Доклиническое изучение препарата "Бактериосенс", предназначенного для фотодинамической терапии злокачественных новообразований, в том числе рака предстательной железы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

доклиническое изучение препарата «бактериосенс», предназначенного для фотодинамической терапии злокачественных новообразований, в том числе рака предстательной железы

н.Б. морозова1, Е.А. Плотникова1, А.д. Плютинская1, В.О. Страмова1, м.С. Воронцова1, А.А. Панкратов1, Р.И. якубовская1, Е.А. макарова2, Е.А. Лукъянец2, А.д. Каприн1

МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ«НМИЦ радиологии» Минздрава России; Россия, 125284 Москва, 2-й Боткинский проезд, 3; 2ФГУП«Государственный научный центр "НИОПИК"»; Россия, 123001 Москва, ул. Большая Садовая, 1, корп. 4

Контакты: Наталья Борисовна Морозова [email protected]

Введение. Наиболее перспективными фотосенсибилизаторами, поглощающими в ближнем инфракрасном диапазоне спектра, являются бактериохлорины. Их использование позволяет увеличить эффективность фотодинамической терапии за счет более глубокого проникновения излучения в опухоль.

Цель исследования — доклиническое изучение противоопухолевой фотоиндуцированной активности и биораспределения препарата «Бактериосенс».

Материалы и методы. «Бактериосенс» — препарат на основе мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина, поглощающий при 747нм. Фотоиндуцированную цитотоксичность in vitro изучали на опухолевых клетках человека — А549, Hep2, BT-474, MCF- 7, SK-BR-3, РС3, EJ и мыши — S37, C26, LLC. Исследования in vivo проводили на мышах с опухолями S37, LLC, C26, большого и малого размера.

Результаты. В системе in vitro «Бактериосенс» при оптическом облучении приводил к эффективному подавлению роста опухолевых клеток в культуре (величина ИК00 варьировала от 0,08 мкМ до 1,21 мкМ) и характеризовался отсутствием токсичности без воздействия света. Фотодинамическая терапия с «Бактериосенсом» у мышей с инокулированными опухолями (малого и большого размера) различного генеза, проведенная в эффективном режиме, приводила к регрессии первичного опухолевого узла на 90—100 % при отсутствии рецидива опухоли в течение 90 сут после лечения.

Выводы. «Бактериосенс» является перспективным препаратом для фотодинамической терапии опухолей малого и большого размера, может успешно использоваться в качестве альтернативного, органосохраняющего малоинвазивного метода лечения злокачественных новообразований, в том числе рака предстательной железы.

Ключевые слова: «Бактериосенс», фотодинамическая терапия, фотосенсибилизатор, биораспределение, фотоиндуцирован-ная противоопухолевая активность

DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-3-55-64

preclinical trial of bacteriosens used for the photodynamic therapy of malignant tumors, including prostate cancer

N.B. Morozova1, E.A. Plotnikova1, A.D. Plyutinskaya1, V.O. Stramova1, M.S. Vorontsova1, A.A. Pankratov1, R.I. Yakubovskaya1, E.A. Makarova2, E.A. Lukyanets2, A.D. Kaprin1

1P.A. Hertsen Moscow Oncology Research Institute — Branch of the National Medical Research Center of Radiology, Ministry of Health of Russia; 3, 2nd Botkinskiy Proezd, Moscow 125284, Russia; 2State scientific center "NIOPIK"; Bldg 4, 1 Bolshaya Sadovaya St., Moscow 123001, Russia

Introduction. Bacteriochlorins are the most promising photosensitizers absorbing in the near-infrared spectral region. Their use can enhance the efficiency of photodynamic therapy due to the deeper penetration of radiation into the tumor. Objective to conduct a preclinical study of the photoinduced antitumor activity and biodistribution of Bacteriosens. Materials and methods. Bacteriosens is a preparation based on meso-tetra(3-pyridyl)bacteriochlorin absorbing at 747 nm. Photoinduced cytotoxicity was investigated in vitro using human tumor cells: A549, Hep 2, BT-474, MCF-7, SK-BR-3, PC3, and EJ and murine tumor cells: S37, C26, and LLC. In vivo studies were performed in mice with large and small tumors (S37, LLC, and C26). Results. In vitro investigation show that bacteriosens during optical irradiation led to the effective suppression of tumor cell growth in culture (the IC00 value varied from 0,08 ^M to 1,21 ^M) and had no toxicity without exposure to light. The effective photodynamic

