CC BY
118
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.38:614.2
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ДОНОРОВ АППАРАТНОГО ТРОМБОЦИТАФЕРЕЗА
С.В. Варламова, Н.Н. Калинин, М.О. Егорова, И.В. Грибкова, Е.С. Шурхина, Д.А. Шмаров,
Е.А. Ватагина, В.Н. Мигунов, В.М. Городецкий
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва
Резюме. Исследование посвящено поиску дополнительных критериев оценки состояния здоровья доноров аппаратного тромбоцитафереза (ТЦАФ). Изучено влияние ТЦАФ на биохимический состав крови и эритропоэз, реологию крови с помощью метода распределения эритроцитов по плотности (РЭПП); состояние системы свертывания с использованием метода регистрации эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП). Показано, что у доноров тромбоцитов наблюдается дефицит фолиевой кислоты, сопровождающийся повышением количества гомоцистеина, который предрасполагает к тромбофилии. При исследовании реологии крови методом РЭПП установлено, что повторные процедуры аппаратного ТЦАФ не нарушают барьерные свойства клеточной мембраны эритроцитов. При исследовании гемостаза с определением ЭТП не отмечено существенных сдвигов, а выявленная тенденция к гипокоагуляции на 5,7% после ТЦАФ объясняется введением антикоагулянта. Изучение редукции тромбоцитов после аппаратного ТЦАФ выявило наличие резервных возможностей у доноров (в среднем снижение количества тромбоцитов отмечено до 184,7 ± 7,7 • 109/л), что позволяет повысить эффективность заготовки тромбоцитов за счет увеличения обработки обьема циркулирующей крови. Сделан вывод о том, что при формировании контингента доноров, участвующих в повторных процедурах аппаратного ТЦАФ, необходимо более углубленное их обследование с выявлением скрытых латентных анемических состояний и тромбофилической предрасположенности.
Ключевые слова: доноры;тромбоцитаферез;эритропоэз;гомоцистеин.
ADDITIONAL CRITERIA FOR EVALUATING THE HEALTH STATUS OF DONORS FOR PLATELETAPHERESIS
S.V Varlamova, N.N. Kalinin, M.O. Egorova, I.V. Gribkova, E.S. Shurkhina, D.A. Shmarov, E.A. Vatagina, V.N. Migunov,
V.M. Gorodetsky
Hematology Research Center, Moscow, Russia
Summary. Search for additional criteria for evaluating the health status of donors for plateletapheresis (PA) was carried out. The effects of PA on blood biochemistry, erythropoiesis, and rheology were carried out by Density-specific distribution of erythrocytes (DSDE) method and the clotting system status was evaluated by endogenous thrombin potential (ETP) registration. Platelet donors exhibited folic acid deficit, associated with increase of homocysteine level, associated with liability to thrombophilia. Study of blood rheology by ETP registration showed that repeated PA procedures did not impair the barrier characteristics of erythrocyte membrane. Studies of hemostasis with ETP evaluation showed no appreciable shifts, while the detected trend to hypocoagulation (5.7% decrease) after PA was caused by the anticoagulant. Studies of platelet reduction after PA detected the reserve potentials of donors (platelet counts reduced to 184.7 ± 7.7 • 109/l).
Conclusion. Substantial inspection of donors for repeated PA for identification latent anemias and a thrombophilia is necessary.
Key words: donors; plateletpheresis; erythropoiesis; homocysteine.
Несмотря на 40-летний период применения донорского тромбоцитафереза (ТЦАФ) с использованием сепараторов клеток крови, проблема переносимости этой процедуры и ее влияния на здоровье доноров остается актуальной. Сведений о серьезных побочных реакциях и осложнениях при аппаратном ТЦАФ немного. Цитратные и гипотонические реакции отмечаются в 7% случаев ТЦАФ [1]. Имеются данные [2] о влиянии ТЦАФ на снижение субпопуляций лимфоцитов, преимущественно В-клеток; на развитие железодефицитных состояний, связанных не только с потерями эритроцитов, но и с воздействием на клетки крови центрифугирования и контактом с пластиком системы магистралей; о влиянии цитрата на костный метаболизм с угрозой развития остеопатий у доноров, которым проведено более 100 процедур ТЦАФ.
В последние годы существенно возросла потребность лечебных учреждений в трансфузиях тромбоцитных концентратов (ТК) [3, 4], что обусловлено проведением высо-
Для корреспонденции:
Варламова Светлана Васильевна, кандидат медицинских наук, врач-трансфузиолог отделения донорского и лечебного гемафереза ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России.
Адрес: 125167 Москва, Новый Зыковский пр., д. 4а.
Телефон: +7(495) 656-06-18.
E-mail: SVVarlamova@gmail.com
кодозной терапии заболеваний системы крови. При выборе метода заготовки тромбоцитов необходимо обеспечить не только безопасность доноров, но и безопасность и эффективность заместительной трансфузионной терапии у реципиентов [5, 6]. Изучение влияния на организм донора различных методов заготовки тромбоцитов, исследование компенсаторных возможностей организма и переносимости процедур при повторных и многократных ТЦАФ являются особенно актуальными. Изучение влияния аппаратного ТЦАФ на организм донора, в частности на динамику клеточного состава крови, показатели клеточного и гуморального иммунитета, проводили при апробации сепараторов клеток крови. Были выявлены краткосрочные, долговременные и отсроченные эффекты при изучении данных показателей у доноров тромбоцитов [7—9].
Подходы, направленные на увеличение тромбоцитов в ТК, привели к существенному повышению количества заготовленных доз тромбоцитов. Двойные и тройные терапевтические дозы в Гематологическом научном центре (ГНЦ) Минздрава России (Москва) составили 92%, что является подтверждением эффективности используемых критериев отбора доноров и режимов проведения ТЦАФ с увеличением объема обрабатываемой крови донора до одного объема циркулирующей крови (ОЦК) [10]. Кроме того, исследова-
19
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
ние тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов [11] показало возможность адаптации к временному снижению числа тромбоцитов в виде формирования устойчивого регенераторного ответа за счет «фракции незрелых тромбоцитов», обладающих высокой функциональной активностью.
