CC BY
87
УДК 619:614.31:57.08
дополнительный лабораторный АНАЛИЗ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО НАПРАВЛЕНИЯ: ВЫЯВЛЕНИЕ ТОКСИНОВ И МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЦИФРОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
Поветкин С.Н. - к.в.н; Шантыз А.Х. - к.в.н; Якимов Ю. В.
- зав. производственным отделом; *Родин И.А. - д.в.н., профессор; **Зирук И.В. - к.в.н., доцент; ***Осипчук Г.В. - научный сотрудник лаборатории, ***Вачевский С.С. - к.в.н ГНУ Краснодарский НИВИ Россельхозакадемии * Кубанский государственный аграрный университет ** Саратовский государственный аграрный университет *** НПИ биотехнологий в животноводстве и ветеринарной медицины, Молдова
тел.: 8 (918) 7615190
Ключевые слова: видеозахват, ветеринарно-санитарная экспертиза, Денситометр, токсины, цифровые технологии.
Key words: video capture, veterinary-sanitary examination, Densitometer, toxins, digital technology.
В складывающихся условиях, на современном этапе, требования, предъявляемые в референтной лаборатории к проведению арбитражных лабораторных исследований в зависимости от аттестации доброкачественности продукции имеют несколько уровней сертификации [4,5,6] и зачастую являются очень высокими. Весьма часто возникает необходимость проведения комплексной ветеринарно-санитарной экспертизы (контрольно-надзорной
функции), куда помимо традиционных микробиологических и паразитологических исследований также входят исследования на уровне остаточных количеств на наличие микотоксинов в органах и тканях [1,3].
Не лишним будет отметить, что при использовании оборудования,
уменьшающего значение человеческого фактора, значительно возрастает эффективность используемого метода анализа. Классические методы
микробиологических и токсикологических исследований, используемые в практике ветеринарных лабораторий, практически всегда довольно длительны по времени и нередко требуют больших затрат труда и времени [1,2]. Именно поэтому
использованию аппаратных методов анализа в лабораторной практике во всё большем размере в последние годы уделяется внимание, и они получают всё большее признание.
Материал и методы исследований.
Научно обоснованными, перспективными технологиями и приборами,
удовлетворяющими современным
потребностям ветеринарных лабораторий является использование аппаратов серии Денситометр (Densitometer), в комплект поставки которых для информационной обработки анализируемых пластин входит программное обеспечение для цифровой обработки получаемых с помощью устройств видеозахвата изображений и приборы серии БакТрак (BacTrack), для получения быстрых и надёжных результатов одновременно исследуемых в микробиологическом отношении даже при большом числе образцов, предполагающих использование импедансных технологий.
Согласно современным
представлениям, импеданс - это величина, характеризующая сопротивление потоку переменного тока через проводящий материал; математически является функцией изменения ёмкостного сопротивления при определённой частоте и активной проводимости. Импедансная микробиология, являясь непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов с использованием определения электрического импеданса, представляет собой перспективное направление в исследованиях, поскольку химический состав в питательной среде изменяется в результате роста и метаболической активности
микроорганизмов, и, соответственно, происходит его изменение, регистрируемое приборами.
В процессе жизнедеятельности, исследуемые микроорганизмы, выделяя ферменты, метаболизируют белки до аминокислот, углеводы и жиры - до органических кислот. Образующиеся метаболиты более подвижны, так как имеют меньший размер. Заряженные конечные продукты метаболизма выделяются в ростовую среду и эти электрохимические изменения в ростовой среде приводят к существенному изменению импеданса. При этом субстраты из незаряженных или слабо заряженных превращаются в сильно заряженные конечные продукты, что отражается в регистрируемых величинах.
Величина импеданса в течение времени образует графически кривую, ход кривых импедансного сигнала
соответствует и отражает кривую роста микроорганизмов в исследуемой пробе. Временем определения импеданса (IDT) принято считать переменную величину, необходимую для достижения значимого изменения импеданса. Экспоненциальные изменения импедансного сигнала могут наблюдаться уже в то время, когда количество микроорганизмов достигает порога 106 - 107 микробных клеток в 1 мл субстрата [1,5,6]. Это значение в исследуемой пробе обратно
пропорционально начальной концентрации микроорганизмов.