56 Оригинальные статьи

therapy regimen using Bacteriosens in mice with inoculated small and large tumors of different genesis resulted in regression of a primary tumor node on 90—100 % of the animals in the absence of tumor recurrence within 90 days after treatment. Conclusion. Bacteriosens is a promising agent for the photodynamic therapy of small and large tumors; it can be successfully used as an alternative, organ-sparing minimally invasive treatment for malignant tumors, including prostate cancer. Keywords: Bacteriosens, photodynamic therapy, photosensitizer, biodistribution, photoinduced antitumor activity Введение ник протопорфирина IX) и «Фотофрин» — 630 нм, В структуре заболеваемости злокачественными Визудин (Вертепорфин) — 689 нм, производные фта-новообразованиями мужского населения России лоцианина — 670—690 нм [9, 13, 14]. в 2016 г. рак предстательной железы (РПЖ) занимает Успешное применение метода ФДТ для лечения 2-е место (14 %) после рака легких (17,6 %). Смерт- злокачественных новообразований, в том числе ность от данного заболевания в 2016 г. в России со- РПЖ, стимулирует поиск новых ФС с поглощением ставила 7,9 % [1]. Высокий уровень заболеваемости в длинноволновой области спектра. Наиболее пер-РПЖ является общемировой тенденцией. спективными для ФДТ являются ФС с максимумом Основные способы лечения РПЖ — хирургиче- поглощения в дальнем красном и ближнем инфра-ский метод, химиотерапия, гормональная, лучевая красном диапазонах (700—850 нм), так называемом терапия, а также комбинированное лечение [2—6]. «терапевтическом окне», где собственное поглоще-У каждого из них есть достоинства, недостатки ние биологической ткани минимально. Это обеспе-и ограничения. Одна из наиболее сложных про- чивает возможность более глубокого проникновения блем — реабилитация онкологических больных после излучения в ткань и, как следствие, высокую эффек-проведенного радикального лечения. В настоящее тивность противоопухолевой терапии [14—17]. время среди возможных вариантов лечения локали- Наиболее перспективными ФС для ФДТ, погло-зованного рака предстательной железы все большее щающими в ближнем инфракрасном диапазоне значение приобретают малоинвазивные методики спектра, являются бактериохлорины. Использование локальной терапии, такие как ультразвуковая и ра- бактериохлоринов, имеющих интенсивное поглоще-диочастотная аблация, брахитерапия, криотерапия ние в интервале 720—800 нм, позволяет увеличить и фотодинамическая терапия (ФДТ) [7—9]. эффективность ФДТ за счет более глубокого проник-В последние десятилетия ФДТ показала свою новения излучения в опухоль. Однако многие из них перспективность при лечении опухолей различных имеют ограниченное применение из-за низкой хи-локализаций, в том числе РПЖ. Основными преи- мической стабильности, фотостабильности и высо-муществами ФДТ перед общепринятыми методами кой гидрофобности, что требует поиска транспортных лечения злокачественных новообразований являют- систем, эффективно доставляющих ФС к опухолевой ся избирательность, отсутствие риска хирургическо- ткани [9, 13]. Целью данного исследования стало го вмешательства и тяжелых системных осложнений, изучение специфической фотоиндуцированной ак-допустимость многократного повторения, сочетание тивности нового препарата «Бактериосенс» (на ос-в одной процедуре флуоресцентной диагностики и ле- нове синтетического производного бактериохлори-чебного воздействия, низкая стоимость лечения [10]. на) в системе in vitro и in vivo c использованием Фотодинамическая терапия — методика лечения опухолевых моделей различного гистогенеза и РПЖ. рака, основанная на взаимодействии света, фотосенсибилизатора (ФС) и кислорода. При возбуждении Материалы и методы ФС светом определенной длины волны, соответству- Фотосенсибилизатор ющей максимуму его поглощения, в ткани при на- Препарат «Бактериосенс» — лиофилизат для приличии кислорода образуются радикалы, которые готовления раствора для инфузий производства обладают большой химической активностью и ини- ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»» (Россия). Активный ком-циируют свободнорадикальные реакции, приводя- понент (мезо-тетра(З-пиридил)бактериохлорин) [18]. щие к гибели опухолевых клеток и ткани [10—12]. В качестве растворителя используется 0,025 % рас-Фотодинамическая терапия может применяться твор гидрокарбоната натрия (NaHCO3) — Xmax = 747 нм. как малоинвазивная терапия при лечении РПЖ с ис- Для исследований in vitro и in vivo раствор препарата пользованием различных ФС, находящихся на раз- готовили ex tempore. ных стадиях клинических испытаний: «Фоскан» (mTHPC) с длиной волны возбуждения 652 нм, Исследования in vitro TOOKAD (WST09 и WST11) — 763 нм, MOTEXAFIN Изучение фотоиндуцированной активности пре-LUTETIUM (MLu) — 732 нм, аминолевулиновая парата «Бактериосенс» проводили на опухолевых кислота (5-ALA) (как пролекарство — предшествен- клетках человека эпителиального происхождения

