CC BY
9
ППеНА, ЕКОЛОГ1Я ТА ЕП1ДЕМ1ОЛОГ1Я
DOI 10.29254/2077-4214-2018-2-144-107-114 УДК 615.9:632.95:612.6:591.16 Колянчук Я. В.
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ГОНАДОТОКСИЧНО'1' АКТИВНОСТ1 ЦИПРОКОНАЗОЛУ
НА САМЦЯХ I САМИЦЯХ ЩУР1В WISTAR HAN ДП «Науковий центр превентивно! токсикологи, харчовот та xímí4hoi безпеки iMeHi академiка Л.1. Медведя МОЗ УкраТни» (м. КиТв)
Зв'язок nублiкацГí з плановими науково-дослщ-ними роботами. Робота виконана в рамках НДР ДП «Науковий центр превентивно! токсикологи, харчовоТ та хiмiчноT безпеки iMern академта Л.1. Медведя Mi-нiстерства охорони здоров'я УкраТни» за темою «На-укове обг"рунтування сучасних нормативних вимог до застосування пестицидiв i агрохiмiкатiв: прогно-зування вщдалених ефектiв ди (канцерогенноТ, му-тагенноТ, тератогенноТ активностi, репродуктивноТ токсичностi, хрошчних штоксикацш)», № державноТ реестраци 0108U007458.
Вступ. Основним завданням превентивноТ токсикологи е запобiгання шкiдливому впливу ксенобюти-кiв, що надходять в оргашзм людини з рiзних об'еклв навколишнього середовища. Такими об'ектами мо-жуть служити продукти харчування, харчовi добавки та вода, забрудненi залишковими кiлькостями хи мiчних засобiв захисту рослин. В усьому свiтi вико-ристовуються синтетичнi пестициди, кiлькiсть яких швидко зросла за останнi п'ятдесят ромв завдяки ш-тенсифтаци сшьського господарства. Вирiшення щеТ проблеми зводиться до мiнiмiзацi! забруднення пестицидами, а також до оцшки ризику Тх застосування, яка неможлива без адекватноТ i надшноТ щентифта-ци небезпеки хiмiчних сполук, як показали ктька не-давнiх дослiджень [1,2].
Репродуктивне здоров'я людини е одшею з осно-вних проблем в галузi здоров'я, що свiдчить про зниження рiвня репродуктивного здоров'я чолови чоТ статi та збiльшення кшькосл безплiдних чолови кiв [2]. Глобальна величина проблеми вщображена в тому, що кожен рт 60-80 мшьйошв пар виявляють безплiддя i це шдкреслюе необхiднiсть проведення дослiджень у цш галузi для вивчення стану репродуктивного здоров'я та впливу еколопчних антиан-дрогенiв, що вщзначено у роботах ШепельськоТ Н.Р. та Моклячук Л.1. iз спiвавторами (WHO 1996) [2,3].
Iдентифiкацiя небезпеки репродуктивноТ токсич-ностi пестицидiв е одшею з найактуальшших в про-цес оцiнки ризику Тх застосування. У зв'язку з цим методологiя дослщження репродуктивноТ та гона-дотоксичностi, зокрема, е детермшуючим фактором в отриманш релевантних даних. Bolognesi C. та Naharashi T. [4,5] розглянули та проаналiзували оцш-ку ризимв, якi ["рунтуеться на отриманих результатах дослщжень вiд батькiвського поколiння та потомства, що охоплюють ва етапи онтогенезу.
Хоча деякi пестициди викликають репродуктивну токсичнiсть на високих дозах у моделях тварин, не-сприятливi наслiдки для здоров'я людей важко оци нити [2, с6.1]. Деякi фунгiциди, як вiдомо, порушують
ендокриннi системи i може призвести до вад репродуктивноТ функци та розвитку плоду. Ряд пестицидiв, таких як вшклозолш, дикофолу, атразин та шш^ вщ-носяться до важливих класiв хiмiчних речовин, що руйнують ендокринну систему, якi, як вщомо, пере-шкоджають синтезу, транспорту, зв'язуванню, ди, елiмiнацiТ природних гормошв в органiзмi, якi вщ-повiдальнi за пiдтримання гомеостазу, регулювання процесiв розвитку та обмiну речовин, про що ствер-джуе ряд авторiв [6-9].
Деякi фунгiциди впливають на вщтворення рiзних механiзмiв ди, ендокринн порушення: екзогеннi ре-човини перешкоджають нормальному процесу вщ-творення та розвитку [10,11]. У чоловшв нормальна репродуктивна функщя передбачае взаемодiю ппо-таламо-гiпофiзарного зв'язку з гонадами та щито-видноТ залози. У самок збтьшуеться концентрацiя естрогенiв, що можуть впливати на функцш яечни-мв через порушення механiзму зворотного зв'язку в гормональному ланцюзг
В статт Nidhi Mathur та iн. [9,12] розповщае про оцiнку тератогенних ефемчв трьох триазольних фун-гiцидiв (триадимефон, тебуконазол, ципроконазол) на ембрюнах щурiв. Ця робота вказуе на те, що ви-пробуванi триазоли володти тератогенною актившс-тю у гризушв та викликали аномали розвитку.
Наприклад, фенаримол, прохлораз та хлоратоло-шл викликають безплiддя у самцiв та самиць щурiв через iнгiбування ферменлв, якi беруть участь в ме-таболiзмi стероТ^в, змiнi сексуальноТ диференщаци через антагонiзм рецепторiв андрогенiв. Склад авто-рiв iз Suresh C. [13] показав, що фунгщид вшклозалш викликае ендокринно-модулюючi ефекти у плодiв самцiв, пiсля експозици пiд час останнього триместру вагiтностi. Виявлеш морфологiчнi змiни статевих органiв, зменшення аногештальноТ вiдстанi та iншi пороки розвитку у нащадшв.