Хорошо зарекомендовавшим себя, доступным и дешёвым методом количественного и полуколичественного анализа всех классов низкомолекулярных органических соединений, неорганических веществ и высокополимеров является тонкослойная хроматография (ТСХ) -выполняемый с помощью специального оборудования на пластинах, покрытых слоем сорбента. Пластины как в России так и за рубежом выпускаются на полимерной или алюминиевой подложке с нанесённым рабочим слоем фракционированного сорбента толщиной 90-120 мкм, закреплённой специальным связующим компонентом.
На более ранних этапах, когда оценку анализа приходилось делать вручную, это отнимало много времени и часто давало
ошибочные результаты. В настоящее время всё более широко распространяется аппаратный метод денситометрической оценки пластин с анализами.
Электронно-вычислительная машина, соединённая с Денситометром, используя математические алгоритмы, выводит относительную концентрацию и строит график зависимости концентрации как по площади пика, так и по его высоте (интенсивности пятна), с применением общепринятых в тонкослойной
хроматографии показателей, таких, как ЯЪ, 8, Н, причём показатели кривых могут несколько отличаться друг от друга в зависимости от того, какая аппроксимация была выбрана оператором - линейная или квадратичная, по площади или по высоте пика, что повышает точность исследования, и впоследствии, введя значения для стандарта (а в качестве стандарта может быть использовано вещество с различной заранее известной концентрацией), мы, в ряде случаев с лёгкостью получаем абсолютные значения присутствующих в исследуемой пробе веществ с использованием метода внешнего стандарта (методом абсолютной калибровки) [4,5]. В случае невозможности количественного анализа его проводят полуколичественно и продолжают исследования посредством газожидкостной хроматографии или на высокоэффективном жидкостном
хроматографе.
Учитывая достоинства прибора БакТрак, следует пояснить, что он является автоматизированной экспресс - системой для ускоренной количественной и качественной оценки степени
контаминации в микробном отношении продовольственного сырья, пищевых продуктов, косметической и
фармацевтической продукции, питьевой воды и других объектов внешней среды.
Обобщённые результаты всех полученных исследований, в обоих случаях использования названных приборов, обрабатываясь математически, заносятся в таблицу и сводятся в подробный, с красивым интерфейсом протокол (отчёт), что, несомненно, повышает качество лабораторной работы и позволяя более качественно представлять полученные результаты исследований, поднимает авторитет лаборатории как среди клиентов,
так и среди коллег (коллектива) учреждения.
По результатам исследований в представленной статье мы остановимся на описании работы приборов БакТрак марки SY - LAB instruments GMBH. Austria и Денситометра марки Сорбфил, которые мы использовали в комплексной ветеринарно-санитарной экспертизе сырья животного происхождения, где микробиологически исследовалось количество мезофильной, анаэробной, факультативной анаэробной микрофлоры с последующим анализом животного сырья на наличие остаточного количества микотоксинов и количественной оценки кривой импедансного сигнала и калибровочных кривых анализа
видеоизображения хроматограмм с помощью ЭВМ. Следует отметить, что БакТрак и Денситометр обозначенных марок оснащены программным
обеспечением с удобным интерфейсом, которое позволяет как дробно, так и комплексно очень быстро проводить расчёты основных показателей,
характеризующих математическое
выражение функции проводимого анализа.
При некоторых анализах нами была использована щелочная фракция электрохимически активированной воды с рН 11,0 (для усиления роста культур сальмонелл) [1,2,6]. Следует указать, что нами использовались, преимущественно ростовые среды серии BiMedia, но мы в последующем верифицировали опыт в трёхкратной повторности с использованием классической триады Генле-Коха в обычных лабораторных условиях на мясо-пептонном агаре, мясо-пептонном бульоне и последующей биохимической типизацией полученных колоний микроорганизмов с помощью пластин биохимических фирмы НПО «Диагностические системы».
Результаты исследований и их обсуждение. Основанием для описания результатов исследований, приведённых в данной статье мы считали результаты анализа внутренних органов 14 животных, у которых ветеринарно-санитарными
экспертами было выявлено наличие различных видов паразитов гельминтного происхождения, при этом первичный
результат исследований показал, что в жевательных мышцах, взятых от туш говядины в одном из хозяйств, было обнаружено более 3 цистицерков на одном из разрезов, а также микрофлора, отнесённая к представителям
грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, дающая реакцию на цветном ряде сахаров.
В дальнейшем, исследуя в компрессориуме препараты ножек диафрагмы, в каждом срезе в поле зрения микроскопа при использовании объектива х8 было обнаружено до 5 личинок трихинелл, а при микробиологическом исследовании выделена грамположительная микрофлора, ферментирующая сахара, позволяющая по этому признаку типизировать её.