Исследование динамики иммунохимических показателей является важным критерием в оценке здоровья доноров при их допуске к ТЦАФ. Контроль за изменением уровней иммуноглобулинов и белковым составом фракций, появление ранее отсутствующих отклонений при повторных процедурах ТЦАФ могут говорить о влиянии ТЦАФ на иммунный статус доноров.
С целью оценки показателей гуморального иммунитета у доноров при заготовке компонентов крови выполнен ряд исследований [12, 13] по изучению влияния ТЦАФ на содержание антител к антигенам клеточных стенок условнопатогенных бактерий (УПБ). Авторами этих исследований [12, 13] показано, что антитела к антигенам Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Micrococcus luteus, Salmonella minnesota, Proteus mirabilis обладали большей антигенсвязывающей способностью, чем антитела к антигенам Klebsiella pneumoniae, Staphilococcus saprophiticus, Protens vulgaris. Таким образом, имеются предварительные данные, свидетельствующие о перспективности данного направления исследований.
В настоящее время развернулась острая дискуссия, имеющая прямое отношение к вопросу формирования донорских кадров, принимающих участие в сдаче тромбоцитов. Из-за увеличения процента инфицирования вирусами гепатита доноров, активно участвующих в донорстве (кадровые доноры) и многократно сдающих тромбоциты (доноры тромбоцитов), предлагается постепенно полностью уйти от платного донорства и организовать сдачу тромбоцитов только на безвозмездной основе. Понятно, что эти решения нацелены на обеспечение безопасного донорства аферезных тромбоцитов при максимальной эффективности их заготовки. Отсюда — необходимость проведения расширенного обследования доноров перед началом аппаратного ТЦАФ, особенно повторного. Кроме того, цель настоящей работы состоит в выявлении информативных параметров для мо-ниторирования состояния здоровья доноров тромбоцитов с изучением свертывающей системы крови, динамики показателей гемограммы, биохимического состава крови, гуморального иммунитета при проведении многократных ТЦАФ.
Материалы и методы
Исследование проведено у 93 доноров при выполнении 127 ТЦАФ на аппарате MCS+ («Haemonetics», США). Кадровые доноры аппаратного ТЦАФ являлись здоровыми людьми, которых повторно привлекали к данному виду донорства. Они были отобраны по показателям роста и массы тела и исходным значениям количества тромбоцитов. Все обследованные доноры были мужчины (средний возраст 29,1 ± 8,7 года) со средним ОЦК 5,1 ± 0,5 л. Из 127 ТЦАФ было выполнено 54 ТЦАФ повторно у 20 доноров, из них 7 ТЦАФ проведено 1 донору, 6 ТЦАФ — 1 донору, 5 ТЦАФ — 1 донору, 3 ТЦАФ — 2 донорам, 2 ТЦАФ — 15 донорам. 73 донорам ТЦАФ выполнен однократно.
Заготовку ТК осуществляли на аппарате MCS+ по следующей программе: в среднем проводили 7—8 циклов, обрабатывали 3420,4 ± 315,2 мл крови, использовали до 426,9 ± 38,9 мл консерванта ACD-A, продолжительность процедуры в среднем составляла 91,2 ± 10,4 мин. Объем заготовленного ТК в среднем был 395,9 ± 53,1 мл с концентрацией тромбоцитов 1269,9 ± 313,4 • 109/л, что составило 488,6 ±
31,3 • 109 тромбоцитов в дозе, т. е. в среднем заготавливали от 1 донора 8 доз ТК (одна терапевтическая доза).
Дополнительными критериями по мониторингу анемии у доноров были следующие: определение уровня витамина В12 и фолиевой кислоты, эритропоэтина, сывороточного железа до и после ТЦАФ.
Концентрацию витамина В и фолиевой кислоты сыворотки крови исследовали методом хемилюминесценции с использованием парамагнитных частиц на анализаторе Access 2 Immunoassay System («Beckman Coulter», США). Для получения сыворотки крови использовали пробирки с активатором сгустка («Sarshtedt», Германия).
Определение электролитов в сыворотке крови (калия, ионизированного кальция, натрия, магния), уровня общего белка проводили на биохимическом анализаторе Synchron CX 9 pro («Beckman Coulter», США).
Эритропоэтин определяли иммунохимическим методом на биохимическом анлизаторе Beckman Coulter (США).
Гомоцистеин в сыворотке крови исследовали у доноров иммуноферментным методом.
Проводили исследование распределения эритроцитов по плотности (РЭПП). РЭПП определяли с помощью фталатного метода Данон—Мариковского. Оценивали среднюю плотность эритроцитов ^ср) — усредненный параметр, характеризующий плотность основной популяции эритроцитов (в норме dср = 1,099 ± 0,001 г/мл) и тяжелую фракцию эритроцитов (D) — процент клеток с плотностью более 1,112 г/мл (норма D < 0,6%) [14, 15]. Сопоставляли данные РЭПП доноров до и после ТЦАФ.