З експериментальних дослщжень було зроблено висновок, що фунгщиди можуть порушувати проце-си розмноження i розвитку у обох статей через вплив на ендокринш сигнали в оргашзм^ непрямий вплив пщ час пренатального або раннього постнатального життя. Там ефекти при розвитку плоду можуть бути незворотними, як вказуе у своему методолопчному пiдходi RefD.B. iз ствавторами [14].
Тому метою даноТ роботи було щентифтувати небезпеку i оцiнку ризику гонадо- та репродуктивноТ токсичност впливу п'яти генеричних пестицидiв ци-проконазолiв рiзних виробникiв та концентрацiй на самщв i самиць щурiв Wistar Han та порiвняти отри-маш данi.
Об'ект i методи дослiдження. Для вивчення го-надо- та репродуктивно'1 токсичностi синтетичного триазольного фунпциду ципроконазолу (ЦИП) було проведено дослщження п'яти генеричних актив-них дiючих речовин пестициду рiзних виробникiв. Чистота дослiджуваних сполук становила: C1-95 %, C2-95.48 %, C3-95.8 %, C4-95.98 % та C5-96.3 %. В дослiдженнях використовували самщв та самиць щурiв лшп Wistar Han масою 80-100 г. Тварини були отримаш з SPF розплщника ДП „Науковий токсико-логiчний центр iменi академiка Л.1. Медведя МОЗ Украши". Ддаптацiйний перiод продовжувався п'ять дшв. Протягом цього часу проводили щоденш спо-стереження за íx фiзiологiчним станом для виявлен-ня ознак патологш. Щури рандомiзувались за масою тта. При значному вщхиленш вiд середньо'! маси тварин вибраковували. Паралельно з контрольними i шддослщними тваринами утримувались штактна група самиць для спарювання.
Для кожно'! тестово'! субстанци ЦИП, тварини були розподтеш на три групи по 20 самщв щурiв в кож-нш. Експериментальним тваринам вводилась тесто-ва субстанщя extempore щодня, окрiм суботи i недЫ, внутрiшньошлунково за допомогою зонду двом трупам тварин в дозах 0,2 та 2 мг/кг маси тта протягом 10-11 тижшв самцям та 9-10 тижшв самицям. Контрольна група самщв та самиць отримувала дистильо-вану воду з емульгатором (0П-10) в е^валентних ктькостях. Розчини вводили iз розрахунку 0,5 мл на 100 грам маси тта тварин. Для корекцп об'ему роз-чину, що вводився, вiдповiдно до збiльшення маси тта тварини щотижня зважувалися.
Дослщження на тваринах проведенi згiдно до вимог та положень Комю'| з етики медичних та бюло-пчних дослiджень «Наукового центру превентивно'!' токсикологи, харчово'! та xiмiчноí безпеки iменi ака-демiка Л.1. Медведя МОЗ Украши» та «бвропейсько''' конвенцп про захист тварин, що використовуються в експериментальних та шших наукових цтях» (Страсбург, 18.03.1986) ETS №123, "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (National Academies Press, USA, 2011) [15,16].
Умови утримання тварин: тварини були розми щеш в конвенцшному вiварií. Ммната була забезпе-чена примусовою вентилящею (12 об'eмiв в годину), яка виключала рециркулящю повiтря. Температура i вщносна вологiсть повiтря рееструвалися щодня, коливання температури 19 до 24°С, вологосп - вiд 30 до 70%. Осв^лення було штучним, цикл 12 годин «день-шч».
Забезпечення водою: тварини отримували де-юшзовану, знезаражену УФ-опромiненням i очи-щену зворотним осмосом, фiльтровану питну воду adlibitum з пластикових пляшок об'емом 0,5 л^ра через металевi наконечники.
Ра^он: упродовж всього експерименту щури отримували adlibitum збалансований гранульований корм зi зниженим вм^ом природних фтэестрогешв виробництва Альтромш (Нiмеччина).
Тип кл>ток i кльксть тварин в кл'тцг. тварини були розмЦеш в кликах типу М4 впродовж усього перюду дослщжень. Корпус клiтки (40х30х15 см) виготовлений з мщного пластмасового матер!алу, згори накритий металевими з'емними реш^ками.
Пiдстилка з стерилiзованого, не хлорованого харчо-вого паперу змшювалася 1 раз на тиждень.
Ознаки загальнотоксичноУ д'УУ: ycix тварин упродовж усього перюду дослщження обстежували з метою реестраци будь-яких видимих ознак реакцп на дiю сполуки, що вивчалася.
Маса тiла: шддослщних тварин зважували щотижня протягом усього перюду експозицп. 1нтактних самиць зважували на 0 та 20 день ваптносп. Пщдо-слiдних та контрольних тварин зважували на 0, 6, 13 i 20 дш postcoitum.
Естральний цикл. Упродовж останшх 2-х тижшв перюду експозицп у пщдослщних самиць щодня брались вапнальш мазки з метою визначення трива-лост всього естрального циклу, частоти i ци^чносп його окремих стадiй. Мазки також робили з першого дня пщсаджування iнтактних самцiв до пщдослщних самиць для визначення моменту спарювання.
Морфо-функцiональнi показники стану ам'янишв: тсля закшчення термiну експозицп з шд-дослiдних груп вiдбирали 10 самщв розподiлених по масi, якi пщдавалися дослiдженню морфо-функцю-нального стану статевих залоз. Визначали загальну кiлькiсть сперматозо'^в i кiлькiсть спермiй, що руха-ються та кiлькiсть аномальних сперматозо'^в. Пщра-хунок проводили мiкроскопiчно у 20 великих квадратах камери Горяева.
