpionpoTeKTopa застосовували ди-метилсульфоксид (ДМСО, Sigma, США) у шнцевш концентрацiï 10 %. Шсля додавання крюконсервую-чого розчину ЕМ розливали у крiопробiрки i заморо-жували до температури м^с 196 °С шляхом швид-кого занурення у рiдку фазу азоту. Матерiал зберта-ли у крiопробiрках об'емом 14 мл (6-9 пробiрок на 1 зразок) протягом вщ 1 до 5 мiсяцiв. Розморожували зразки на водянiй банi при температурi 40±2 °С. Ви-далення ДМСО проводили загальноприйнятим методом триразового центрифугування з використанням сольових розчинiв з поступовим зниженням концент-рацiï' ввд гiпертонiчноï до iзотонiчноï. Пiсля ресуспе-ндування еритроцитiв у 0,9 % розчиш NaCl отриму-вали РВЕМ. Виходячи з принцишв виробничоï' тран-сфузюлогп, оцiнку якосп здiйснювали за вмiстом вь льного гемоглоб^ (Hbv), а також показниками: ге-матокриту (Ht), кiлькостi еритроципв, ïx осмотичноï' резистентностi (ОРЕ) у 0,45 % розчиш натрш хлориду [19, 20].
У якосл крюпротектора для захисту ЯВК ви-користовували ДМСО у кiнцевiй концентраци 5 % (за теxнологieю ДУ "1ГТ НАМН") [21]. ДМСО роз-чиняли у колоïдному розчинi (розчин «Реополплю-шн»). Заморожування ЯВК здшснювали зi швидкiстю 1,0±0,5 °С/хв вад температури 10 °С до -156 °С з на-ступним занурюванням у рiдкий азот. Проби зберта-ли до 6 мiс у рщкш фазi азоту при температурi -196 °С. Розморожування проводили на водянш банi при температурi 38±0,5 °С.
Життeздатнiсть клiтин визначали шляхом суп-равiтального забарвлення клггин за допомогою екс-пресних методiв оцiнки збереженостi цитоплазматич-них мембран (метод Шрека), а також за допомогою проточного цитофлуориметра FACSCan (BD, США) при застосуваннi флуорохрому 7-амино актиномiцину D (7-AAd) за методикою BD [22]. Вмют МНК шдрахо-вували в мазках кровi, забарвлених за Папенгеймом.
Оцiнку пролiферативноï функцп та вмiсту ери-троïдниx клгган-попереднишв гемопоезу визначали в культурi тканини, при постановщ яко1' витримувались стандартш умови культивування у метилцелюлозi зi збалансованим коктейлем вiтамiнiв, амiнокислот, фа-кторiв росту. Густина посiву в стерильних чашках Петрi (d-35 мм) становила 1105 ЯВК на 1 мл. Культивування проводили при температурi 37 °С в умовах абсолютно!' вологосп в присутностi 5 % концентраци СО2 протягом 14 дiб. Пiдраxунок бурст-/ колошеут-ворюючих одиниць еритропоезу (Б-/КУО-Е) здшс-нювали тд малим збiльшенням в швертованому шк-роскопi через 7 i 14 дiб вiд початку культивування. БУО-Е рахували як великi (бшьше 16 кластерiв) + + малi (3-8 кластерiв, що можуть вмщувати 200500 гемоглобiнiзованиx еритрощних клтган); КУО-Е рахували як агрегати, що мютять 100-200 еритрока-рiоцитiв [23].
Концентрацш HbV у зразках РВЕМ визначали за методом [24] в авторськш модифжацп i виражали у перерахунку на вмiст еритроцитiв.
Проникнють еритроцитарних мембран (ПЕМ) визначали методом сечовинного гемолiзу, який базу-
еться на вимiрюваннi ступеня гемолiзу завис ерит-роцитiв пiд дieю i30TOHi4Hm розчинiв сечовини га хлориду натрш у pi3HOMy за об'емом сшввщношенш у п'яти точках (1 - сшввщношення сечовини до хлориду натрш дорiвнюе 45:55, 2 - 50:50, 3 - 55:45, 4 -60:40, 5 - 65:35). Стутнь гемолiзy у % розраховува-ли, виходячи з оптично! щшьносп при 100 % гемоль зу з концентращею сечовини в розчиш 18 г/л [25].
