CC BY
20УДК 612.821
Волобуева Ю. Е.
ФГБУН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия.
Volobueva U. E.
Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology RAS, Moscow, Russia E-mail: uliana1997—7050@yandex.ru
УЧАСТИЕ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ
В КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ
INVOLVEMENT OF NERVE GROWTH FACTOR IN CORRECTION OF SYNAPTIC PLASTICITY DISORDERS
DOI
Аннотация: Изучение функции холинергической системы в процессах обучения и памяти в норме и при определенных формах патологии относится к числу актуальных направлений нейрофизиологии. В работе проводилось исследование влияния фактора роста нервов на синаптическую пластичность поля СА1 гиппокампа на модели с дегенерацией септальных холинергических нейронов, вызванной имму-нотоксином 192IgG-сапорином.
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера; холинергический дефицит; фактор роста нервов; иммунотоксин 192IgG-сапорин; долговременная потенциация.
Abstract: In this work, we studied the effect of nerve growth factor on the synaptic plasticity of the CA1 field of the hippocampus in a model with degeneration of septal cholinergic neurons caused by the 192IgG-saporin immunotoxin.
Keywords: Alzheimer's disease; cholinergic deficiency; nerve growth factor; immunotoxin 192IgG-saporin; long-term potentiation.
Данные литературы свидетельствуют о том, что активность холинергических нейронов тесно связана с процессами обучения и памяти [1]. Потеря холинергических нейронов, приводящая к дегенерации холинергической системы, является одной из причин патогенеза болезни Альцгеймера (БА) и может быть основной причиной нару-
шения обучения и памяти [1, 2, 3]. Известно, что при БА наблюдается не только потеря холинергических нейронов в базальном переднем мозге, но и потеря холинергической иннервации гиппокампа [2]. В экспериментах холинергическая дисфункция моделируется с помощью введения иммунотоксина 192IgG-сапорина.
Существуют данные, показывающие, что фактор роста нервов (NGF) может оказывать положительное влияние на холинерги-ческую функцию, способствуя выживаемости холинергических нейронов [4]. NGF в гиппокампе экспрессируется интернейронами, поглощается аксонами базальных холинергических нейронов переднего мозга и транспортируется в их тела [5]. В нашей работе мы использовали модель дегенерации септальных холинергических нейронов, вызванную иммунотоксином 192IgG-сапорином, чтобы определить, может ли аппликация NGF на срезы гиппокампа уменьшить последствия холинергического дефицита.
Методика: Эксперименты проводили на 21 половозрелом самцах крыс линии Wistar (200—250 г), полученных из питомника «Пу-щино» филиала ИБХ РАН. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище От каждого животного в электрофизиологических экспериментах использовали от 2 до 4 срезов гиппокампа (n = 14—19/группу). Иммунотоксин 192-SAP (Merck, США) вводили стереотаксически под ингаляционной анестезией изофлюраном непосредственно в область медиального септума (1,5 мкл/животное). В контрольной группе животные получали эквивалентные объемы растворителя фосфатно-солевого буфера (PBS). Введение в медиальную септальную область производили под углом по следующим координатам: AP + 0,4 мм, L — 1,5 мм, 14—15°. Препарат вводили с помощью микроинфузионного насоса (Stoelting Co., США) со скоростью 0,5 мкл/мин. Через 21 день после инъекции подопытное животное декапитировали, извлекали мозг и готовили горизонтальные срезы гиппокампа толщиной 400 мкм с помощью вибратома (Leica Biosystems, Германия) в ледяной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF). Приготовление, инкубация, регистрация фокальных потенциалов (фВПСП) проводилась по стандартным методикам.
Регистрация фВПСП осуществляли в поле СА1 с помощью стеклянного микроэлектрода, заполненного ACSF, со средним сопротивлением 1—5 МОМ. Стимуляцию срезов производили с помощью биполярного электрода (нихромовая проволока, 80 мкм) подведенного к коллатералям Шаффера. ФВПСП регистрировали
в ответ на парные импульсы с межстимульным интервалом 50 мс и частотой тестирования 0,033 Гц. Использовали интенсивность стимула, вызывавшую фВПСП амплитудой 50—60 % от максимума. В эксперименте участвовало три группы животных. Контрольная группа (n=14), с предварительной инъекцией PBS в ACSF, опытная, с предварительной инъекцией иммунотоксина SAP в ACSF (n=19) и группа SAP в ACSF+NGF (n=14), которая была проинкубирована с NGF. Запись проводили в 3 этапа:
1) Запись базовой линии: 40 минут.
2) Инкубация с NGF в дозе 200 нг/мл для группы SAP в ACSF+NGF. Затем запись фВПСП в течение 20 минут.