Процедура спарювання: тсля запланованого перюду експозицп ЦИП, 10 тддослщних самщв з кож-но''' групи спарювали з iнтактними самицями, а шд-дослiднi самицi злучалися з штактними самцями (в стввщношенш 1 самець до 2 самиць). Кожен ранок протягом перюду спарювання брались вапнальш мазки для кожно''' самиць як дослiджували на на-явнiсть сперматозо'^в. День знайдення спермш у вагiнальному вмiстi самицi приймалися за 0 день ваптносп. Пкля встановлення факту спарювання сами-цю вiдсаджували в окрему кл^ку i припиняли взяття мазкiв. Тривалiсть перiоду спарювання не перевищу-вала 3-х тижшв.
Пре^тальний iнтервал: визначали час, що пройшов вщ моменту шдсаджування самцiв до самиць до встановлення факту заплщнення. Зна-чення преко^ального iнтервалу вираховуеться за формулою:
Т(День перiоду спарювання) • (к-ть самиць, спарених в цей день) Загальна кшьмсть спарених самиць
Показники репродуктивноУ здатност>: на 20-й день ваптносп у контрольних, пщдослщних та ш-тактних самиць, спарених з шддослщними самцями вивчали репродуктивш показники: загальну кшьмсть жовтих тт в яечниках; кшьмсгь мiсць iмплантацi'''; кшьмсть резорбованих зародкiв i плодiв; кшьмсть мертвих та живих плодiв; наявшсть грубих аномалiй розвитку; середню масу плодiв; загальну масу приплоду.
Терм'шальнi досл'дження: шддослщш та штактш самцi пiсля закiнчення перiоду спарювання виводи-лись з експерименту. Всiх самиць, якi заваптнти, пiддавали евтаназп на 20-й день вагiтностi, а спарених, але не ваптних самиць, на 20-й день припусти-мо''' вагiтностi.
Самиць, у яких впродовж 3-х тижшв спарювання факт заплщнення так i не був зареестрований, у раз1
вiдсутностi явних ознак ваптносп розтинали i досли джували. Евтаназiя тварин здiйснювалась за допо-могою С02-камери.
Макроскопя: ус пiддослiднi тварини, що розти-налися в ходi експерименту, пiддавалися макроско-тчному обстеженню. Реестрували виявленi змши I вiдхилення. Сiм'яники i придатки вщ 10 тддослщ-них i контрольних самцiв видiляли i зважували.
Здатнсть до спарювання /' плодюч'сть: для кожноУ групи i стат тварин були визначенi iндекси спарювання, зачаття, фертильностi та вагiтностi за наступними формулами:
1ндекс спарювання =
1ндекс зачаття = 1ндекс фертильност = 1ндекс вагiтностi =
к1-сть спарених самиць кисть, що спарювалась кисть, що завагiтнiли кi-сть спарених самиць кисть, що завагiтнiли кисть, що спарювалась кисть, самиць з живими плодами кисть, що заваптшли
х 100
х 100
х 100
х 100
Статистична о^нка: статистична рiзниця мiж групових в^мшностей (Р<0,05) оцiнювалася за допо-могою ANOVA.
Дослiдження проведенi зпдно стандартних опе-рацiйних процедур «Наукового центру превентивно'! токсикологи, харчовоУ та хiмiчноУ безпеки iменi ака-демша Л.1. Медведя МОЗ УкраУни», розроблених у вщповщност до рекомендацiй та вимог НалежноУ лабораторноУ практики ^Р).
Результати дослiдження та Ух обговорення. До-слiджуванi тестовi субстанци ЦИП у вах вивчених дозах не впливали на загальний фiзiологiчний стан тддослщних самцiв i не викликали Ух смертность
У групi самщв м^мальноУ дози 0,2 мг/кг за дм всiх п'ятьох тестових субстанцiй достовiрних змiн ди-намiки маси тта не спостерiгалося впродовж всього термшу експозицп. Пiсля впливу максимально'' дози 2 мг/кг, ттьки С2 проявив загальнотоксичний ефект: зафiксовано вiрогiдне зниження маси тiла тддоЫд-них тварин в порiвняннi з контрольною групою по-чинаючи з 2-го i до 10-го тижня експозицп на 4.9 % 5.3 %, 5.7 %, 6.7 %, 6.4 %, 6.5 %, 6.4 %, 6.1%, 6.1%, вiдповiдно (рис. 1).
Вс п'ять тестових субстанцiй в максимально доз1 в дослiдженнях на самцях володти репродуктивною токсичнiстю та мали виражену антиандрогенну д^,
що проявилась змшами морфо-функцiональних по-казниюв стану статевих залоз (рис. 2):
- вiрогiдне зменшення кiлькостi рухливих сперма-тозо'^в при дп С1-С5 на 15.6 %, 28.2%, 30.3 %, 32.3 %, 27.5 %, в^повщно;
- достовiрне зниження вщсотка рухливих сперма-тозо'^в у С1-С5 на 12.9 %, 17 %, 20.8 %, 23.7 %, 12.6 %, в^повщно;
- вiрогiдне зменшення загальноУ кiлькостi сперми для С2-С5 на 13 %, 12.3 %, 12.1 %, 17.9 %, в^повщно;
- вiдмiчене значне вiрогiдне збтьшення патоло-гiчних форм спермiй при дм С1(на 134 %) та С3 в 4,5 рази.
Тестовi субстанцп в дозi 2 мг/кг проявили шшдли-вий вплив на фертильшсть самцiв, яку оцiнювали за показниками стану репродуктивноУ функцп завапт-швших вiд них iнтактних самиць. Змши Ух репродук-тивних показникiв представлен у таблицi 1 засвiдчу-ють:
- вiрогiдне зниження кiлькостi жовтих тт в яечни-ках на 9.7 % при дм С3;
- достовiрне збiльшення кiлькiстi (на 88.2 %) та высотка (на 143.9 %) преiмплантацiйноУ загибел1 ембрiону за дм С1 та кiлькостi (на 134.4 %) i вiдсотка (142.9 %) поспмплантацшноУ загибелi плодiв тсля впливу С5;
- достовiрне зменшення шлькост живих плодiв та маси приплоду на 16.24 %, 16.2 %, вщпов^но;
- вiрогiдне зниження середньоУ маси тiла плодiв на 6.7 % при дм С2.