Состояние системы свертывания оценивали с помощью метода, называемого тест генерации тромбина. При этом мы использовали такой показатель этого метода, как регистрация эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП), являющийся интегральным тестом, чувствительным как к гипо-, так и к гиперкоагуляционному состоянию. Исследования проводили, используя бедную тромбоцитами плазму доноров. Измерение ЭТП в образцах плазмы, бедных тромбоцитами, проведено по модифицированной методике [16]. Разработанная авторами модификация методики определения генерации тромбина позволяет избежать сильного дополнительного разбавления проб в ходе измерения, что является очень существенным при анализе проб плазмы после гемодилюции. Финальная концентрация медленного флюорогенного субстрата в пробах была увеличена и составляла 400 мкМ. Флюоресценцию образующегося при гидролизе субстрата тромбином 7-амино-4-метилкумарина (АМС) записывали непрерывно на планшетном флюориметриче-ском ридере (Fluoroskanll, «Labsystems», Финляндия) (Хвозб = 380 нМ; X = 440 нМ) в течение 120 мин. Расчет кинетиче-
7 испуск '
ской кривой образования тромбина из полученных величин флюоресценции производили с помощью программы Origin 6.0 («Microcal Software Inc.», США). Сравнивали значения ЭТП, полученные до и после процедуры ТЦАФ, принимая за 100% значение ЭТП до процедуры.
Антигенсвязывающую активность антител определяли у доноров и в ТК с помощью «Тест-системы скрининговой для выявления IgG-антител к антигенам клеточной стенки условно-патогенных бактерий (УПБ) методом ИФА». Для изучения гуморального иммунитета оценена надежность внутреннего контроля апробированных тест-систем. Разработан кандидат для внешнего контроля (лабораторный стандарт иммуноглобулина), полученный в ГНЦ (Москва).
Оценку клеточного состава крови у доноров и подсчет тромбоцитов в ТК осуществляли на гематологическом анализаторе Gen’s («Beckman Coulter», США) с подсчетом
20
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Таблица 1
Цитометрические параметры тромбоцитов периферической крови у доноров до и после ТЦАФ (M ± S)
Иссле- дование Тромбоциты, •109/л Средний объем тромбоцитов, фл Тромбо-крит, % Ширина распределения тромбоцитов, %
До ТЦАФ 273,3 ± 10,4 8,23 ± 0,12 0,23 ± 0,01 15,93 ± 0,08
После ТЦАФ 184,7 ± 7,7 7,71 ± 0,11 0,15 ± 0,01 16 ± 0,09
тромбограммы: PLT — общего количества тромбоцитов, PCT—тромбокрита, MPV—среднего объема тромбоцитов, PDW — ширины распределения тромбоцитов по объему.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Статистическую значимость различий определяли параметрическими методами с помощью t-критерия Стьюдента. Критическая величина уровня значимости была принята равной 0,05.
Результаты и обсуждение
Исследование цитометрических показателей клеток крови у доноров до и после проведения аппаратного ТЦАФ выявило статистически значимое снижение содержания тромбоцитов, тромбокрита, а также среднего объема тромбоцитов (табл. 1). При этом ширина распределения тромбоцитов по объему (гетерогенность тромбоцитов) практически не менялась, а количество тромбоцитов после ТЦАФ оставалось существенно выше допустимого предела (100—150 • 109/л), в среднем 184,7 ± 7,7 • 109/л.
Корреляционный анализ выявил статистически значимую отрицательную корреляцию (г = -0,46; p < 0,05) между тромбоцитами (PLT) и средним объемом тромбоцита (MPV), а также между тромбоцитами и шириной распределения тромбоцитов по объему (PDW, г = -0,47; p < 0,05) у доноров до процедуры ТЦАФ (табл. 2).
После ТЦАФ (табл. 3) корреляционная связь между PLT и MPV не имела статистически значимых различий (p < 0,05) и коэффициент корреляции приобретал положительное значение (г = 0,19); уровень корреляции между PLT и PDW сохранялся (г = -0,43; p < 0,05).
Наряду с умеренным снижением содержания тромбоцитов в периферической крови у доноров после ТЦАФ наблюдалось снижение среднего объема тромбоцитов и изменение соотношения между содержанием тромбоцитов и средним объемом тромбоцита (рис. 1).
Исследование витамина В и фолиевой кислоты у доноров позволяет выявить дефицит этих показателей, который не всегда сопровождается снижением концентрации гемоглобина. Однако дефицит фтолатов может приводить
Таблица 2
Корреляция цитометрических показателей тромбоцитов периферической крови доноров до ТЦАФ
До ТЦАФ Тром- боциты Средний объем тромбоцитов Тром- бокрит Ширина распределения тромбоцитов
Тромбоциты Средний объем тромбоцитов i -0,46 i
Тромбокрит 0,89 -0,11 1
Ширина рас-
пределения тромбоцитов -0,47 0,33 -0,45 1
6 0 100 200 300 400 500
g
Тромбоциты, 10/л
Рис. 1. Зависимость содержания тромбоцитов в периферической крови доноров до (синие ромбы) и после (квадраты) ТЦАФ.
R2 — коэффициент детерминации.
к накоплению гомоцистеина, что в свою очередь является фактором риска развития тромбозов.
Изучение переносимости повторных аппаратных заготовок тромбоцитов оценивали с помощью проведения дополнительных исследований: витамина В , фолиевой кислоты, эритропоэтина, гомоцистеина, электролитного состава крови, концентрации общего белка до и после проведения ТЦАФ.
Биохимическое исследование сыворотки крови показало, что после ТЦАФ происходит статистически значимое снижение концентрации общего белка — на 17% (в среднем до 56,6 ± 0,52 г/л) и концентрации кальция — на 14% (до 2,08 ± 0,02 ммоль/л). В связи с этим для профилактики цитратных реакций после ТЦАФ требуется введение донорам 10% раствора глюконата кальция в количестве 5—10 мл. Снижение концентрации калия и магния было в пределах референсных значений (до 3,77 ± 0,05 и 0,83 ± 0,01 ммоль/л соответственно; табл. 4).