Представництво еритроцитарних антигешв си-стеми АВ0 i резус визначали за допомогою монокло-нальних ангигiл (МКА) у гелевому гесгi [26].
Статистичну обробку отриманих даних проводили з використанням комп'ютерно! програми Microsoft Excel XP. Оцшку значyщосгi вiдмiнносгей середнiх величин здшснювали за t-критерiем Стьюде-нта для непов'язаних мiж собою варiацiйних рядiв, а також за парним ^крш^ем Стьюдента для оцiнки значущосп змiн середнiх величин при порiвняннi пов'язаних сукупностей резyльгагiв, а також непара-метричними кригерiями (U-кригерiй Манна-Упш, кригерiй Вiлкоксона). Оцiнкy зв'язкiв мiж кiлькiсними ознаками здiйснювали методом параметричного коре-ляцiйного аналiзy за коефщентом лiнiйноi парно! ко-реляцй' Прсона [27].
5. Результата дослiджень
Дослщження ступеня проникливосгi еритро-цитарно! мембрани методом сечовинного гемолiзy свiдчагь про знижену сгiйкiсгь мембран резус-негативних еритроципв (n=11), як у нативних клгш-нах (ЕК), так i пiсля експозицп з крiопрогекгором ДМСО (ЕМ), а також у зразках шсля розморожування (РВЕМ) з такою у груш з Rh+ (n=68) (рис. 1, 2).
Встановлено достовiрно менший вмют вшьно-го гемоглобшу у зразках РВЕМ з Rh+: (0,273± ±0,006)-10-11 г проти (0,322±0,024)-10-11 г у зразках з негативним резус-фактором (р<0,05). Тобто, зразки з фенотипом D- проявляють схильнють до гемолiзy. Пiдгвердженням цьому слад вважати статистично значущу рiзницю мiж показниками Ht у групах РВЕМ з D- та D+-феногипами: вщповщно (0,45±0,03 та 0,59±0,13, р<0,001).
1
1
1 1
0 20 40 60 S0 НЮ
■ FKR11+ IFKRh-
Рис. 1. Проникливгсть мембрани нативних еритроцштв у ЕК резус-негативноï i резус-позитивноï ПК: 1 - р<0,001 -вiрогiднiсть вщмшносп мiж показниками у групах зразюв з Rh- i К^+-приналежшстю
Також суттево вiдрiзнялись за показниками ПЕМ групи зразк!в з рiзною АВ0-груповою належнь стю (рис. 3).
0 20 40 60 80 100 ■РВЕМ КЬ 1РВПМЕЬ-
б
Рис. 2. Проникливiсть мембрани еритроцитш резус-негативно! i резус-позитивно! ПК: а - у ЕМ до заморожу-вання; б - у РВЕМ тсля розморожування; 1 - р<0,001; 2 - р<0,05- вiрогiднiсть вiдмiнностi мiж показниками у групах зразкiв з КЬ- i КЬ+-приналежшстю
Результати ПЕМ, отриманi методом сечовин-ного гемолiзу (рис. 3), свщчать, що еритроцити з фенотипом 0, яш належать до 0 (I) групп кровi мають вщносно знижену резпстентнiсть порiвняно з еритроцитами, що мають А та В детермшанти та
належать ввдповщно до А (II) та В (III) груп кровг Разом з тим, еритроцити В (III) групи проявляють тдвищену стiйкiсть вiдносно тих, що мають фенотип 0 та А.
Даш (табл. 1) сввдчать про статистично значу-щу рiзнпцю мiж кiлькiсними показниками зразкiв з рiзною груповою приналежнiстю.