Дослiджуванi тестовi субстанцп ЦИПу всiх вивчених дозах не впливали на загальний фiзiологiчний стан тддослщних самиць i не викликали Ух смертность
У групi самиць м^мальноУ дози за дп вах тестових субстанцш достовiрних змш динамiки маси тiла не спостеркалося впродовж всього термiну експозицп. Пкля впливу максимально'' дози С1, С4 та С5 також не проявили загальнотоксичний ефект. У той час як у самиць, котрi отримували С2 було в^значе-но вiрогiдне зниження динамiки маси тта з 6 по 9 тижш експозицп на 5.4 %, 6.7 %7 % та7.5 %, в^повщ-но. Впродовж вагiтностi самиць прирiст маси тiла за-лишався вiрогiдно нижчим в порiвняннi з контролем (рис. 1): на 0-й день ваптносп (на 10.1 %), 6-й (на 8.8 %), 13-й (на 8.2 %) i 20-й (на 7.2 %). При дп С3 було вiдмiчене вiрогiдне зменшення динамки маси тiла лише на 20-й день ваптносп самиць на 4.6 %. З вище
Рис. 1. Динамка маси т1ла самц1в та самиць щур1в в пер1од експозицп, а також шд час ваптносп самиць. Примггка: * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001 пор1вняно з в1дпов1дним контролем.
описаного можна припустити, що тiльки С2 та С3 во-лодiли загальнотоксичним ефектом.
При дослщжены естрального циклу у самиць, як1 отримували ЦИП в максимальнш дозi, зафiксованi настYпнi достовiрнi змiни:
- при дГ|' С4 зниження тривалостi естрального циклу та стади дiеструс на 8.9 % i 28.7 %, вiдповiдно;
- збтьшення тривалостi стади дiеструс на 24.3 % за дм С2 та на 16 % тсля впливу С5;
Рис. 2. Загальш морфо-функцюнальш показники сперми самщв (змши представлен у высотках вш контролю). Примггка: * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001; **** - Р<0,0001 порiвняно з вщповщним контролем.
Таблиця 1.
Репродуктивш показники 1нтактних самиць
Тестов1 субстанци Дози, мг/кг Середня к-сть жовтих тт Середня к-сть живих плод1в Пре1мплантацшна загибель зародтв Поспмплантацшна загибель зародтв, плод1в Загальна маса приплоду, г Середня маса плод1в, г
К-сть % К-сть %%
(М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т)
С1 0 14,8±0,5 11,7±0,5 1,7±0,3 11,3±1,9 1,5±0,3 9,5±2,2 43,8±1,7 14,8±0,5
0.2 14,6±0,4 11,1±0,4 2,45±0,5 16,1±3,2 1,0±0,3 6,9±2,1 43,0±1,6 14,6±0,4
2 15,5±0,5 11,6±0,6 3,2±0,5** 20,6±3,4* 0,8±0,2 4,8±1,4 43,6±2,4 15,5±0,5
С2 0 12,7±0,4 11,0±0,6 1,2±0,4 10,1±3,2 0,5±0,2 3,6±1,4 40,9±2,0 3,7±0,0
0.2 13,7±0,4 11,8±0,5 1,4±0,3 9,6±2,4 0,5±0,2 4,0±1,6 42,6±1,9 3,6±0,0
2 13,3±0,4 11,4±0,5 1,3±0,4 9,8±3,3 0,7±0,2 5,0±1,2 39,8±2,0 3,5±0,1***
С3 0 13,8±0,4 12,3±0,4 0,8±0,16 5,2±1,1 0,8±0,2 5,5±1,1 46,4±1,6 3,8±0,1
0.2 13,0±0,4 11,5±0,4 0,9±0,31 6,01±2,0 0,7±0,2 5,1±1,1 42,6±1,3 3,7±0,0
2 12,4±0,5* 10,3±0,6** 1,3±0,4 10,9±3,4 0,9±0,2 7,0±1,3 38,9±2,3** 3,8±0,1
С4 0 14,2±0,5 10,6±0,8 2,6±0,8 18,4±5,0 0,8±0,3 5,7±2,2 39,4±2,9 3,8±0,1
0.2 12,9±0,5 10,4±0,6 1,6±0,4 12,0±3,1 0,8±0,2 6,7±1,8 38,4±2,1 3,7±0,1
2 13,3±0,4 11,6±0,7 1,1±0,5 8,2±4,2 0,7±0,2 5,6±1,6 43,4±2,6 3,7±0,1
С5 0 13,6±0,4 11,7±0,6 1,6±0,6 11,3±4,2 0,3±0,1 2,2±0,9 41,7±2,1 3,6±0,1
0.2 13,9±0,4 12,5±0,4 0,9±0,2 6,2±1,7 0,6±0,2 3,8±1,2 43,4±1,6 3,5±0,1
2 13,9±0,4 11,9±0,6 1,3±0,4 9,0±2,9 0,8±0,2* 5,4±1,2* 43,8±2,2 3,7±0,0
Таблиця 2.