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 3'2018 том 17 | vol. 17

(предстательной железы: аденоакарцинома (РС3) карцинома (LnCap4); легкого: карцинома (А549) гортаноглотки: эпидермоидная карцинома (Hep2) молочной железы: карцинома (BT-474); аденокар-цинома (MCF-7), аденокарцинома (SK-BR-3); мочевого пузыря: карцинома (EJ); толстой кишки: карцинома (HT-29)) и опухолевых клетках мыши различного генеза (саркомы мягких тканей (S37), аденокарцино-мы толстой кишки (C26), карциномы легкого Льюис (LLC)), адаптированных нами для роста в культуре in vitro.

Культивирование опухолевых клеток in vitro проводилось согласно рекомендациям, указанным в сертификате культуры клеток с использованием соответствующих сред с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) [19, 20]. Пассирование клеток проводилось при 37 °С во влажной атмосфере с содержанием 5 % СО2 (стандартные условия).

Методика проведения фотодинамического

воздействия на опухолевые клетки

Для оценки фотоиндуцированной активности «Бактериосенса» клетки рассевались в 96-луночные культуральные планшеты, инкубировались в течение 28 ч в стандартных условиях. Посевная концентрация клеток устанавливалась для каждой культуры с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносился ФС при варьировании концентрации от 0,002 до 2,4 мкМ (в триплетах) и проводилось облучение галогеновой лампой с использованием широкополосного фильтра КС-19 (X >720 нм). Плотность мощности составляла 21,0 ± 1,0 мВт/см2, а световая доза — 10 Дж/см2. Выбранный

временной интервал инкубации — 30 мин, 1, 2, 4 и 6 ч. Облучение проводили в 2 модификациях: с удалением препарата из среды инкубации и без удаления ФС. После воздействия светом клетки инкубировались в стандартных условиях 24—28 ч. Оценка выживаемости клеток проводилась визуально и колориметрическим методом с использованием МТТ-теста [21]. Критериями оценки цитотоксического эффекта являлись величины ИК50 и ИК90, т. е. концентрации лекарственного средства, вызывающие торможение роста клеток на 50 и 90 %.

Исследования in vivo

Животные. Исследования проводили на мышах в возрасте 7—10 нед (табл. 1).

Животные находились на стандартной сбалансированной диете с использованием экструдированно-го комбикорма для содержания мелких лабораторных грызунов SPF категории «ЧАРА» компании ЗАО «Ассортимент-Агро» и водопроводной воды, фильтрованной путем системы обратного осмоса Osmos-StreamCompact OD 200.

Исследования были одобрены комиссией по биоэтике и проведены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с национальными стандартами. Опухолевый материал прививали мышам подкожно с внешней стороны бедра (при необходимости предварительно удаляли шерстный покров с помощью крема-депилятора).

изучение биораспределения и флуоресцентной контрастности. Оценку распределения «Бактериосенса» в опухолевой (S37, LLC, C26, Ca755, РС3) и окружающей ткани (кожа) проводили по уровню нормированной флуоресценции, отражающей накопление

таблица 1. Характеристика опухолевъа моделей и используемъх животнъх

опухолевая модель (аббревиатура) мыши источник получения животных Содержание жи-

линия пол вотных

Перевивные опухоли

Саркома мягких тканей (S37) Гибриды 1-го поколения Fj (CBA х C57B1/6J) Самки Научный центр биомедицинских технологий РАМН (филиал НЦБТ «Андреевка») Конвенциональные условия

Карцинома легкого Льюис (LLC) Аденокарцинома молочной железы (Са755) C57B1/6J Самки НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН (Пущино) SPF

клеточные линии

Аденокарцинома толстой кишки мыши (С26) BALB/c Самки Научный центр биомедицинских технологий РАМН (филиал НЦБТ «Андреевка») Конвенциональные условия