Рис. 3. Проникливють мембрани еритроцитш на етапах крюконсервування в залежност вiд наявносп антигенних детермiнант А та В -специфiчностi: 1 - р<0,05 - вiрогiднiсть рiзнпцi мiж показниками у групах зразюв, що мають у фенотит В та А детермшанти, а також В та 0 вдаовдао у ЕК (1, 2 точки криво! сечовинного гемолiзу); 2 - р<0,001 - мiж показниками у групах зразюв, що мають В та А детермшанти, а також В та 0 вдаовдао у тдготовленш до крюконсервування ЕМ (1, 2 точки); 3 - р<0,001 - мiж показниками у групах зразюв, що мають фенотип 0 та А, а також 0 i В, А i В вдаовдао у тдготовленш до крюконсервування ЕМ (3 точка); 4, 5 - р<0,001 - мiж показниками у групах зразюв, що мають фенотип 0 та В, а також А i В ввдповвдно у РВЕМ (2 точка); 6 - р<0,001 - мiж показниками у групах зразюв, що мають фенотип А i В вдаовдао у РВЕМ (3 точка)
Таблиця 1
nopiBMHra якосп РВЕМ pi3Hoi' АВ0- групово! належносп
а
Показники Група кpoвi
0 (I) n=32 А (II) n=24 В (III) n=14 АВ (IV) n=6
Вмiст еpитpoцитiв (• 109/мл) 2,84±0,26 2,57±0,28 2,25±0,24 3,44±0,611,2
Загальна кiлькiсть еpитpoцитiв у пpoбi (109) 23,66±4,21 16,65±2,80 17,37±3,67 22,87±8,83
Ht 0,44±0,02 0,46±0,03 0,45±0,02 0,49±0,033,4
Осмотична pезистентнiсть еpитpoцитiв (%) 67,7±2,4 77,7±2,45 69,3±4,9 76,5±6,36
Примтка: 1, 2 - р < 0,01 - вiрогiднiсть eidMimocmi мiж eMicmoM еритроцитiв у зразках з А (II) i АВ (IV), а також з В (III) i АВ (IV) групами Kpoei; 3 - р < 0,01 - мiж показниками Htу зразках з А (II) i АВ (IV) групами Kpoei; 4 - р < 0,001 - docmoei-рна вiдмiннicmь мiж показниками Ht у зразках з В (III) i АВ (IV) групами крoei; 5 - р < 0,01 - мiж показниками ОРЕ у зразках з 0 (I) i А (II) групами крoвi; 6 - р < 0,05 - мiж показниками ОРЕ у зразках з 0 (I) i АВ (IV) групами крoвi
Так, вмют еритроципв у зразках з АВ (IV) групою кpoвi перевищував даш у РВЕМ з А (II) та В (III) групами кровг Так шлькюш переваги шдтвер-джуеться показниками вмюту еритроципв у мл роз-морожено! суспензп, а також перевищенням показ-нишв гематокриту у зразках з АВ (IV) групою кpoвi у пopiвняннi з зразками А (II) та В (III) групово! при-належносп. Такий показник як ОРЕ у зразках з А (II) та АВ (IV) значно перевищуе даш у груш зразшв з 0 (I) групою кров^ що може сввдчити про знижену стшшсть мембрани еритроципв з фенотипом 0 до впливу зовшшшх чиннишв. Також статистично зна-чуще (р<0,001) вiдpiзняеться i вмют Hbv у цих зраз-
ках: (0,301±0,008)-10-11 г проти (0,182±0,002)-10-11 г у АВ (IV) груш, а також (0,280±0,007)-10-11 г - у А (II) та (0,274±0,002)-10-11 г - у В (III) груш кровг Тобто найменший piвень цього показника спостертаеться у зразках з АВ (IV) групою кров^ а найвищий - з 0 (I). кнують кopеляцiйнi зв'язки piзнoi сили (ввд пoмipнoi до сильно!) мiж ОРЕ та такими показниками як шлъ-шсть еpитpoцитiв у пpoбi (r=0,401; р<0,05), Ht (r=0,442; р<0,01), а також мiж вмiстoм Hbv та такими показниками як ОРЕ (r=-0,362; р<0,05), Ht (r=-0,532; р<0,01) - для зразшв з 0 (I) групою кровц мiж ОРЕ та шльшстю еpитpoцитiв (r=0,503; р<0,01), вмютом Hbv та вмiстoм еpитpoцитiв у мл РВЕМ (r=-0,547;
р<0,01), а також кiлькiстю клгтин у пробi (r=-0,560; р<0,001) - для зразшв з А (II) групою; ОРЕ та шльшс-тю клгтин у пробi (r=0,511; р<0,05), вмiстом Hbv та такими показниками як шльшсть еритроцитiв (r=-0,518; р<0,05), ïx вмютом у мл РВЕМ (r=-0,508; р<0,05), ОРЕ (r=-0,739; р<0,001), Ht (r=-0,525; р<0,05) -для зразшв з В (III) групою кровц мГж ОРЕ та шльш-
стю еритроцитiв (r=0,793; р<0,01), м1ж Ht та шльшс-тю еритроципв у пробГ (r=0,921; р<0,001) для зразшв з АВ (IV) групою.