Репродуктивнi показники контрольних та шддослщних самиць
Тестов1 субстанцГ'' Дози, мг/кг Середня к-сть жовтих тт Середня к-сть живих плод1в Пре1мплантацшна загибель зародюв Послмплантацшна загибель зародюв, плодш Загальна маса приплоду, г Середня маса плод1в, г
К-сть % К-сть %
(М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т) (М ± т)
С1 0 14,8±0,5 11,7±0,5 1,7±0,3 11,3±1,9 1,5±0,3 9,5±2,2 43,8±1,7 14,8±0,5
0.2 14,7±0.3 11,6±0,6 2,1±0,5 14,5±3,7 1,1±0,2 7,3±1,5 42,1±1,8 3,8±0,2
2 13,8±0.5 11,4±0,4 1,7±0,5 11,0±3,3 0,8±0,2 5,8±1,5 43,5±1,4 3,9±0,1
С2 0 12,7±0,4 11,0±0,6 1,2±0,4 10,1±3,2 0,5±0,2 3,6±1,4 40,9±2,0 3,7±0,0
0.2 12,3±0,4 9,8±0,6 1,5±0,3 11,4±2,7 1,0±0,2 8,4±2,2 36,1±2,1 3,7±0,1
2 12,5±0,5 9,7±0,4 1,6±0,3 12,0±2,4 1,2±0,3* 9,4±2,0* 35,2±1,6* 3,6±0,0*
С3 0 13,8±0,4 12,3±0,4 0,8±0,16 5,2±1,1 0,8±0,2 5,5±1,1 46,4±1,6 3,8±0,1
0.2 12,7±0,4 10,8±0,7 1,3±0,5 10,4±3,8 0,5±0,2 4,3±1,3 41,7±2,5 3,9±0,1
2 13,0±0,3 11,0±0,4* 1,6±0,3* 12,1±2,4** 0,5±0,2 3,9±1,3 40,5±1,6** 3,7±0,1
С4 0 14,2±0,5 10,6±0,8 2,6±0,8 18,4±5,0 0,8±0,3 5,7±2,2 39,4±2,9 3,8±0,1
0.2 13,7±0,4 10,9±0,6 1,9±0,5 14,5±4,6 0,9±0,2 6,1±1,3 39,5±2,4 3,6±0,1
2 14,2±0,4 12,2±0,3 1,4±0,4 9,3±2,4 0,6±0,2 4,0±1,1 44,8±1,6 3,7±0,1
С5 0 13,6±0,4 11,7±0,6 1,6±0,6 11,3±4,2 0,3±0,1 2,2±0,9 41,7±2,1 3,6±0,1
0.2 14,1±0,5 12,0±0,7 1,3±0,4 9,8±2,9 0,8±0,2 5,8±1,6 42,77±2,3 3,6±0,1
2 14,4±0,4 11,6±0,7 1,5±0,3 11,3±3,1 1,3±0,4* 8,9±2,6* 41,2±2,3 3,6±0,04
- зменшення тривалостi фази проеструс на 17.1 % при дм С5.
Тривалiсть циклу та окремих його стадш у пщдо-слiдних самиць пiсля експозицп С1 та С3 в усiх досли джуваних дозах вiрогiдно не змшювались (рис. 3).
Встановленi змiни, там як зменшення тривалост естрогензалежноУ' стадй проеструса, а також збть-шення стадп дiеструса у самиць, на нашу думку, мо-жуть вказувати на дисбаланс статевих гормошв. Тому можна припустити, що ЦИП володiе ендокрин диз-рапторними властивостями.
При макроскотчному обстеженнi внутрiшнiх ор-гашв самиць нiяких змiн, пов'язаних з впливом ЦИП, не виявлено.
Тест^ субстанцй С2, С3 та С4 вплинули на показники стану репродуктивноУ функцй в пiддослiдних групах самиць в дозi 2 мг/кг, ям проявились в наступ-них доа^рних змiнaх:
- зниження загальноУ маси приплоду на 13.9 % I 12.7 % при дм С2 i С3, вiдповiдно;
- зменшення млькосп живих плодiв на 10.6 % за д" С3;
- зниження середньоУ маси тта плодiв пiсля впли-ву С2 на 3.2 %;
- збтьшення кiлькостi та вiдсоткa преiмплaнтa-цшноУ зaгибелi ембрiону за дй С3 на 106.7 %, 147.6 %;
- пщвищення ктькосл та вщсотка пiсляiмплaнтa-цшноУ зaгибелi плодiв при дй С2 на 148.9 % та 163.7 %, вщповщно, а шсля впливу С5 в 4 рази вщносно контролю.
Тестовi субстанцй С1 та С4 не порушували параме-три фертильностi самиць там, як мльмсть жовтих тт в яечниках; число i процентне стввщношення пло-дiв, загиблих до i пiсля iмплaнтaцй; кiлькiсть живих плодiв, а також середня маса плодiв i загальна маса приплоду (табл. 2).
^сля впливу С4 на рiвнi максимально' дози у експериментальних самиць встановлено вiрогiд-не зниження шдекав зачаття та фертильностi на 20 %.Тенденщя ж до зменшення цих шдекав у самиць вiдмiчaлaсь за дй С1, С2 та С5 (рис. 4).
Примака: * - Р<0,05; ** - Р<0,01 пор1вняно з в1дпов1дним контролем.
Рис. 3. Естральний цикл та тривал1сть окремих його стадш. Примггка: * - Р<0,05; ** - Р<0,01 пор1вняно з в1дпов1дним контролем.
Рис. 4. 1ндекси зачаття та фертильносп контрольних та шддослщних самиць. Приметка: * - Р<0,05 порiвняно з вщповщним контролем.
Пщсумовуючи результати дослiджень iзольова-ного впливу генерикiв ЦИП на гонади та репродук-тивну функщю щурiв Wistar Han, показано, що змши дослiджуваних параметрiв при дм певних тестових субстанцш були бтьш та менш вираженi й проявлялись статевою чутливiстю. На нашу думку, при ви-вченнi генеричних пестицидiв, домiшки можуть по рiзному проявляти токсичну дй. Оцiнюючи отримаш результати та порiвнюючи Тх з чистотою активно! ди ючо' речовини кожного з ЦИП (C1-95 %, C2-95.48 %, C3-95.8 %, C4-95.98 % та C5-96.3 %), пщтверджено, що концентрацiя додаткових iнгредieнтiв продемон-струвала рiзнi прояви репродуктивно' токсичносл. Тому, дослiдження генеричних пестицидiв е необхщ-ною складовою в процес токсиколопчно''' оцiнки Тх ризику та щентифтацй небезпеки.