Полученные результаты показали, что у доноров тромбоцитов обнаружен дефицит фолиевой кислоты, концентрация которой в среднем была ниже нормы на 31,3%. После ТЦАФ отмечено нарастание дефицита фолиевой кислоты в среднем на 16,1% (с 4,4 ± 0,2 до 3,7 ± 0,2 нг/мл). Концентрация витамина В до ТЦАФ в среднем находилась на нижней границе нормы, а после ТЦАФ наблюдалось снижение данного параметра на 8% (в среднем до 240,4 ± 9,3 пкг/мл). Было выявлено повышение количества гомоцистеина у доноров, которое составило в среднем 22,8 ± 12,6 мкмоль/л до ТЦАФ и 21,4 ± 9,0 мкмоль/л после ТЦАФ (норма 12 мкмоль/л). Сывороточное железо у доноров в среднем было в пределах референсных значений со снижением после ТЦАФ на 27,7% (табл. 5).
Таблица 3
Корреляция цитометрических показателей тромбоцитов периферической крови доноров после ТЦАФ
После ТЦАФ Тром- боциты Средний объем тромбоцитов Тромбо- крит Ширина распределения тромбоцитов
Тромбоциты Средний объем тромбоцитов i 0,19 1
Тромбокрит 0,85 0,39 1
Ширина рас-
пределения тромбоцитов -0,43 0,24 -0,3 1
21
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Таблица 4
Общий белок и электролиты сыворотки крови у доноров ТЦАФ (M ± S)
Иссле- дова- ние Общий белок, г/л К, ммоль/л Na, ммоль/л Ca, ммоль/л Mg, ммоль/л
Норма 65—85 3,5—5,5 130—145 2,15—2,6 0,7—1,15
До ТЦАФ 68,39±0,59 4,39±0,04 141,58±0,44 2,39±0,02 0,88±0,01
После ТЦАФ 56,59±0,52 3,77±0,05 143,52±0,63 2,08±0,02 0,83±0,01
Для оценки статуса коагуляции до и после процедуры заготовки тромбоцитов использовали метод регистрации ЭТП. Исследование показало, что у большинства доноров наблюдается достоверное (рис. 2, а, б) уменьшение ЭТП после процедуры по сравнению с исходными показателями при анализе данных в парном /-тесте. Однако у 30% из 63 обследованных доноров наблюдается увеличение ЭТП. Максимальное уменьшение ЭТП составило 34%, максимальное увеличение — 30%. В среднем процедура ТЦАФ уменьшает значение ЭТП на 5,7 ± 1,4%. Такое уменьшение можно объяснить добавлением антикоагулянта в процессе процедуры ТЦАФ, что оказывает влияние на свертывающую систему донора.
Исследована зависимость изменения ЭТП после процедуры ТЦАФ от количества заготовленных тромбоцитов.
Таблица 5
Показатели мониторинга анемических состояний у доноров ТЦАФ (M ± S)
Исследо- вание Железо, ммоль/л Фолиевая кислота, нг/мл Эритропоэтин, МЕ/мл Витамин Вп, пкг/мл
Норма 10—26 6,39—16,1 2,59—18,5 180—914
До ТЦАФ 17,7 ± 1,1 4,4 ± 0,2 8,9 ± 0,8 262,7 ± 9,6
После ТЦАФ 12,8 ± 0,8 3,7 ± 0,2 8,4 ± 0,7 240,4 ± 9,3
Критерий Стьюдента 3,54 2,16 0,47 1,67
Р < 0,001 < 0,05 > 0,05 > 0,05
Доноры были разделены на 2 группы: в 1-й группе было заготовлено от 5 до 10 доз тромбоцитов, во 2-й — 11—15 доз. В обеих группах наблюдалось уменьшение ЭТП после процедуры на 6,3 ± 2,9% (n = 11) и на 8,1 ± 3,4% (n = 10) соответственно. Отмечены статистически значимые различия между величинами изменения ЭТП в 1-й и 2-й группах (рис. 2, в, г), полученные при анализе в парном /-тесте.
Таким образом, количество заготовленных у доноров тромбоцитов не влияло на показатели ЭТП после ТЦАФ. Не отмечено существенного изменения ЭТП у доноров при повторных аппаратных заготовках тромбоцитов, показатели которого отклонялись в сторону гипокоагуляции после ТЦАФ в пределах 5,7 ± 1,4%.
а
ЭТП, нМ*мин
с
н
о
2800 -| в
2400200016001200800400 " 5-10 доз (л= 17)
о-'-----------1-----
До
—i—
После
с
н
о
2800240020001600 -1200 -8004000-
г
11-15 доз (л=12)
Р=0,0087 (парный /-тест)
До
После
Рис. 2. Распределение величин эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) в группе доноров тромбоцитов.
а — исходные диаграммы распределения до процедуры тромбоцитафереза (сплошная кривая) и после окончания процедуры (пунктирная кривая); б — распределения ЭТП до и после процедуры в суммарной группе доноров (п = 32); в — распределения ЭТП в группах доноров, где было заготовлено 5—10 доз тромбоцитов (п = 17); г — распределения ЭТП в группах доноров, где было заготовлено 11—15 доз тромбоцитов (п = 12). Размер бокса соответствует области значений, включающей от 25 до 75%о всех измеренных значений. Представлены средние величины (обозначены квадратиком), медианы (горизонтальная пунктирная линия), минимальное и максимальное значения (представлены разбросом вертикальных линий) и область, включающая от 1 до 99% распределения всех возможных значений (представлена звездочками). * p < 0,05 — статистически значимые различия между группами до и после ТЦАФ (парный /-тест).
22
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Потенциальной опасностью ТЦАФ является нарушение свойств мембраны эритроцитов при центрифугировании и контакте с пластиком системы магистралей. В частности, могут нарушиться барьерные свойства мембраны для катионов и привести к увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция, дегидратации клеток и увеличению их плотности. Поскольку циркулирующие в крови эритроциты не являются одинаковыми, а отличаются друг от друга по объему, площади поверхности, содержанию гемоглобина и по многим другим параметрам, при оценке повреждающих воздействий на эритроциты анализируются не отдельные клетки, а распределения эритроцитов по тому или иному параметру.