За отриманими даними, загалом, комгговаш клiтини-попередники гемопоезу еритровдного ряду у склада зразк1в ПК проявляють вгдносну стшшсть до факторiв крiоконсервування (рис. 4).
=
M
<
m
о ^
<
и §
< X
50 45 40 35 30 25 20 15 10
Bhklttiirr
О (1) а (II) в (Ш) AB (IV) 0 (1) А (II) В (III) AB (IV)
шдготовлеш до крюконсервування
розморожеш
: BMicT БУО Е □ BMicT КУО Е
Рис. 4. Пролiферативна активнiсть клiтин-попередникiв еритропоезу на етапах процесу заморожування-вiдтаювання: 1 - рГзниця мГж показником БУО-Е до та тсля заморожування у зразках з 0 (I)- груповою приналежтстю (р<0,01); 2, 4 - рГзниця мГж показникими БУО-Е та КУО-Е (малГ агрегати) до та тсля заморожування у зразках з А (II)- груповою приналежтстю (р<0,02); 3 - рГзниця мГж показником КУО-Е (малi агрегати) до та тсля заморожування у зразках з
0 (!)-груповою приналежтстю (р<0,001)
Пюля розморожування зниження кiлькостi як БУО-Е, так i КУО-Е у nopiBMHHÎ з результатами, отриманими у щдготовленш до крiоконсервування суспензп ЯВК, виявились статистично значущими тiльки для груш з 0 (I) та А (П)-належнютю. Тобто, субпопулящя клiтин-попередникiв еритропоезу у зразках з В (III) групою виявила дещо вищi показни-ки крiостiйкостi. У той же час зразки з 0 (I) та А (II) показали пвдвищену крючутливють вiдносно таких з В (III) та АВ (IV) групами кровг При цьому життезда-тнють розморожених ЯВК ПК (за даними, отриманими методом протоково! цитофлуориметри з викорис-танням барвника 7 AAd) була суттево нижчою (р< 0,05) у грут зразк1в ПК з 0 фенотипом ((61,6±4,0) %, n=9) порiвняно з А та В (вщповвдно - (90,9±1,7) %, n=7 та (76,7±4,3) %, n=7). Це може свiдчити про ввд-носно зменшену стiйкiсть клiтин з 0 фенотипом до впливу факторiв крюконсервування. Натомють, у разi порiвняння двох груп зразк1в з рiзною резус -приналежнiстю рiзниця рiвня ознаки була статистично не значущою (попри наявнiсть тенденцiï до зниження стшкосп клiтин у резус-негативнш грyпi ((59,5±5,2) %, n=6 проти (73,2±3,1) %, n=26, р>0,05).