Висновки
Усi дослщжеш тестовi субстанцй генеричного ци-проконазолу на високому рiвнi доз волод^ть гона-дотоксичною активнiстю, яка була вiдмiчена в обох статей.
В дозi 2 мг/кг маси тiла встановлено загальноток-сичний ефект у самщв та самиць впродовж експози-цй C2, а також у самиць пщ час вагiтностi пiсля впливу C2 та С3.
Усi тест^ субстанцй ЦИП чинять виражену анти-андрогенну дiю, що проявляеться змшами морфо-
функцiональних показникiв стану статевих залоз у пiддослiдних групах самщв.
Тестовi субстанцй' C2, C3 та C4 вплинули на показ-ники стану репродуктивно' функци в шддослщних групах самиць в дозi 2 мг/кг.
Встановлеш достовiрнi змiни тривалосл естраль-ного циклу та окремих його стадш у самиць, як отри-мували С2, С4 та С5 в максимальнiй дозi. 1дентифи кованi в даному експериментi змши, свiдчать про наявнiсть ендокрин дизрапторних властивостей ци-проконазолу.
Вивчаючи заплщнюючу здатнiсть та плодючiсть самиць в дозi 2 мг/кг, зафiксовано зниження шдешв зачаття та фертильностi але вiрогiднi змiни встанов-ленi ттьки при дй C4.
Встановлена для всiх дослiджуваних субстанцiй не дшча доза (NOEL) - 0,2 мг/кг маси тта.
Перспективи подальших дослщжень. Врахову-ючи отриманi результати, подальшi дослiдження з оцiнки репродуктивно' токсичносл триазольного фунгiциду ципроконазолу, полягають в комплекснш оцiнцi 'х впливу на гормональний фон самщв та самиць. Плануеться визначити ктьшсний вм^ чолови чого статевого гормону тестостерону у самщв, тирео-тропного гормону i Т4 у обох статей з метою оцшити ендокрин дизрапторний потенщал ЦИП.
Л1тература
i.
Weston DP, You J, Lydy MJ. Distribution and Toxicity of Sediment-Associated Pesticides in Agriculture-Dominated Water Bodies of California's Central Valley. Environ. Sci. Technol. 2004;38:2753-95.
Shepelskaya NR. Pischevyie kontaminantyi: metodologicheskie podhodyi k izucheniyu ih reproduktivnoy toksichnosti. Problemi harchuvan-nya. 2013;1:59-64. [in Russian].
Mokliachuk LI, Lishchuk AM, Matusevych HD, Melnychuk OP. Ekotoksykolohichni osoblyvosti zastosuvannia kompleksiv suchasnykh herbitsy-div v ahrotekhnolohiiakh vyroshchuvannia zernovykh kultur. Zbalansovane pryrodokorystuvannia. 2015;2:131-5. [in Ukrainian]. Bolognesi C. Genotoxicity of pesticides: A review of human biomonitoring studies. Mutation Research. 2003;543:251-72. Naharashi T, Zhao X, Ikeda T, Nagata K, Yeh JZ. Differential actions of insecticides on target sites: Basis for selective toxicity. Human Experimental Toxicology. 2007;26:361-6.
Boobis AR, Ossendorp BC, Banasiak U, Hamey PY, Sebestyen I, Moretto A. Cumulative risk assessment of pesticide residues in food. Toxicology Letters. 2008;180:137-50.
Bolognesi C, Merlo FD. Pesticides: Human Health Effects. Journal of Herbal Medicine and Toxicology. 2011;438:1-8.
Pelo IM, Bardov VH, Vavrinevych OP, Omelchuk ST, Antonenko AM. Toksykoloho-hihiienichna otsinka bakovykh sumishei pestytsydiv ta vstanovlenniay ikh limituiuchykh komponentiv dlia optymizatsii sanitarnoho nahliadu. Medychna naukaUkrainy. 2015;11(3-4):99-107. [in Ukrainian].
Pestytsydy. Klasyfikatsiia za stupenem nebezpechnosti: DSanPiN 8.8.1.002-98 [Zatv. 28.08.98]. Zb. Vazhlyvykh ofitsiinykh materialiv z sani-tarnykh i protyepidemichnykh pytan. 2000;9(1):249-66. [in Ukrainian].
10. KahanYuS. Obshchaia toksykolohyia pestytsydov. Zdorove; 1981. 174 s. [in Russian].
11. Usenko TV. Problem of assessment of hematotoxicity of pesticides. Medical and Clinical Chemistry. 2018;4:129-37.
12. Nidhi Mathur, Pandey G, Jain GC. Pesticides: a review of the male reproductive toxicity. Journal of Herbal Medicine and Toxicology. 2010;4(1):1-8.
13. Suresh C, Joshi A, Preeti Sharma A. Male reproductive toxicity of organophosphorous compounds: are view. Toxicological & Environmental Chemistry. 2011;93(7):1486-507.
2.
3.
6.
7.
9.
14. Thomas B. Knudsen, Matthew T. Martin, Robert J. Kavlock, Richard S. Judson, David J. Dix, Amar V. Singh. Profiling the activity of environmental
chemicals in prenatal developmental toxicity studies using the U.S. EPA's ToxRefDB. Reproductive Toxicology. 2009;28:209-19.
15. Guide for the care and use of laboratory animals. LAR Publication, National Academy Press; 1996. 140 p.
16. OECD Principles of Good Laboratory Practice. ENV/MC/CHEM(98)17. Environment Directorate Organisation for Economic Cooperation and
Development; 1998. 41 p.
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ГОНАДОТОКСИЧНО1 АКТИВНОСТ1 ЦИПРОКОНАЗОЛУ НА САМЦЯХ I САМИЦЯХ ЩУР1В WISTAR HAN
Колянчук Я. В.