Возрастные изменения эритроцитов отражает РЭПП. Самые легкие клетки — ретикулоциты с плотностью около 1,086 г/мл превращаются в дискоциты с более высокой плотностью, которые, циркулируя в кровотоке, претерпевают ряд изменений, включающих дегидратацию и потерю поверхности, и превращаются в подлежащие удалению клетки, обладающие увеличенной плотностью и сферичностью. В норме плотность эритроцитов не превышает 1,112 г/мл. При повреждающих мембрану воздействиях в крови появляются дегидратированные клетки с плотностью более 1,112 г/мл [17, 18].
Результаты показали, что в обследованной группе доноров до ТЦАФ dср = 1,1 ± 0,001 г/мл (n = 24), после ТЦАФ средняя плотность эритроцитов стала равна норме — dср = 1,099 ± 0,001 г/мл (n = 24). Тяжелая фракция эритроцитов до ТЦАФ у 50% доноров была в пределах нормы, у остальных доноров (n = 12) — выше нормы (рис. 3).
Поскольку к ТЦАФ допускаются только здоровые доноры, увеличение D может быть вызвано эмоциональным стрессом при ожидании процедуры. Как известно, эмоциональные стрессы усиливают образование свободных радикалов, что приводит к дегидратации эритроцитов и появлению клеток с увеличенной плотностью [19]. После ТЦАФ в аномальной группе тяжелая фракция эритроцитов у 9 доноров уменьшилась, у 1 — не изменилась, у 2 — увеличилась. Если у доноров до ТЦАФ тяжелая фракция эритроцитов была в пределах нормы, то она не возрастала.
Было проведено сравнительное изучение спектра антител к антигенам 14 видов УПБ. Методом ИФА исследованы ТК и образцы сывороток доноров до и после процедуры аппаратного ТЦАФ. Процедура существенно не влияла на антигенсвязывающую активность антител к антигенам УПБ. У 5 доноров отмечена повышенная активность антител до и после процедуры ТЦАФ к антигенам Pseudomonas aeruginosa, к общему антигену грамотрицательных бактерий, Streptococcus pneumoniae и Klebsiella pneumoniae. Отмечена тенденция к снижению антигенсвязывающей активности антител к антигенам Staphylococcus epidermidis (p = 0,07), Streptococcus pneumoniae (p = 0,278), Escherichia coli (p = 0,232), Proteus vulgaris (p = 0,247), Staphylococcus aureus (p = 0,237) после процедуры ТЦАФ. Содержание антител к антигенам Pseudomonas aeruginosa (p = 0,926), Klebsiella pneumoniae (p = 0,700) у доноров и в полученных ТК статистически значимо не изменилось (n = 52). В исследованных ТК наибольшей антигенсвязывающей активностью обладали антитела к антигенам St. aureus и St. pneumoniae (800—2016 ЕД^).
Изучение влияния ТЦАФ на биохимический состав крови и эритропоэз показало, что у доноров тромбоцитов наблюдается дефицит фолиевой кислоты, сопровождающийся повышением количества гомоцистеина, серосодержащей аминокислоты, являющейся промежуточным продуктом
И—1—1—1—1—1—1—1—1—1— Ю ^ СО СМ Т— с У////////////////Ш ш % I 1 р 11 1 11 11
1 ' 2 ' 3 ' 4 ' 5 ' 6 ' 7 ' 8 ' 9 ' 10 ' 11 ' 12
Порядковый номер донора из аномальной группы
D до ТЦФ D после ТЦФ
Рис. 3. Тяжелая фракция эритроцитов у доноров аномальной группы до и после ТЦАФ (норма D < 0,6%).
обмена аминокислот метионина и цистеина. Гомоцистеин, воздействуя на эндотелий сосудов, индуцирует тромбофилию [20, 21]. Единственным источником гомоцистеина в организме является метионин. Потребность человека в гомоцистеине обеспечивается метионином пищи. Важная роль в обмене гомоцистеина принадлежит фолиевой кислоте, а также витаминам В6 и В12. Гипергомоцистеинемия диагностируется в случае превышения концентрации 15 мкмоль/л. К числу факторов, располагающих к повышению концентрации гомоцистеина, относится несбалансированное питание (дефицит витаминов группы В). Опосредованное влияние на концентрацию гомоцистеина в крови может оказывать также курение и алкоголь [22, 23].
Отмеченное снижение концентрации ионизированного кальция ниже референсных значений на 14% после ТЦАФ подтверждает необходимость профилактического введения донорам тромбоцитов глюконата кальция.
Таким образом, расширенный биохимический мониторинг показал необходимость исследования данных параметров с целью выявления возможных отклонений и целесообразность их медикаментозной коррекции.
При исследовании РЭПП установлено, что повторные процедуры аппаратного ТЦАФ не оказывают повреждающего действия на мембрану клеток (эритроцитов) и не приводят к увеличению плотности эритроцитов. Следовательно, в процессе ТЦАФ не нарушаются барьерные свойства клеточной мембраны. Если у доноров до ТЦАФ тяжелая фракция эритроцитов увеличена по сравнению с нормой, то после ТЦАФ в 75% случаев она уменьшается. Увеличение тяжелой фракции эритроцитов может быть связано с активацией свободнорадикальных процессов в крови доноров, испытывающих стресс в процессе процедуры ТЦАФ.
Проведение заготовки тромбоцитов у доноров с помощью сепараторов клеток крови сопряжено с риском развития нарушений в системе свертывания крови. Во время процедуры ТЦАФ на систему гемостаза у доноров воздействуют различные факторы. С момента венопункции в кровь начинают поступать тромбопластические вещества; происходит соприкосновение крови с чужеродной поверхностью в системе магистралей; вводится антикоагулянт (ACD-А); вследствие сбора тромбоцитов происходит их редукция. Это далеко не полный перечень факторов, которые могут влиять на систему гемостаза у доноров.
