CC BY
7УДК 612.8
ДОЛГОВРЕМЕННАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ В СИНАПСАХ CA3-CA1 IN VIVO МОЖЕТ БЫТЬ ИНДУЦИРОВАНА С ПОМОЩЬЮ СЕПТАЛЬНЫХ ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ
ВХОДОВ
DOI
Добрякова Ю. В.1, Степаничев М. Ю.1, Маркевич В.А.1, Большаков А. П.1
1 Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия e-mail: julkadobr@gmail.com
Аннотация. Холинергическая модуляция гиппокампальных нейронов критична для процессов обучения, но ее роль остается спорной. Проанализировали индукцию долговременной потенциации при тетанизации вентральной гиппокампальной комиссуры или медиальной септальной области в норме и на фоне дегенерации холинергических нейронов.
Ключевые слова: 192IgG-сапорин, ацетилхолин, длительная потенциа-ция, гиппокамп, медиальная септальная область
Гиппокамп является ключевой структурой, опосредующей механизмы обучения и памяти. Основным источником ацетилхолина (АХ) в гиппокампе являются медиальное септальное ядро и ядра диагональной полоски Брока. Потеря холинергических нейронов приводит к нарушению септо-гиппокампальных холинергических проекций и может влиять на эффективность синаптической передачи в гиппокампе. Однако, роль АХ как фактора, регулирующего долговременную синаптическую потенцтацию (ДП) довольно противоречива. Ранее в экспериментах на срезах гиппокампа показали, что ДП, индуцированная совместной активацией входов stratum radiatum в CA1 и stratum oriens, может быть подавлена антагонистом холинергических рецепторов атропином. В то же время, атропин не влиял на индукцию ДП в stratum oriens [1]. Холинергический дефицит снижал индукцию ДП в синапсах СА1 и зубной извилины (DG) гиппокампа [2; 3], однако селективная дегенерация хо-
линергических нейронов медиальной септальной области (МСО), вызванная иммунотоксином 1921дО-сапорином, не влияла на ДП в срезах гиппокампа [4]. Таким образом, эффект дисфункции холи-нергических нейронов на функционирование глутаматергических синапсов в области СА1 остается спорным.
В нашем исследовании мы использовали альтернативный подход, стимулируя вентральную гиппокампальную комиссуру (ВГК), которая, как известно, включает как холинергические волокна из МСО, так и аксоны нейронов поля СА3 [5]. Кроме того, провели серию экспериментов, в которой индуцировали ДП в гиппокампе тетанизацией МСО [6]. Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы определить, является ли избирательная активация холинергических входов от МСО необходимой для индукции ДП в синапсах CA3-CA1 при различных протоколах стимуляции.
Эксперименты выполнели на половозрелых крысах-самцах Вистар (n = 33, масса тела 250-350 г). Все животные были случайным образом разделены на четыре экспериментальные группы, состоявшие из крыс, которым вводили 1921дО-сапорин (n = 14), и контрольных крыс, которым вводили PBS (n = 19). Электрофизиологическому исследованию предшествовала хирургическая операция. Крысы получали интрасептальные инъекции 1921дО-сапорина или растворителя в МСО (AP + 0,4 мм, L +1,5 мм, 14°). Препарат вводили в дозе 1,5 мкг/на крысу. Электрофизиологические эксперименты проводили через 21 день после операции. Животных анестезировали уретаном (1,75 г/кг массы тела, внутрибрюшинно). Стимулирующий никель-хромовый электрод (диаметр 80 мкм) вживляли в ВГК (AP -1,3 мм, L+1,0 мм, H -3,5 мм). Регистрирующий электрод имплантировали в область СА1 (AP -2,7 мм, L+1,5 мм, H -2,2 мм) [7]. В другой серии регистрирующий электрод помещали в область СА1, а стимулирующие электроды в ВГК и МСО (AP +0,5 мм, L 0,0 мм, H -6,5 мм). Амплитуду вызванных постси-наптических потенциалов (ВПСП) в поле СА1 после стимуляции ВГК (межстимульный интервал 30 мс; время между циклами 20 сек при интенсивности 100-400 мкА) рассчитывали, суммируя 10 последовательных стимулов, и регистрировали каждые 10 мин. Интенсивность тестового парного импульса устанавливали на уровне 40-50% от максимальной амплитуды ВПСП. Базовую активность регистрировали в течение 30 мин. После этого индуцировали ДП в поле СА1, тетанизируя ВГК высокочастотной стимуляцией (5 стимуляций, состоявших из 4 серий по 5 стимулов с частотой 100 Гц
с межстимульным интервалом 200 мс и интервалом между сериями 30 с). Параметры ВГК для индукции ДП в синапсах ВГК-CA! при тетанизации МСО были аналогичными. После электрофизиологического эксперимента проводили иммуногистохимическое исследование для подтверждения гибели холинергических нейронов и анализа морфологии клеток гиппокампа.