Резюме. Метою даноТ роботи було щентифтувати небезпеку i оцшку ризику гонадо- та репродуктивноТ токсичност впливу п'яти генеричних пестицидiв ципроконазолiв рiзних виробнимв та концентрацш на сам-щв i самиць щурiв Wistar Han та порiвняти отриманi данi. Дiючi речовини ципроконазолу вводились щодня (5 дшв на тиждень), внутрiшньошлунково двом групам тварин, по 20 самцiв та самиць в кожнш, в дозах 0,2 i 2 мг/кг маси тта впродовж 10-11 тижнiв для самщв та 9-10 тижнiв для самиць. ^сля закiнчення експозици дослщжувалися функцiональнi показники стану гонад i здатнiсть тварин до вiдтворення потомства. Досли дження проведенi згiдно рекомендацш комiсiТ бiоетики та стандартних операцшних процедур Центру, роз-роблених у вщповщносл до рекомендацiй та вимог НалежноТ лабораторноТ практики (GLP). Ва п'ять тестових субстaнцiй в максимально дозi 2 мг/кг маси тта володшть репродуктивною токсичнiстю та чинять виражену антиандрогенну дш, що проявляеться в змiнaх морфо-функцiонaльних покaзникiв стану статевих залоз у пщ-дослщних групах сaмцiв та репродуктивних показнимв у самиць. Встановлена не дшча доза (NOEL) по гона-до- та репродуктивнш токсичностi для самщв та самиць щурiв Wistar Han - 0,2 мг/кг маси тта.
Ключовi слова: триазольш фунгiциди, пестициди, репродуктивна токсичшсть, методологiчнi пiдходи.
ИССЛЕДОВАНИЕ ГОНАДОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЦИПРОКОНАЗОЛА НА САМЦАХ И САМКАХ КРЫС WISTAR HAN
Колянчук Я. В.
Резюме. Целью данной работы было идентифицировать опасность и оценку риска гонадо- и репродуктивной токсичности воздействия пяти генерических пестицидов ципроконазол различных производителей и концентраций на самцов и самок крыс Wistar Han и сравнить полученных данные. Действующие вещества ципроконазол вводились ежедневно (5 дней в неделю), внутрижелудочно двум группам животных, по 20 самцов и самок в каждой, в дозах 0,2 и 2 мг/кг массы тела в течение 10-11 недель для самцов и 9-10 недель для самок. После окончания экспозиции исследовались функциональные показатели состоянию гонад и способность животных к воспроизводству потомства. Исследования проведены согласно рекомендациям комиссии биоэтики и стандартных операционных процедур Центра, разработанных в соответствии с рекомендациями и требованиями Надлежащей лабораторной практики (GLP). Все пять тестовых субстанций в максимальной дозе 2 мг/кг массы тела обладают репродуктивной токсичностью и оказывают выраженное антиандрогенное действие, что проявляется в изменениях морфо-функциональных показателей состоянию половых желез у подопытных группах самцов и репродуктивных показателей у самок. Установлена не действующая доза (NOEL) по гонадо- и репродуктивной токсичности для самцов и самок крыс Wistar Han - 0,2 мг/кг массы тела.
Ключевые слова: триазольные фунгициды, пестициды, репродуктивная токсичность, методологические подходы.
THE STUDY OF CYPROCONAZOLE GONADOTOXICITY ON MALE AND FEMALE WISTAR HANNOVER RATS
Kolianchuk Y. V.
Abstract. There are various factors associated with abnormalities of reproductive system, including nutrition, environment, socio-economic status, lifestyle and stress. There is every reason to suppose that pesticides also significantly contribute to reproductive disorders. Therefore, the purpose of this study was to identify the hazard and risk assessment gonado- and reproductive toxicity influenced by five generic pesticides cyproconazole of different manufacturers and in various technical grades on male and female Wistar Han rats and compare the results.
Methods. The active substances of cyproconazole were administered daily by oral gavage for 5 days/week, in two groups of animals, 20 males and females in each, at doses of 0.2 and 2 mg/kg body weight for 10-11 weeks for males and 9-10 weeks for females. Control animals received equivalent amount of vehicle. Intact females, intended for mating, were kept at the same time with control and experimental animals. Functional indicators of gonad state and the animals ability to reproduction were examined after the end of exposure period. The duration and the frequency of each stage of the estrous cycle in female rats and the number of motile sperm, the total amount of sperm and the number of abnormal forms of germ cells of the male rats were studied. The reproductive function state in females was evaluated on day 20th of pregnancy. Thereby the number of corpora lutea in the ovaries, number of alive, dead and resorbed fetuses and embryos, the fetus weight, total weight of litters, the occurrence of malformations. The indices of pairing, conception, fertility, pregnancy, and the length of precoital interval were taken into account were registered. The studies were conducted in accordance with the recommendations of the Bioethics Commission and the standard operating procedures of the Center, within the Good Laboratory Practice (GLP) requirements.
Results. All five test substances in high dose of 2 mg/kg body weight cause reproductive toxicity (antiandrogenic activity), which manifests in the changes of morpho-functional state of the gonads in experimental groups of males
and reproductive parameters in females. In addition, there was adverse influence on males and females fertility, which was assessed by the indexes of conception and fertility.
Conclusions. Comparing the obtained data, it may be concluded that all the test substances does not cause the general toxic effects and not induce any adverse effects on the reproductive function of male and female Wistar Han rats in the low dose 0.2 mg/kg/bw (NOEL).
Key words: triazole fungicides, pesticides, reproductive toxicity, methodological approaches.
Рецензент - проф. Катрушов О. В. Стаття надшшла 06.05.2018 року
DOI 10.29254/2077-4214-2018-2-144-114-117 УДК 633.34:604:543.645.6 1Кулик Я. М., 2Чорнолата Л. П.