При исследовании гемостаза с определением ЭТП не отмечено существенных сдвигов, а выявленная тенденция к гипокоагуляции на 5,7% после ТЦАФ объясняется введением антикоагулянта (ACD-A).
Анализ цитометрических показателей клеток крови у доноров до и после проведения аппаратного ТЦАФ выявил
23
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
статистически значимое снижение содержания тромбоцитов с 273,3 ± 10,4 до 184,7 ± 7,7 • 109/л, тромбокрита с 0,23 ± 0,01 до 0,15 ± 0,01%, а также среднего объема тромбоцитов с 8,2 ± 0,12 до 7,7 ± 0,11 фл. При этом ширина распределения тромбоцитов по объему (гетерогенность тромбоцитов) практически не менялась (до ТЦАФ 15,9 ± 0,08%, после — 16 ± 0,09%), что может указывать на адаптированность кроветворения доноров к сдаче тромбоцитов. Изучение редукции тромбоцитов после аппаратного ТЦАФ выявило наличие резервных возможностей у доноров (в среднем количество тромбоцитов снизилось до 184,7 ± 7,7 • 109/л), что позволяет повысить эффективность заготовки тромбоцитов за счет увеличения обработки ОЦК при аппаратном ТЦАФ.
Таким образом, результаты нашего исследования по поиску дополнительных критериев оценки состояния здоровья доноров тромбоцитов как на этапе формирования донорских кадров, так и при повторных процедурах ТЦАФ, позволили выявить наиболее информативные показатели. Установлено, что у доноров тромбоцитов наблюдается дефицит фолиевой кислоты — 31,3%, сопровождающийся повышением количества гомоцистеина в среднем до 22,8 ± 12,6 мкмоль/л, который является фактором риска по тромбофилии. Достоверное снижение ионизированного кальция после ТЦАФ обосновывает необходимость контролирования этого показателя и проведения профилактики цитратных реакций. Выявлены резервные возможности тромбопоэза у доноров (в среднем снижение количества тромбоцитов после ТЦАФ отмечено до 184,7 ± 7,7 • 109/л, при допустимом снижении до 150 • 109/л). Исследование распределения эритроцитов по плотности показало, что повторные процедуры аппаратного ТЦАФ не нарушают барьерные свойства клеточной мембраны эритроцитов, что косвенно указывает на возможность увеличения обработки объема циркулирующей крови до одного ОЦК с целью повышения эффективности заготовки тромбоцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kelley D., Mangini J., lopez-Plaza I., Triulzi D. The utility of 3-day-old whole-blood platelets in reducing the incidence of febrile nonhemolytic transfusion reactions. Transfusion. 2000; 40(4): 439—42.
2. Dettke M., Buchta Ch., Beiglmaier Ch., Kainberger F., MacherM., Hocker P. Effects of citrate anticoagnlation on bone metabolism and bone morphology in plateletapheresis donors. E.S.F.H. 14th Congress of the interdisplinary European society for haemapheresis and hemotherapy. Prage, 10—13 september, 2003; 24.
3. Городецкий В.М., Рыжко В.В., Петров ММ. Современные тенденции в заместительной терапии тромбоцитами. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Материалы научно-практической конференции. Санкт-Петербург, 6—8 июня 2002; 38—45.
4. Селиванов Е.А., Данилова Т.Н., Дегтерева И.Н., Воробей Л.Г., Григорьян М.Ш. Служба крови в России в 2005 г. Трансфузиология. 2006; 3: 4—26.
5. Савченко В.Г., Гармаева Т.Ц., Куликов С.А., Филатов Ф.П., Судариков А.Б., Михайлова Е.А. Эффективность и безопасность трансфузи-онной терапии гематологических больных. Терапевтический архив. 2006; 7: 12—8.
6. Голосова Т.В., Никитин И.К. Гемотрансмиссивные инфекции. М.: Медицинское информационное агентство; 2003: 40—5.
7. Джукаев А.А. Влияние прерывистого тромбоцитафереза на организм донора: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М.; 1997.
8. Козлов А.А., КачаловаН.Д., Простакова ТМ. О медицинском обследовании системы гемостаза у доноров. Новое в трансфузиологии. 2006; вып. 41: 58—70.
9. Лазаренко М.И., Чечеткин А.В., Слащев В.В., Чудаков Е.Б. Некоторые вопросы безопасности доноров и реципиентов. Гематология и трансфузиология. 2007; 3: 52—54.
10. Варламова С.В. Технологические особенности проведения высоко-дозного донорского тромбоцитафереза: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Москва; 2009.
11. Погорелов ВМ., Уфимцева В.Ю., Уртаев БМ., Козинец Г.И. Регенераторный ответ тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов. Вестник службы крови России. 2012; 2: 55—63.
12. Kelly J. Immunotherapy against antibiotic-resistant bacteria: the Russian experience with an antistaphylococcal hyperimmune plasma and immunoglobulin. Microb. Infection. 2000; 2(11): 1383—92.
13. ОрловаМ.Л., Мигунов В.Н., Орлова Г.К. Содержание специфических антител классов G и M к антигенам условно патогенных бактерий в плазме крови доноров. Новое в гематологии и трансфузиологии (Киев). 2006; вып. 5: 69—75.
14. Лисовская И.Л., Шурхина Е.С., Атауллаханов Ф.И., Колодей С.В., Цветаева Н.В. Фильтрационно-осмотический метод оценки распределения эритроцитов по реологическим параметрам. Гематология и трансфузиология. 1999; 3: 20—4.