3) Тетанизацию, вызывавшую длительную потенциацию (ДП) проводили высокочастотной стимуляцией (HFS) (3 последовательности по 1 сек 100 Гц каждая, применяемые с интервалом 20 с), с использованием той же интенсивности стимула, что и для записи базовой линии. После индукции ДП фВПСП регистрировались еще в течение 60 минут.
После декапитации каждого животного извлекали переднюю часть мозга и на вибротоме делали 50 мкм фронтальные срезы медиальной септальной области, для оценки степени гибели холинер-гических нейронов с помощью окрашивания на холинацетилтранс-феразу (ХАТ). После отмывки срезов в растворе PBS, содержащем 0.3 % Triton X100 (Serva, ФРГ) свободно плавающие срезы инкубировали в растворе поликлональных антител кролика к ХАТ (Santa Cruz Biotechnology, США) в разведении 1:500 в течение ночи при 4 °C. На следующий день срезы отмывали в PBS-T и инкубировали с антителами козы к IgG кролика, конъюгированными с биотином (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1: 800. Все антитела разводили в блокирующем растворе, состоявшем из 5 % неиммунной сыворотки козы в PBS-T, при комнатной температуре в течение 1 ч. После дополнительной промывки в PBS срезы инкубировали с комплексом авидин-биотин-HRP (ABC Elite kit, Vector Labs, США) в течение 1 ч. В качестве хромогена применяли 3,3'-диаминобензидин (SIGMA-Fast Kit, Sigma-Aldrich, США). Все изображения были получены с помощью микроскопа Leica DM6000B (Leica Biosystems, Германия). Подсчет клеток проводили на 21 срезах, содержавших медиальное септальное ядро.
Статистическая обработка данных. В качестве основного параметра, описывающего динамику ДП, была выбрана амплитуда фВПСП, измеренная полуавтоматически с помощью программно-
го обеспечения Clampfit 10.2. Полученные данные были усреднены и нормализованы к ответам за последние 10 минут до подачи высокочастотной стимуляции. Статистическая обработика данных производилась с помощью программы Statistica 10 (StatSoft, США). Для оценки достоверности результатов использовался двухфакторный ANOVA-метод с одним межгрупповым (фактор группы) и одним внутригрупповым (повторные изменения) факторами.
Результаты: В ходе анализа влияния NGF на характеристики вызванных ответов поля CA1 гиппокампа было проведено две серии экспериментов. В первой из них выявлено, что аппликация NGF в дозе 200 нг/мл на срезы, полученные от контрольных животных, не оказывает значимого влияния на величину базовой линии и ДП (рис. 1).
Исследование изменений фокальных потенциалов в группах с дегенерацией нейронов в медиальной септальной области выявило значимые межгрупповые отличия по амплитуде ответов фокальных потенциалов поля CA1 гиппокампа. Показано, что амплитуда ДП у животных, получавших инъекции сапорина (1,5 мкл/животное) стабильно снижена по сравнению с контролем на протяжении 60 минут после тетанизазии (F (2,40) =3.3, p<0,05; ANOVA-метод; повторные измерения 0—60 мин (рис. 2). Кроме того, показан значимый эффект времени F (139, 5560)=43.3, p<0,0001) и значимое изменения взаимодействия между факторами F (278,5560)=1.75, p<0,0001). Более детальный Post Hoc анализ выявил, что во всех группах наблюдался значимый прирост амплитуды после тетанизации коллатера-лей Шаффера, однако в группе животных, которым делали инъекции SAP достоверные изменения наблюдались лишь в первые 5 минут. В группе животных с введенным иммунотоксином инкубация срезов в NGF приводила к восстановлению уровня амплитуды фВПСП до контрольных значений.
Иммуногистохимический анализ срезов мозга, проведенный после завершения всех электрофизиологических экспериментов, показал, что инъекции 192IgG-сапорина индуцировали гибель большинства ХАТ-позитивных нейронов в медиальной септальной области. Гибель ХАТ-позитивных клеток в этой области варьировала от 50 до 90 %, соответственно, в среднем на срез медиальной септальной области после инъекции PBS приходилось 94±12,7 клетки, после инъекции SAP — 31±4,8 клеток (F (1, 19)=19,519, p<0.05; ANOVA-ме-тод, однофакторный).
Рис. 1. ВПСП в условиях ДП у крыс контрольной группы (PBS) и группы животных с инъекцией PBS и аппликацией срезов в NGF в дозе 200 нг/мл (PBS +NGF).
Рис. 2. фВПСП в условиях ДП у крыс контрольной группы (PBS), группы животных с инъекцией SAP (SAP) и группы, в которой холинергический дефицит корректировали с помощью NGF (SAP+NGF).