НАЯВН1СТЬ НЕПРИРОДНИХ ПЕПТИД1В У Б1ЛКУ БОБ1В ГЕНЕТИЧНО МОДИФ1КОВАНОТ РАУНДАПОСТ1ЙКО'' СОТ 1В1нницький нацюнальний медичний ушверситет iMeHi М. I. Пирогова (м. Вшниця) 21нститут KopMiB та сiльського господарства Подiлля НААН (м. Вшниця)
Зв'язок публшацм з плановими науково-до-слiдними роботами. Дана робота е фрагментом НДР «Вивчити вплив довготривалого згодовування трансгенноУ раундапостшкоУ соУ на вiдтворювальну здатшсть свиней i курей», № державноУ реестрацп 0117U002236.
Вступ. Присутнiсть ГМО в продуктах харчуван-ня пщтверджуеться шляхом виявлення генетичних вставок 3SS, NOS i FMV. Можливо в майбутньому з'являться й iншi векторш системи. При виявленн1 3SS проби провiряються на природну контамiнацiю вiрусом мозаУки цвгноТ капусти з допомогою ПЛР-систем СаММ Крiм цього, ефектившсть видiлення ДНК повинна пщтверджуватися за допомогою ПЛР системи на рослинну ДНК.
Якщо дослiджуванi проби виявилися ГМО-позитивними проводиться щентифтащя i класифи кацiя ГМО, щоб з'ясувати чи дозволений чи ш цей трансгенний органiзм. У Еврош, продукти, що мiстять забороненi ГМО, не дозволен для ввезення в Евросоюз, ^м того ц продукти не можна виробляти i пе-реробляти на територи Европи. Для дозволених ГМО головним е кшьмсне визначення в дiапазонi до 0,9 % у зразках харчових продумчв. Вмiст ГМО в кшькосп копiй ДНК може бути визначена кшьмсно в залеж-ностi вщ рослинноУ матрицi та результати подаються у вiдсотках.
Щодо такоУ оцшки генетично модифтованоУ (ГМ) раундапостшкоУ соУ нами звернута увага на наяв-нiсть неприродних пептидiв у ïï бiлку i, можливий, негативний вплив цих пептидiв на органiзм людини при використаннi такоУ соУ в продуктах харчування. Так, при боротьбi з бур'янами, тобто, обприскуванш ГМ раундапостшкоУ соУ Roundup (глiфосат) впливае на метаболiчний процес шикимовоУ кислоти в рос-линах бур'янiв, блокуючи синтез деяких незамiнних ароматичних амшокислот, зокрема, фенiлаланiну, тирозину i триптофану [1], перед уам у точках росту стебла i кореня [2]. За таких умов блокування синтезу зазначених ароматичних амшокислот стебло рослини засихае. При обприскуванш певна частина гжфосату попадае i на листову поверхню i стебло ГМ соУ. Це фаза бутошзаци. Рослина соУ продовжуе розвиватися i гжфосат не блокуе синтез незамшних ароматичних амшокислот через наявшсть в ÏÏ гене-
тичн1й структур! ферменту 5-енолшруватшикимат-3-фосфатази (EPSPS). Рослина соУ продовжуе р1ст I формуються боби (зерно) з високим ум1стом б1лка. Гл1фосат - це молекула гл1цину з метилфосфошль-ною групою, зв'язаною з атомом азоту. Як аналог гл1-цину вш може мати м1сце в процесах синтезу б1лка соевих боб1в. За таких умов утворюються неприродн1 пептиди в бобах (зерш) ГМ раундапостшкоУ соУ.
Гл1цин, найменша амшокислота, яка мае ушкаль-ш властивост1 та здатн1сть приеднуватися до плазма-тичноУ мембрани або цитоскелету в оргашзм1 людей I тварин. Глибокий анал1з л1тературних джерел ви-явив ряд клас1в б1лк1в, як1 залежать в1д природних (консервативних) залиштв гл1цину для виконання належноУ функцГ''. Зам1на гл1фосатом природних (консервативних) глщишв пояснюе зв'язок 1з д1абе-том, ожиршням, астмою, набряком легень, наднир-ковою недостатн1стю, безпл1ддям та шшими захво-рюваннями [3].
Мета дослщжень. Визначити наявн1сть неприродних пептид1в у б1лку боб1в ГМ раундапостшкоУ соУ пор1вняно з не ГМ соею на здатност1 ароматичних амшокислот (триптофан, тирозин та фешлаланш) по-глинати ультраф1олетове св1тло в д1апазош 280 нм, так як проведеними нами дослщженнями на основ1 реакц1У Паул1 встановлено, що гл1фосат при кип'ятшш вступае у взаемод1ю, тобто, утворюе сполуки з арома-тичними амшокислотами не ГМ соУ I бтьш виражено з такими ж амшокислотами ГМ раундапостшкоУ соУ.
Об'ект i методи дослiджень. Боби (зерно) ГМ раундапост1йкоУ соУ I не ГМ соУ. В один скляний тер-мостшкий стакан пом1щали 2 г др1бно подр1бненоУ на лабораторному млинку ГМ раундапостшкоУ соУ, а в другий такий же стакан 2 г не ГМ соУ. В обидва стакани добавляли по 150 мг дистильованоУ води I кип'ятили впродовж 30 хвилин. Мета кип'ятшня -шактиващя антипоживних речовин I перехщ у вод-ний розчин водорозчинних б1лк1в, пептид1в I вшьних амшокислот. Пкля кип'ятшня в кожний стакан добавляли дистильовану воду до м1тки - 150 мл, тобто добавляли воду, яка випаровувалася при кип'ятшш, а пот1м окремо з кожного стакану вщбирали серед-ню пробу 10 мл водного розчину соУ I добавляли 20 мл 6,0 % розчину трихлороцтовоУ кислоти (ТХО) для осадження б1лк1в I фтьтрували кр1зь паперовий