15. Лисовская И.Л., Шурхина Е.С., Нестеренко ВМ., Розенберг ЮМ., Атауллаханов Ф.И. Определение содержания нефильтрующихся клеток в суспензии эритроцитов. Модификация фильтрационного метода. Биологические мембраны. 1998; 3: 300—8.
16. Синауридзе Е.И., Горбатенко А.С., Грибкова И.В., Сулимов В.Б., Романов А.Н., Кондакова О.А. Гиперкоагуляция, вызванная разбавлением плазмы искусственными плазмозамещающими растворами. Технология живых систем. 2008; 1: 3—14.
17. Shurkhina E.S., Shcherbinina S.P., Kolodey S.V, Ermakova T.A. The influence of emoxipin on the red blood cell density at iron disorders. Biomarkers and Environment. 2001; 4 (Suppl. 1): 4—7.
18. Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Yakovenko E.E., Tsvetaeva N.V., Kolodey S.V, Shcherbinina S.P., Ataullakhanov FI. Distributions of rheological parameters in populations of human erythrocytes. Biorheology. 1999; 36(4): 299—309.
19. Kameneva M.V, Burgreen G.W., Kono K., Repko B., Antaki J.F., Um-ezu M. Effects of turbulent stresses upon mechanical hemolysis: experimental and computational analysis. ASAIO J. 2004; 50(5): 418-423.
20. Ефимов В.С., Цакалоф А.И. Гипергомоцистеинемия в патогенезе тромбоваскулярной болезни и атеротромбоза. Лабораторная медицина. 1999; 2: 44—8.
21. Amitrano L., Guardascione MA., Ames P.R., Margaglione M., Anti-nolfi I., Iannaccone L., et al. Thrombophilic genotypes, natural anticoagulants, and plasma homocysteine in myeloproliferative disorders: relationship with splanchnic vein thrombosis and arterial disease. Am. J. Hematol. 2003; 72(2): 75—81.
22. Шевченко О.П. Гомоцистеин. М.: Реафарм; 2002.
23. Воробьев А.И., Васильев СА., Городецкий ВМ. Гиперкоагуляционный синдром: патогенез, диагностика, лечение. Терапевтический архив. 2002; 7: 73—6.
Поступила 01.08.13
REFERENCES
1. Kelley D., Mangini J., lopez-Plaza I., Triulzi D. The utility of 3-day-old whole-blood platelets in reducing the incidence of febrile nonhemolytic transfusion reactions. Transfusion. 2000; 40(4): 439—42.
2. DettkeM., Buchta Ch., Beiglmaier Ch., KainbergerF., MacherM., Hock-er P. Effects of citrate anticoagnlation on bone metabolism and bone morphology in plateletapheresis donors. E.S.F.H. 14th Congress of the interdisplinary European society for haemapheresis and hemotherapy. Prage, 10—13 sept., 2003; 24.
3. Gorodetskiy VM., Ryzhko VV, Petrov MM. Modern trends in platelet replacement therapy. In: Abstracts conference Topical issues of Hematology and Blood Transfusion (Sovremennye tendentsii v zamestitel’noy terapii trombotsitami. Aktualnye voprosy gematologii i transfuziologii). 6—8 June 2002, St. Petersburg. 2002: 38—45. (in Russian)
4. Selivanov EA., Danilova T.N., Degtereva I.N., Vorobey L.G., Grigorian M.Sh. Blood Service in Russia in 2005 (Sluzhba krovi v Rossii v 2005 g.). Transfusiologiya. 2006; 3: 4—26. (in Russian)
5. Savchenko VG., Garmaeva TTs., Kulikov SA., Filatov F.P., Sudarikov A.B., Mikhailova EA. Efficacy and safety of transfusion therapy of hematological patients (Effektivnost i bezopasnost transfuzionnoy terapii gematologicheskikh bolnykh). Terapevticheskiy arkhiv. 2006; 7: 12—8. (in Russian)
6. Golosova T. V, Nikitin I.K. Bloodborne infections (Gemotransmissivnye in-fektsii). Moskva: Medical Information Agency; 2003: 40—5. (in Russian)
7. Dzhukaev A.A. Effect of intermittent trombocytapheresis donor organism (Vliyanie preryvistogo trombotsitafereza na organizm donora). Dis. Moskva; 1997. (in Russian)
8. Kozlov AA., Kachalova N.D., Prostakova TM. On medical examination of the hemostatic system in donors (O meditsinskom obsledovanii sistemy ge-mostaza u donorov). Novoe v transfuziologii. 2006; 41: 58—70. (in Russian)
9. Lazarenko M.I., Chechetkin A.V, Slashchev VV. Some safety issues of donors and recipients (Nekotorye voprosy bezopasnosti donorov
24
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
i retsipientov). Gematologiya i transfuziologiya. 2007; 3: 52—54. (in Russian)
10. Varlamova S.V. Technological features of the high dose trombocytophere-sis (Tekhnologicheskie osobennosti provedeniya vysokodoznogo donor-skogo trombotsitafereza). Dis. Moskva; 2009. (in Russian)
11. Pogorelov V.M., Ufimtseva VY., Urtaev BM., Kozinets G.I. Regenerative response thrombocytopoiesis platelet donors (Regeneratornyy otvet trombotsitopoeza u donorov trombotsitov). Vestnik sluzhby krovi Rossii. 2012; 2: 55—63. (in Russian)
12. Kelly J. Immunotherapy against antibiotic-resistant bacteria: the Russian experience with an antistaphylococcal hyperimmune plasma and immunoglobulin. Microb. Infection. 2000; 2(11): 1383—92.