Заключение: Иммуногистохимический анализ срезов мозга показал, что внутрисептальная инъекция иммунотоксина 192IgG-вызывает достоверное снижение количества холинергический нейронов в медиальной септальной области. Возникающий в результате этого холинергический дефицит приводит к ухудшению пластических свойств синаптической связи нейронов поля СА1 — колла-терали Шаффера. NGF способен оказывать положительный эффект на синаптическую передачу в условиях холинергического дефицита в гиппокампе, что согласуются с имеющимися в литературе данными [8], где продемонстрировано протективное действие NGF на ДП в условиях действия бета-амилоида. Это позволяет сделать вывод, что NGF может быть использован в качестве средства для коррекции нарушений, связанных с холинергическим дефицитом.
Список литературы:
1. Michael E. Hasselmo. Neuro modulation and cortical function: modeling the physiological basis of behavior//Behavioural Brain Research — 1995 — Vol. 67 (1) — PP 1—27.
2. BolshakovA. P., Stepanichev M. Y., Dobryakova Y. V., SpivakY. S., Markevich V. A. Saporin from Saponaria officinalis as a Tool for Experimental Research Modeling, and Therapyin Neuroscience.//Toxins -2020 — Vol. 12 (9) — PP 546. doi: 10.3390/12090546.
3. Dobryakova, Y. V., Volobueva, M. N., Manolova, A. O.; Medvedeva, T. M., Kvichansky, A. A., Gulyaeva, N. V.; Markevich, V. A.; Stepanichev, M. Y.; Bolshakov, A. Cholinergic deficit induced by central administration of 192IgG-saporin is associated with activation of microglia and cell loss in the dorsal hippocampus of rats.//Front Neurosci- 2019 — Vol. 13 — PP 146.doi: 10.3389/fnins.2019.00146.
4. Winkler J., Gilbert A. Ramirez, Leon J. Thal and Jerene J. Waite Nerve Growth Factor (NGF) Augments Cortical and Hippocampal Cholinergic Functioning after p75NGF Receptor-Mediated Deafferentation But Impairs Inhibitory Avoidance and Induces Fear-Related Behaviors//J NEUROSCI. — 2000 — Vol. 20 (2) — PP 834— 44. doi: 10.1523/20—02—00834.2000.
5. Seiler M, Schwab ME. Specific retrograde transport of nerve growth factor (NGF) from neocortex to nucleus basalis in the rat.//Brain Res. — 1984 — Vol. 300 (1) — PP 33—9. doi: 10.1016/0006—8993 (84)91338—6..
6. Luca Rosario La Rosaa, Luca Rosario La Rosaa, Carmela Matronea, b, Caterina Ferrainac, Maria Beatrice Panicoc, Silvia PiccirillicMaria
Grazia Di Certoa,, Georgios Strimpakosa, Nicola Biagio Mercuri, Pietro Calissanoa, c, Marcello D'Ameliod, e,1 and Robert Nistic. Age-Related Changes of Hippocampal Synaptic Plasticity in AßPP-Null Mice are Restored by NGF Through p75NTR.//J Alzheimers Dis. — 2013 — Vol. 33 (1) — PP 265—72. doi: 10.3233/JAD-2012—112108
7. Dashiani MG, Kruashvili LB, Rusadze KhZ, Matatradze SB, Beselia GV. Effects of immunotoxic and electrolytic lesions of medial septal area on spatial short-term memory in rats.//Georgian Med News. — 2015 — Vol. (239) — PP 98—103. PMID: 25802458
8. Ivanov AD, Tukhbatova GR, Salozhin SV, Markevich VA. NGF but not BDNF overexpression protects hippocampal LTP from beta-amyloid-induced impairment.//J Neuroscience — 2015 — Vol. 289 — PP 114— 22. doi: 10.1016
УДК 612.821
В. А. Груздева, Ф. Х. Закиров, М. И. Зайченко
ФГБУН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия
V. A. Gruzdeva, F.Kh. Zakirov, M. I. Zaichenko
Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology RAS, Moscow, Russia E-mail: Work.gruzdeva@gmail.com
ВЛИЯНИЕ СОЦИАЛЬНОЙ ИЗОЛЯЦИИ И ОБОГАЩЕННОЙ СРЕДЫ НА ИМПУЛЬСИВНОЕ ПОВЕДЕНИЕ КРЫС С РАННИМ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫМ СТРЕССОМ
EFFECT OF SOCIAL ISOLATION AND ENRICHED ENVIRONMENT ON IMPULSIVE BEHAVIOR IN RATS WITH EARLY PROINFLAMMATORY LIPOPOLYSACCHARIDE
STRESS
DOI
Аннотация: Исследовали влияние условий содержания на импульсивное поведение крыс. Животные, содержавшиеся в обогащен-