В первой серии ДП, индуцировали в синапсах ВГК-CA! с помощью высокочастотной стимуляции ВГК, которая одновременно активирует аксоны, исходящие из МСО и области СА3 гиппокам-па. В эксперименте наблюдали статистически значимый эффект основного воздействия на ответы, вызванные высокочастотной стимуляцией ВГК (F = 7,26, P < 0,05). Амплитуда ВПСП у животных из группы, получавших иммунотоксин 192IgG-сапорин была статистически значимо ниже, чем у крыс, получавших инъекцию растворителя. У крыс без септальной холинергической иннервации тетанизация ВГК не влияла на характеристики ВПСП. Таким образом, ДП, индуцированная одновременной активацией глутаматер-гических аксонов пирамид СА3 и септальных волокон критически зависит от активации септальных холинергических аксонов. Однако, из этих результатов осталось неясным, может ли активация только септальных холинергических нейронов индуцировать ДП в исследуемом синапсе.
Во второй серии экспериментов мы исследовали, влияет ли активация септальных холинергических входов на индукцию ДП в синапсе CA3-CA1. Было обнаружено, что кратковременная стимуляция МСО приводит к потенциации синапсов, образованных ВГК на нейронах области CA1 гиппокампа, и эта потенциация была значительно подавлена у крыс, получавших 192IgG-сапорин. Тетани-зация МСО не привела к существенным изменениям ВПСП. Было установлено, что амплитуда ВПСП у животных, которым вводили 192IgG-сапорин, была статистически значимо ниже по сравнению с исходным значением показателя (F = 19,75, P < 0,01). Мы также проанализировали, как холинергический дефицит влияет на краткосрочную синаптическую пластичность у исследуемых животных. С этой целью были исследованы параметры парной фасилита-ции (PPF) в исходном состоянии и после индукции ДП. Значимого эффекта воздействия иммунотоксина не было выявлено. Однако, было установлено статистически значимое изменение показателя во времени (F = 2,38, P < 0,01) и взаимодействие между факторами «воздействие» и «время» (F = 2,4, P < 0,01). На основании post
hoc анализа мы можем сделать вывод, что у животных из контрольной группы индукция ДП приводила к снижению PPF (P < 0,01), в то время как у крыс, получавших иммунотоксин, PPF не изменилась после индукции ДП. Интересно, что после тетанизации МСО существенных изменений коэффициента PPF не произошло.
В нашем предыдущем исследовании было показано, что ин-трацеребровентрикулярное введенние 1921дО-сапорина может вызвать дегенерацию нейронов СА3 [8]. Для изучения эффекта интра-септального введения 1921дО-сапорина на выживаемость нейронов СА3 было проведено иммуногистохимическое окрашивание срезов гиппокампа с антителами к маркеру нейронов NeuN. Мы обнаружили, что большинство нейронов полей гиппокампа СА1 и СА3 крысы, которым вводили иммунотоксин, имели морфологические признаки, сходные с таковыми в контрольной группе, и плотность клеток достоверно не отличалась от таковой у контрольных крыс. Как и у контрольных крыс, после введения иммунотоксина основные слои клеток гиппокампа имели нормальный вид с хорошо видимыми ядрами, ядрышками и околоядерной цитоплазмой, что дает основания предположить, что интрасептрально введенный 1921дО-сапорин не вызывает гибели клеток гиппокампа.