13. OrlovaM.L., Migunov V.N., Orlova G.K. The content of specific antibody classes M and G antigens conditionally pathogenic bacteria in the blood plasma of donors. (Soderzhanie spetsificheskikh antitel klassov G i M k antigenam uslovno patogennykh bakteriy v plazme krovi donorov). No-voe v gematologii i transfuziologii. Kiev. 2006; 5: 69—75. (in Ukraina)
14. Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Ataullakhanov F.I, Kolodey S.V, Tsve-taeva N.V Permeability and osmotic method for estimating the distribution of erythrocyte rheological parameters. (Filtratsionno-osmoticheskiy metod otsenki raspredeleniya eritrotsitov po reologicheskim parametram). Gematologiya i transfuziologiya. 1999; 3: 20—4. (in Russian)
15. Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Nesterenko V, Rosenberg JM., Ataullakhanov FI. Determination of infiltrating cells in the suspension of erythrocytes. Modification of the filtration method (Opredelenie soder-zhaniya nefil’truyushchikhsya kletok v suspenzii eritrotsitov. Modifi-katsiya fil’tratsionnogo metoda). Biologicheskie membrany. 1998; 3: 300—8. (in Russian)
16. Sinauridze E.I., Gorbatenko A.S., Gribkova I.V, Sulimov VB., Roma-
nov A.N., Kondakova O.A. Hypercoagulability caused by diluting plasma artificial plasma solutions (Giperkoagulyatsiya, vyzvannaya razbavle-niem plazmy iskusstvennymi plazmozameshchayushchimi rastvorami). Tekhnologiya zhivykh sistem. 2008; 1: 3—14. (in Russian)
17. Shurkhina E.S., Shcherbinina S.P., Kolodey S.V, Ermakova T.A. The influence of emoxipin on the red blood cell density at iron disorders. Biomarkers and Environment. 2001; 4 (Suppl. 1): 4—7.
18. Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Yakovenko E.E., Tsvetaeva N.V, Kolodey S.V, Shcherbinina S.P., Ataullakhanov FI. Distributions of rheological parameters in populations of human erythrocytes. Biorheology. 1999; 36(4): 299—309.
19. Kameneva M.V., Burgreen G.W., Kono K., Repko B., Antaki J.F., Um-ezu M. Effects of turbulent stresses upon mechanical hemolysis: experimental and computational analysis. ASAIO J. 2004; 50(5): 418-423.
20. Efimov VS., Tsakalof A.I. Hyperhomocysteinemia in the pathogenesis of the disease and atherothrombosis thrombovaskular (Gipergomotsis-teinemiya v patogeneze trombovaskulyarnoy bolezni i aterotromboza). Laboratornaya meditsina. 1999; 2: 44—8. (in Russian)
21. Amitrano L., Guardascione M.A., Ames P.R., Margaglione M., Anti-nolfi I.., Iannaccone L., et al. Thrombophilic genotypes, natural anticoagulants, and plasma homocysteine in myeloproliferative disorders: relationship with splanchnic vein thrombosis and arterial disease. Am. J. Hematol. 2003; 72(2): 75—81.
22. Shevchenko O.P. Homocysteine (Gomotsistein). Moskva: Reafarm; 2002. (in Russian)
23. Vorobiev A.I., Vasiliev S.A., Gorodetskiy VM. Hypercoagulable syndrome: pathogenesis, diagnosis and treatment (Giperkoagulyatsionnyi sindrom: patogenez, diagnostika, lechenie). Terapevticheskiy arkhiv. 2002; 7: 73—6. (in Russian)
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.419-007.17-008.6:576.316.7.087
ВЫЯВЛЕНИЕ СКРЫТЫХ АНОМАЛИИ КАРИОТИПА ПРИ МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ
А.В. Кохно, М.А. Пименова, Е.Н. Паровичникова, Е.В. Домрачева, В.Г. Савченко
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России
Резюме. Клональные нарушения кариотипа выявляют примерно у половины больных миелоди-спластическим синдромом (МДС). Кариотип клеток костного мозга является независимым прогностическим фактором, необходимым для стратификации риска и выбора тактики терапии. Однако стандартное цитогенетическое исследование не во всех случаях позволяет получить полную информацию о хромосомных нарушениях у больных МДС. В исследовании показана эффективность применения флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) дополнительно к стандартному кариотипированию в выявлении скрытых аномалий кариотипа при МДС. Приведено клиническое наблюдение больной с изолированной делецией 5q, которую не выявили при стандартном цитогенетическом исследовании.
Ключевые слова: миелодиспластический синдром; скрытые аномалии кариотипа; стандартное цитогенетическое исследование; флюоресцентная in situ гибридизация (FISH); миелодиспластический синдром с изолированной del(5q).
DETECTION OF LATENT KARYOTYPE ABNORMALITIES IN MYELODYSPLASTIC SYNDROME
AV. Kokhno, M.A. Pimenova, E.N. Parovichnikova, E.V. Domracheva, V.G. Savchenko
Hematology Research Center, Moscow, Russia
Summary. Clonal disorders of karyotype are detected in half of patients with the myelodysplastic syndrome (MDS. Bone marrow cell karyotype is an independent prognostic factor for risk stratification and choice of treatment strategy. Conventional cytogenetic analysis (CCA) do not always give complete information about chromosome abnormalities in MDS patients. The efficiency of fluorescent in situ hybridization (FISH) in addition to CCA, detecting latent abnormalities of karyotype in MDS, is demonstrated. A clinical case is presented: a female patent with 5q deletion, which could not be detected by CCA.
Key words: myelodysplastic syndrome; latent karyotype abnormalities; standard cytogenetic studies; fluorescent in situ hybridization (FISH); myelodysplastic syndrome with isolated del(5q).
Цитогенетическое исследование клеток костного мозга входит в перечень обязательных диагностических процедур при установлении диагноза миелодиспластического синдрома (МДС). Хромосомные аномалии выявляют у 40—70% больных первичным МДС и у 70—90% больных с вторич-
ными миелодисплазиями [1—5]. Они являются критерием подтверждения диагноза и необходимы для определения риска трансформации в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Показана роль кариотипа как независимого фактора прогноза при МДС [6, 7].
25