Аденокарцинома предстательной железы человека (РС3) BALB/c Nude (nu/nu) Самцы НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН (Пущино) SPF

58 Оригинальные статьи

фотоактивной формы препарата, методом локальной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС) ex vivo, на лазерной установке для флуоресцентной диагностики и контроля ФДТ «ЛЭСА 6» («БИОСПЕК», Россия). Препарат вводили внутривенно в дозах 1, 2,5 и 6,25 мг/кг. Через различные интервалы времени (5 мин — 24 ч) после введения ФС мышей умерщвляли дислокацией шейных позвонков, извлекали опухолевый узел, окружающую кожу и ex vivo регистрировали флуоресценцию в спектральном диапазоне 640—850 нм.

Интегральную интенсивность флуоресценции, соответствующую максимуму флуоресценции «Бак-териосенса» (X = 747 нм), полученную при анализе образцов ткани, нормировали на интегральную интенсивность сигнала обратного диффузного рассеяния возбуждающего лазерного излучения (633 нм) и таким образом определяли нормированную флуоресценцию (ФН) в тканях. Величину флуоресцентной контрастности (ФК) рассчитывали как отношение средней величины ФН в опухоли к средней величине ФН в коже.

изучение фотоиндуцированной противоопухолевой активности. Эффективность противоопухолевого действия ФДТ с «Бактериосенсом» оценивали у мышей с опухолями малого размера 130 ± 30 мм3 (S37) — 6-7-й день роста опухоли, среднего размера 230 ± 30 мм3 (РС3) — 9-10-й день роста опухоли и большого размера 400 ± 40 мм3 (S37, LLC, C26, Ca755) -12-14-й день роста опухоли. В качестве анестезии применяли дроперидол (2,5 мг/мл) внутрибрюшин-но за 10-15 мин до сеанса ФДТ. Для облучения использовали светодиодный источник излучения с X = 752 ± 14 нм (экспериментальный образец, разработанный в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»», с регулятором плотности мощности светового излучения 30150 мВт/см2).

С целью отработки эффективных режимов проведения ФДТ с «Бактериосенсом» варьировали дозу препарата (0,5-7,5 мг/кг), интервал времени между его введением и облучением (5 мин - 24 ч), дозу света (60-180 Дж/см2) у мышей с саркомой S37. При лечении опухолей большого размера (S37, LLC, C26, Ca755) варьировали количество полей облучения (одно- и полипозиционный режимы, суммарная световая доза 270 Дж/см2).

Эффективность ФДТ оценивали по общепринятым в экспериментальной онкологии критериям в процентах: торможению роста опухоли (ТРО), увеличению продолжительности жизни (УПЖ) и критерию излеченности (КИ) животных [21]. Биологически значимым терапевтическим эффектом считали ТРО >70 %, УПЖ 50 %, КИ >25 %. Для статистической оценки различий между группами применяли U-критерий Манна-Уитни, расчеты проводили с использованием программы Primer of Biostatistics

версии 4.03. Отличия считали достоверными при уровне значимостир <0,05.

Результаты и их обсуждение

Исследования in vitro

В биологических тестах in vitro установлено, что препарат «Бактериосенс» в диапазоне концентраций от 0,002 до 2,4 мкМ не обладал темновой цито-токсичностью относительно культур опухолевых клеток человека РС3, LnCap4, А549, HEp2, BT-474, MCF-7, SK-BK-3, EJ и HT-29 и мыши S-37, C26 и LLC (табл. 2). При воздействии светом препарат проявлял высокую специфическую активность в системе in vitro (величина ИК50, при оптимальном времени инкубации, варьировала от 0,08 до 1,21 мкМ в зависимости от культуры клеток).

Показано, что максимальная фотоиндуциро-ванная активность «Бактериосенса» для культуры S37 отмечена при 4 ч инкубации до воздействия, для всех остальных клеточных линий максимальный эффект при фотодинамическом воздействии достигался при 2-часовом инкубировании, и с увеличением времени до 6 ч разница в значении величины ИК50 была статистически незначимой. Данные опытов с удалением препарата из среды культивирования косвенно свидетельствуют о том, что «Бактериосенс» эффективно

таблица 2. Фотоиндуцированная активность препарата «Бакте-риосенс» (ИК5, мкМ) относительно опухолевых клеток человека и мыши (при оптимальном времени инкубации до воздействия)