В этом исследовании мы проанализировали зависимость ДП гиппокампа от активности глутаматергических синапсов и влияние на них септальной холинергической передачи in vivo. Одним из возможных источников противоречий в результатах исследований является то, что размещение стимулирующего электрода непосредственно в гиппокампе (области СА3 или СА1) приводит к комбинированной активации различных сигналов. Для определения специфичности роли ацетилхолиновой сигнальной системы в модуляции синаптической активности необходимо использовать другой подход, а именно активировать только глутаматергические и холинергические синапсы, который мы и применили в нстоящем исследовании. Другой фактор, который может лежать в основе упомянутых споров, — это использование разных протоколов стимуляции глутаматергических входов. Предположительно, различные протоколы стимуляции глутаматергической и холинергической систем в гиппокампе будет индуцировать ДП с разными механизмами, и активация/инактивация холинергической системы может иметь разные эффекты. Угнетение холинергической трансмиссии в гиппокампе с использованием 1921дО-сапорина не влияло на ДП in vivo. Однако, величина ДП, которую индуцировали во время дви-
гательной активности, снижалась и становилась нечувствительной к модуляции холинергической передачи, тогда как величина ДП, которую индуцировали во время бодрствования и иммобилизации, не была подвержена влиянию 192IgG-сапорина [9]. Авторы предположили, что индукция ДП в глутаматергических синапсах гиппокампа может быть опосредована либо АХ-зависимым, либо независимым от АХ механизмом. В наших экспериментах мы выбрали в качестве основного метода индукции ДП стимуляцию ВГК, которая включает волокна нейронов СА3 и волокна, отходящие от МСО [5]. Наши данные ясно показывают, что одновременная высокочастотная стимуляция этих двух типов волокон приводит к ДП. Следует упомянуть, что используемый протокол стимуляции ВГК и сама потенциация не вызывают пластических изменений в синапсах, исходящих из МСО [6]. Одновременная активация аксонов СА3 и септальных входов в гиппокамп в значительной степени индуцируют ДП глутаматергического компонента ВПСП. Основываясь на полученных нами данных, можно заключить, что ДП, индуцированная стимуляцией ВГК, зависит от АХ, поскольку селективная дегенерация холинергических нейронов в МСО предотвращает развитие ДП. Механизм этого пока не ясен, однако мы показали, что этот эффект не связан с гибелью основных нейронов в областях СА1 и СА3 гиппокампа. Эти данные подтверждают результаты нашей второй серии экспериментов, где было показано, что тетанизирующая стимуляция МСО индуцирует ДП синапсах ВГК-CA1, и эта ДП подавляется у крыс, инъецированных 192IgG-сапорином. Ранее показано, что медиальные проекции МСО в гиппокамп имеют холинергический и ГАМКергический компоненты [10], и удаление холинергического компонента препятствовало развитию ДП в наших экспериментах. Следовательно, можно предположить, что холинергический компонент важен для индукции ДП в синапсах ВГК-CA1.
Наши эксперименты показали, что одновременная тетанизация холинергических и глутаматергических волокон, входящих в состав ВГК, продуцирует гораздо более сильную ДП в глутаматергиче-ских синапсах CA3-CA1, чем тетанизирующая стимуляция только МСО. Последнее означает, что АХ-зависимые сигнальные каскады, индуцирующие ДП, должны совпадать по времени с активностью глутаматергических синапсов вызвать более сильные изменения в синапсах глутаматергических СА3 и СА1. При этом совпадение по времени активности глутаматергических и холинергических си-
напсов является критичным для индукции ДП в синапсах, образованных пирамидами CA3 на нейронах CA1.