Таким чином, комплексно ощнюючи резуль-тати проведених дослвджень показник1в якостi (вмют еритроцитiв, Ht, вiльний гемоглобiн, ПЕМ, ОРЕ) в
еритроцитарних компонентах ПК, а також даш коре-ляцшного аналiзу можна зробити висновок про юну-вання певних зв'язшв мГж окремими Гндивщуальни-ми характеристиками фенотипу донора (до яких вщ-носиться резус- i АВ0-групова приналежнiсть кровГ) та збереженiстю мембран еритроцитiв при екстрема-льних впливах. Дослiдження зв'язшв мгж показниками пролiферативноï активносп комiтованиx кль тин-попередникiв гемопоезу еритровдного ряду у розморожених суспензгях ЯВК та АВ0-груповою приналежтстю кровГ показало, що дана субпопулящя клгтин у грут зразк1в з В (Ш)-належнютю вщзначи-лась дещо вищими показниками крюстшкостг У той же час, зразки з групами кровГ 0 (I) та А (II) проявили пгдвищену крючутливють порГвняно зГ зразками з В (III) та АВ (IV).
ПодальшГ дослщження дозволять встановити критерiï ризику пiдвищеноï крючутливосп зразк1в ПК, що спостерГгаеться у окремих шдивгдуальних випадках, та узагальнити технолопчт можливосп збшьшення крюстшкосп у виглядГ пропозицш щодо шдвищення якосл крюконсервованих клттинних ге-мотрансфузшних засобГв, а також трансплантапв ге-мопоетичноï тканини.
Продовження дослгджень у цьому напрямку розширить знання в галузГ крюпатофГзюлогп клГтини.
Встановлення фактopiв ризику зниження стшкосп клiтин ПК дозволить попереджати негативш наслвд-ки за рахунок застосування додаткових технолопч-них можливостей.
6. Висновки
1. АВ0-, Rh-фенотип донора може бути пов'я-заний з природними адаптацшними властивостями клiтин ПК у протидп зoвнiшнiм впливам.
2. Наявнiсть антигешв В та D у фенотит донора асоцшеться з вщносною стiйкiстю клiтиннoгo контенту ПК до фактopiв кpioкoнсеpвування.
3. Серед еритроцитарних кoмпoнентiв ПК найменш чутливими до негативних чиннишв крюконсервування е зразки з АВ (IV) групою кровг У той же час еритроцити з 0 (I) та резус-негативним фенотипами демонструють пopiвнянo знижену стiйкiсть до фактopiв замopoжування-вiдтаювання.
Лiтература
1. Nicoud, I. B. Cryopreservation of umbilical cord blood with a novel freezing solution that mimics intracellular ionic composition [Text] / I. B. Nicoud, D. M. Clarke, G. Taber, K. M. Stolowski, S. E. Roberge, M. K. Song, A. J. Mathew // Transfusion. - 2012. - Vol. 59, Issue 9. - P. 2055-2062. doi: 10.1111/j.1537-2995.2011.03547.x
2. Chen, G. Comparison of the effects of different cryoprotectants on stem cells from umbilical cord blood [Text] / G. Chen,
A. Yue, Zh. Ruan, Y. Yin, R. Wang, Y. Ren, Li Zhu // Stem Cells International. - 2016. - Vol. 2016. - P. 1-7. doi: 10.1155/ 2016/1396783
3. Гольцев, А. Н. Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцен-трата кордовой крови человека [Текст] / А. Н. Гольцев, В. В. Волина, Л. В. Сокол, М. В. Останков, К. А. Гольцев, С. С. Чер-ноусова, О. Ю. Кожина // Проблемы криобиологии. - 2010. - Т. 20, № 3. - С. 303-308.