клеточная линия ик50, мкм

облучение при наличии фотосенсибилизатора в среде инкубации облучение с удалением фотосенсибилизатора из среды инкубации

культуры опухолевых клеток человека

PC3 0,28 ± 0,01 0,38 ± 0,02

LnCap4 0,29 ± 0,02 0,37 ± 0,01

А549 0,32 ± 0,02 0,47 ± 0,01

HEp2 0,24 ± 0,01 0,26 ± 0,02

BT-474 0,30 ± 0,02 0,52 ± 0,02

MCF-7 0,31 ± 0,01 1,21 ± 0,02

SK-BR-3 0,22 ± 0,02 0,23 ± 0,02

EJ 0,25 ± 0,02 0,26 ± 0,02

HT-29 0,39 ± 0,01 0,91 ± 0,03

культуры опухолевых клеток мыши

S37 0,08 ± 0,01 0,13 ± 0,01

C26 0,08 ± 0,01 0,13 ± 0,01

LLC 0,12 ± 0,01 0,32 ± 0,01

проникает в опухолевые клетки и накапливается в них в течение определенного временного интервала, при этом накопление препарата в клетках культур MCF-7, HT-29 и LLC было менее выражено.

Таким образом, изучение специфической активности препарата «Бактериосенс» в системе in vitro показало его высокую фотоиндуцированную активность относительно опухолевых клеток различного генеза, в частности клеток предстательной железы (PC-3, LNCaP), при отсутствии темновой токсичности и эффективном проникновении внутрь клеток как человека, так и мыши.

Исследования in vivo

Изучение распределения препарата «Бактериосенс» у мышей с опухолями различного генеза. Распределение препарата в опухоли (S37, LLC, С26, Са755, РС3) и окружающей коже оценивали методом ЛФС в интервале от 5 мин до 24 ч по нормированной флуоресценции «Бактериосенса», отражающей уровень его накопления в тканях животных.

Показано, что «Бактериосенс» дозозависимо накапливался в опухолевой и окружающей ткани (кожа) независимо от используемых опухолевых моделей. Нормированная флуоресценция препарата мгновенно регистрировалась в опухолевой ткани, достигая высоких значений уже через 30 мин после введения, и сохранялась на максимальном уровне до 4 ч. На рисунке представлены ФН и ФК «Бактериосенса» в дозе 2,5 мг/кг (терапевтическая доза (ТД)).

Максимальные значения ФН в опухолевой ткани для препарата в ТД 2,5 мг/кг регистрировались в интервале от 0,5 до 4 ч и составляли 5,4—10,4 у. е. С увеличением дозы препарата уровень ФН как в опухолях, так и окружающей ткани увеличивался. Максимальный уровень ФН ФС в окружающей коже у мышей с опухолями регистрировался чрез 2—4 ч после введения и составлял 2,3—3,9 у. е.

Экспериментальные данные по максимальной нормированной флуоресценции в опухолях и флуоресцентной контрастности относительно кожи представлены в табл. 3.

Биораспределение препарата «Бактериосенс» в опухолях различного гистогенеза имеют схожие характеристики. Значения максимальной нормированной флуоресценции препарата в опухолях LLC, S37, С26, Са755 и РС3 независимо от дозы регистрировались на ранние сроки после введения — через 0,5—4 ч. Причем наиболее высокий уровень ФН регистрировался в аденокарциноме предстательной железы РС3 на всех сроках наблюдения.

Для всех исследованных опухолей максимальная ФК относительно кожи регистрировалась через 5—60 мин после введения препарата независимо от его дозы и варьировала от 1,9 до 4,5 у. е.

Таким образом, исследования, проведенные с «Бактериосенсом», показали, что препарат мгновенно накапливался в тканях опухолей LLC, S37, С26, Са755 и РС3, достигая максимальных значений уже через 30 мин после введения, и сохранялся до 4 ч. С увеличением дозы препарата нормированная флуоресценция в опухолевой ткани увеличивалась. Максимальная флуоресцентная контрастность относительно кожи регистрировалась через 5—60 мин после введения. В связи с этим при ФДТ рекомендуется проводить облучение на ранние сроки после введения препарата (0,5—4 ч).