При микробиологических
исследованиях печени, поражённой дикроцелиями, была выявлена помимо грамположительной и грамотрицательной микрофлоры также денситометрическая картина остаточных количеств
микотоксинов (афлатоксин В1, М1, охратоксин, Т-2 токсин, зеараленон), которые в ряде случаев имели концентрацию, превышающую предельно допустимую (ПДК) в десятки раз. Это служит признаком того, что личиночные формы гельминтов могут активно накапливать в себе токсичные метаболиты плесеней и продукты их переработки в животном организме. Последствиями этого (например, при дегельминтизации) может быть их резкое высвобождение.
Выводы. В случаях, когда срочно требуется провести микробиологический анализ, прибор БакТрак может являться в ветеринарно-санитарном обслуживании важным моментом в повышении качества, поскольку использует импедансные технологии. На основании вышесказанного мы считаем целесообразным использовать ТСХ и Денситометр, поскольку они позволяют выявить даже незначительные, остаточные количества микотоксина в исследуемом материале. В анализах, использующих комплексный алгоритм в ветеринарно-санитарной экспертизе, этот момент весьма важен.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Поветкин, С.Н. Сравнительная эффективность бактерицидного действия электрохимически активированных растворов гипохлорита и хлорида натрия и питьевой воды на возбудителей колибактериоза и сальмонеллеза / С.Н. Поветкин., В.И.
Дорофеев // Труды Кубанского государственного аграрного университета.- 2008.- №4 (13).-с.187 - 189. 2. Получение, фармакологические свойства и применение электрохимически активированной воды при эшерихиозах и сальмонеллезе поросят. Поветкин С.Н. диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Кубанский государственный аграрный университет. Краснодар, 2009. 3. Зирук, И.В. Морфология печени подсвинков при добавлении в рацион нового минерального комплекса / И.В. Зирук // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2013. № 4. С. 18-19. 4. Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-бактериологического исследования объектов окружающей среды: Методические рекомендации.- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2005.- 59 с. 5. Морфология и микрофлора толстого отдела кишечника при добавлении в корма подсвинков хелатов / Зирук И.В. // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2014. № 2 (112). С. 103-106. 6. Антитоксическое действие биомассы дрожжевой культуры, обработанной электрохимически активированной водой против афлатоксинов B1 и M1 в кормах для животных Поветкин С.Н., Мирошниченко П.В., Якимов Г.В., Якимов Ю.В., Ольховик Ж.П. Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2010. № 4. С. 103-104.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ЛАБОРАТОРНЫЙ АНАЛИЗ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО НАПРАВЛЕНИЯ: ВЫЯВЛЕНИЕ ТОКСИНОВ И МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ
ЦИФРОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
Поветкин С.Н., Шантыз А.Х., Якимов Ю.В., Родин И.А., Зирук И.В., Осипчук Г.В.,
Вачевский С.С.
Резюме
Представлен обзор возможности применения приборов, подразумевающих применение современных технологий (импедансных, цифровой обработки хроматограмм), а также денситометрии применительно к ветеринарно-санитарной экспертизе. Подход важен как пример комплексного использования методик по освещаемому вопросу.
ADDITIONAL LABORATORY ANALYSIS OF THE VETERINARY SANITARY DIRECTION: IDENTIFICATION OF TOXINS AND MICROORGANISMS WITH APPLICATION OF DIGITAL
TECHNOLOGIES
Povetkin , S.N.,. Shantyz A.Ch, Yakimov Y.V., Rodin I.A., Ziruk I.V., Osipchuk G.V.,
Vachevskiy S.S.
Summary
The review of possibility of use of the devices meaning application of modern technologies (impedance, digital processing chromatogrammes), and also densitometries in relation to veterinary and sanitary examination. Approach is important as an example of complex use of techniques on a taken-up question on concrete examples.
УДК 619:591.1:636.4.087.7
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ В
РАЦИОНАХ ПОРОСЯТ
Резниченко А.А. - аспирант; Денисова Ф.К. - аспирант;
Резниченко Л.В. - профессор; Денисова Н.А. - ст. преподаватель
Белгородская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Я. Горина
e-mail: reznichenko2008@rambler.ru
Ключевые слова: протестим, белки, поросята, незаменимые аминокислоты, приросты, рационы, рыбная мука.