4. Szaraz, L. Comprehensive study of hydrostatic pressure treated human umbilical cord blood cells via response surface method [Text] / L. Szaraz, D. Szenasi, T. Oldak, I. Balogh // Cryobiology. - 2014. - Vol. 69, Issue 2. - P. 266-272. doi: 10.1016/j.cryobiol.2014.07.016
5. Kim, K. M. Quality comparison of umbilical cord blood cryopreserved with conventional versus automated systems [Text] / K. M. Kim, J. Y. Huh, J. J. Kim, M. S. Kang // Cryobiology. - 2014. - Vol. 78. - P. 65-69. doi: 10.1016/ j.cryobiol.2017.07.001
6. Fisher, V. Analysis of the recovery of cryopreserved and thawed CD34+ and CD3+ cells collected for hematopoietic transplantation [Text] / V. Fisher, H. Khuu, V. David-OCampo, K. Berne, St. Pavletic, M. Bishop, D. H. Fovler et. al. // Transfusion. -2014. - Vol. 54, Issue 4. - P. 1088-1092. doi: 10.1111/trf.12428
7. Dean, L. Blood Groups and Red Cell Antigens. Ch. 2, Blood group antigens are surface markers on the red blood cell membrane [Electronic resource] / L. Dean. - Bethesda, 2005. - Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2264/
8. De Mattos, L. K. Structural diversity and biological importance of AB0, H, Lewis and secretor histo-blood group carbohydrates [Text] / L. K. de Mattos // Brazilian Journal of Hematology and Hemotherapy. - 2016. - Vol. 38, Issue 4. - P. 331340. doi: 10.1016/j.bjhh.2016.07.005
9. Clausen, H. ABH and related histoblood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution [Text] / H. Clausen, S. I. Hakomori // Vox Sanguinis. - 1989. - Vol. 56, Issue 1. - P. 1-20. doi: 10.1111/j.1423-0410.1989.tb03040.x
10. Oriol, R. Genetics of AB0, H, Lewis, X and related antigens [Text] / R. Oriol, L. Le Pendu, R. Mollicone // Vox Sanguinis. - 1986. - Vol. 51, Issue 3. - P. 161-171. doi: 10.1111/j.1423-0410.1986.tb01946.x
11. Dean, L. Blood Groups and Red Cell Antigens. Ch. 5, The AB0 blood group [Electronic resource] / L. Dean. - Bethesda, 2005. - Available at: www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2267/
12. O'Donnell, J. The relationship between ABO histo-blood group, factor VIII and von Willebrand factor [Text] / J. O'Donnell, M. A. Laffan // Transfususion Medicine. - 2001. - Vol. 11, Issue 4. - P. 343-351. doi: 10.1046/j.1365-3148.2001.00315.x
13. Mangel, M. Phenotypes of antibody-mediated rejection in organ transplants [Text] / M. Mangel, S. Husain, L. Hidalgo,
B. Sis // Transplant International. - 2012. - Vol. 25, Issue 6. - P. 611-622. doi: 10.1111/j.1432-2277.2012.01484.x
14. Aikawa, A. Trends in AB0-incompatible kidney transplantation [Text] / A. Aikawa, K. Saito, K. Takahashi // Experimental and Clinical Transplantation. - 2015. - Vol. 13. - P. 18-22.
15. Dean, L. Blood Groups and Red Cell Antigens. Ch. 7, The Rh blood group [Electronic resource] / L. Dean. - Bethesda, 2005. - Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2269/
16. Westhoff, C. M. The Rh blood group system in review: a new face for the next decade [Text] / C. M. Westhoff // Transfusion. - 2004. - Vol. 44, Issue 11. - P. 1663-1673. doi: 10.1111/j.0041-1132.2004.04237.x
17. Daniels, G. The molecular genetics of blood group polymorphism [Text] / G. Daniels // Transplant Immunology. -2005. - Vol. 14, Issue 3-4. - P. 143-153. doi: 10.1016/j.trim.2005.03.003
18. Калиниченко, Т. А. Преимущества криоконсервирования гемопоэтической ткани пуповинной крови с применением оптимизированного метода снижения объема образца [Текст] / Т. А. Калиниченко, М. Ю. Аношина, В. В. Балан // Гематология. Трансфузиология. Восточная Европа. - 2017. - Т. 3, № 4. - C. 734-743.
19. Цуцаева, А. А. Криоконсервирование клеточных суспензий [Текст] / А. А. Цуцаева, В. А. Аграненко, Л. И. Федорова и др.; ред. А. А. Цуцаева. - К.: Наукова думка, 1983. - 240 с.