В исследуемом синапсе PPF уменьшается после высокочастотной стимуляции, что отражает увеличение первого ВПСП без значительных изменений во втором ВПСП. Это снижение PPF отсутствовало у животных с холинергическим дефицитом, что позволяет предположить, что в условиях синхронной активации CA3 гиппо-кампа и холинергических септальных аксонов АХ может регулировать высвобождение глутамата в синапсах CA3-CA1. Согласно предыдущим данным [4], холинергический дефицит, вызванный 192^С-сапорином, приводит к изменению постсинаптического NMDA-компонента глутаматергического ответа в гиппокампе. Однако, в нашем втором протоколе тетанизация медиальной области перегородки не влияла на PPF. Наши результаты расширяют эти выводы и указывают на дополнительные изменения в функционировании пресинаптических компонентов глутаматергической ней-ротрансмиссии после индукции холинергического дефицита.
Список литературы
1. Sokolov M. V., Kleschevnikov A. M. Atropine suppresses associative LTP in the CA1 region of rat hippocampal slices. Brain Res. 1995 Feb 20; 672 (1-2):281-4.
2. Motooka Y., Kondoh T., Nomura T., Tamaki N., Tozaki H., Kan-no T., Nishizaki T. Selective cholinergic denervation inhibits expression of long-term potentiation in the adult but not infant rat hippocampus. Brain Res Dev Brain Res. 2001 Jul 23; 129 (1):119-23.
3. Kanju P. M, Parameshwaran K., Sims-Robinson C., Uthayathas S., Josephson E. M., Rajakumar N., Dhanasekaran M., Suppiramani-am V. Selective cholinergic depletion in medial septum leads to impaired long-term potentiation and glutamatergic synaptic currents in the hippocampus. PLoS One. 2012; 7 (2):e31073.
4. Jouvenceau A., Billard J. M., Lamour Y., Dutar P.. Persistence of CA1 hippocampal LTP after selective cholinergic denervation. Neuroreport. 1996 Mar 22; 7 (4):948-52.
5. Wyss J. M., Swanson L. W., Cowan W. M. The organization of the fimbria, dorsal fornix and ventral hippocampal commissure in the rat. Anat Embryol (Berl). 1980; 158 (3):303-16.
6. Markevich V., Scorsa A. M., Dawe G. S., Stephenson J. D. Cholinergic facilitation and inhibition of long-term potentiation of CA1 in the ure-thane-anaesthetized rats. Brain Res. 1997 Apr 18; 754 (1-2):95-102.
7. Paxinos G., Watson C. (2007) The rat brain in stereotaxic coordinates. Elsevier.
8. Dobryakova Y. V., Volobueva M. N., Manolova A. O., Medvede-va T. M., Kvichansky A. A., Gulyaeva N. V., Markevich V. A., Stepan-ichev M. Y., Bolshakov A. P. Cholinergic Deficit Induced by Central Administration of 192IgG-Saporin Is Associated With Activation of Microglia and Cell Loss in the Dorsal Hippocampus of Rats. Front Neurosci. 2019 Mar 12;13:146.
9. Leung L. S., Shen B., Rajakumar N., Ma J. Cholinergic activity enhances hippocampal long-term potentiation in CA1 during walking in rats. J Neurosci. 2003 Oct 15;. 23 (28):9297-304.
10. Sotty F., Danik M., Manseau F., Laplante F., Quirion R., Williams S. Distinct electrophysiological properties of glutamatergic, cholinergic and GABAergic rat septohippocampal neurons: novel implications for hippocampal rhythmicity. J Physiol. 2003 Sep 15; 551 (Pt 3):927-43.
LONG-TERM POTENTIATION IN THE HIPPOCAMPAL CA3 TO CA1 SYNAPSES MAY BE INDUCED IN VIVO BY ACTIVATION OF SEPTAL CHOLINERGIC INPUTS
Dobryakova Y. V.1, Stepanichev M. Yu.1, Markevich V. A.1, Bolshakov A. P.1
1 Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology RAS, Moscow, Russia
Abstract. Cholinergic modulation of hippocampal neurons is critical for learning processes, but its role remains controversial. We analyzed the induction of long-term potentiation after tetanization of the ventral hippocampal commissure or medial septal region in normal conditions and under the conditions of degeneration of cholinergic neurons.
Key words: 192IgG-saporin, acetylcholine, long-term potentiation, hippocampus, septum, Fepsp.