20. Калиниченко, Т. О. Еритроцити пуповинно! кpoвi як об'ект довгострокового зберггання при наднизькш темпера-туpi [Текст] / Т. О. Калиниченко, М. Ю. Аношина, Г. Т. Глухенька, М. К. Алгазшова // Збipник наукових праць ствробгтни-кгв НМАПО iм. П. Л. Шупика. - 2014. - № 23 (2). - С. 515-521.
21. Калиниченко, Т. О. Спрощений метод крюконсервування гемопоетично! тканини пуповинно! кpoвi [Текст] / Т. О. Калиниченко, М. Ю. Аношина, £. В. Шороп, Ж. М. Мгнченко, В. В. Балан // Збipник наукових праць сшвробгтникгв НМАПО iм. П. Л. Шупика. - 2017. - № 27. - C. 253-262.
22. Schmid, I. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry [Text] / I. Schmid, W. J. Krall, C. H. Uttendogaat, J. Braun, J. V. Giorgi // Cytometry. - 1992. - Vol. 13, Issue 2. - P. 204-208. doi: 10.1002/cyto.990130216
23. Балашова, В. А. Клеточные культуры [Текст] / В. А. Балашова; ред. К. М. Абдулкадыров // Гематология: Новейший справочник. - М.: Изд-воЭксмо; СПб.: Изд-воСова, 2004. - С. 100-122.
24. Савельев, О. Н. Определение свободного гемоглобина плазмы крови гемиглобинцианидным методом [Текст] / О. Н. Савельев, В. П. Сухоруков, А. В. Киселева, Г. А. Королева // Лабораторное дело. - 1990. - № 10. - C. 45-47.
25. Колмаков, В. Н. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран (ПЭМ) в диагностике хронических заболеваний печени [Текст] / В. Н. Колмаков, В. Г. Радченко // Терапевтический архив. - 1982. - № 2. - С. 59-62.
26. Lapierre, Y. The gel test; a new way to detect red cell antigen-antibody reaction [Text] / Y. Lapierre, D. Regal, J. Adam, D. Josef, F. Meyer, S. Greber, C. Drot // Transfusion. - 1990. - Vol. 30, Issue 2. - P. 109-113. doi: 10.1046/j.1537-2995.1990.30290162894.x
27. Петри, А. Наглядная медицинская статистика [Текст]: уч. пос. / А. Петри, К. Сэбин; ред. В. П. Леонова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 216 с.
Рекомендовано до публжацп д-р мед. наук, професор Лановенко 1.1.
Дата надходження рукопису 23.10.2017
Калиниченко Тетяна Олекспвна, кандидат медичних наук, старший науковий сшвробгтник, заввдувач лабораторп, Лабораторгя крюконсервування гемопоетичних клгтин, Державна установа «1нститут гематологи та трансфузюлоги Нацюнально! академп медичних наук Украши», вул. Максима Берлинського, 12, м. Кшв, Украша, 04060 E-mail: [email protected]
Аношина Мштна Юрй'вна, кандидат бюлопчних наук, старший науковий сшвробгтник, керiвник гру-пи, провщний науковий сшвробгтник,Група бюх1ми, Державна установа «1нститут гематологи та трансфузюлоги Нацюнально]! академи медичних наук Украши», вул. Максима Берлинського, 12, м. Кшв, Украша, 04060
E-mail: [email protected]
Павлюк РаТса Пантелеймошвна, кандидат медичнш наук, старший науковий сшвробгтник, керiвник групи, провщний науковий сшвробгтник, Група iмуногематологii, Державна установа «1нститут гематологи та трансфузюлоги Нацюнально' академп медичних наук Украши», вул. Максима Берлинського, 12, м. Кив, Украша, 04060 E-mail: [email protected]
Балан Валентина Володимирiвна, науковий сшвробгтник, Лабораторiя iмуногенетики, Державна установа «Нацюнальний науковий центр радiацшноi' медицини Нацюнально].' академп' медичних наук Украь ни», вул. Мельникова, 53, м. Ки'в, Украша, 04050 E-mail: [email protected]