Определение оптимального терапевтического режима ФДТ. Поскольку эффективность ФДТ зависит от ряда параметров, оценку оптимального терапевтического режима ФДТ проводили у мышей с опухолью S37 (как наиболее экономичной и доступной модели) малого размера (130 ± 30 мм3) в зависимости от дозы «Бактериосенса» (0,5—7,5 мг/кг); при облучении как в период накопления ФС в опухолевой ткани — через 15—30 мин после введения препарата, так и через 2 ч — в период полувыведения ФС; в зависимости от дозы света (90—270 Дж/см2) и количества полей облучения (1—3 поля) опухолей большого

Таблица 3. Сравнительная оценка биораспределения препарата «Бактериосенс» в опухолях различного генеза

опухолевая модель Доза препарата, мг/кг Максимальная нормированная флуоресценция в опухоли, у. е., через 0,5-4 ч Максимальная флуоресцентная контрастность, опухоль/кожа, у. е., через 5-60 мин

LLC 5,4-6,6 2,7-3,1

S37 3,6-4,0 2,1-2,8

С26 1,0 3,9-5,2 2,3-3,1

Са755 5,0-6,2 2,5-3,1

РС3 6,2-7,3 2,6-3,0

LLC 6,9-8,5 2,9-3,2

S37 2,5 (тера-певти- 4,6-5,4 2,1-2,3

С26 5,7-6,9 3,2-3,9

Са755 ческая доза) 7,2-8,5 1,9-3,0

рС3 8,4-10,4 2,2-3,3

LLC 10,6-12,2 2,7-3,9

S37 7,7-9,5 2,5-3,1

С26 6,25 7,2-9,0 2,6-4,5

Са755 8,0-10,6 2,7-2,9

рС3 9,3-13,0 2,6-3,4

Примечание. Данные представлены с учетом фоновых значений нормированной флуоресценции в опухоли.

60 Оригинальные статьи

размера (400 ± 40 мм3). Результаты исследований представлены в табл. 4, 5.

Через 2 ч после проведенного облучения у животных в зоне роста опухоли начинал развиваться отек, который сохранялся от 3 до 7 сут в зависимости от использованных режимов проведения ФДТ.

Фотоиндуцированная противоопухолевая активность «Бактериосенса» при облучении через 30 мин после его введения и фиксированной плотности энергии 150 Дж/см2 с увеличением дозы от 0,5 до 7,5 мг/кг возрастала; ТРО составляло 13—66 % (0,5 мг/кг), 69-97 % (1,0 мг/кг) и 100 % (2,5; 5,0 и 7,5 мг/кг).

12

10

ш ü

о ^

с

-е-

ü о X

б

0 0

—I-1-1-1-1-1-Г"

5 10 15 20

Время после введения, ч

25

12

10

е р

о

л

-

р о

х

8 -

6 -

4 -

2

-о

-1-1-1-1-1-1-1-1-г-

5 10 15 20 25

Время после введения, ч

12

е

>, 10-1

8

е р

о

л

-

6 -

4

2

р о

х

т-1-1-1-1-1-Г"

5 10 15 20

Время после введения, ч

25

12

10

8

е р

о

л

-

р о

х

6 -

4

2

-1-1-1-1-1-1-1-Г"

5 10 15 20 25

Время после введения, ч

р о

л

-

р о

х

12

10

8

6 -

4

2

5 10 15

Время после введения, ч

20

25

Нормированная флуоресценция в опухолевой ткани $1), в коже (О) и флуоресцентная контрастность ФК = ФНопухоль/ ФНкожа (А) «Бактериосенса» в терапевтической дозе 2,5 мг/кг у мышей с опухолями различного генеза: S37 (а), LLC (б), C26 (в), Са755 (г), РС3 (д)

а

8

6

4

2

0

в

г

0

0

д

0

Таблица 4. Фотоиндуцированная противоопухолевая активность «Бактериосенса» у мышей с саркомой S37 малого размера в зависимости от интервала между введением препарата и облучением, дозы препарата и плотности энергии

Режим фотодинамической терапии Торможение роста опухоли, %, после фотодинамической терапии, сут Увеличение про- Критерий излеченности*, % Гибель

доза, мг/кг Плотность энергии, Дж/см2 должительности от фототоксич-

Интервал М 9 12 14 16 19 жизни*, % ности**, %

0,5 66 21 19 13 23 6 0 0

1,0 97 77 73 69 73 63 50 0

2,5 30 мин 100 100 100 100 100 >100 75 25

5,0 100 100 100 100 100 >100 63 37

7,5 150 100 100 100 100 100 >100 25 75

5 мин Гибель от фототоксичности 0 0 100

30 мин 100 100 100 100 100 >100 75 25

2 ч 100 100 100 100 100 >100 100 0

4 ч 62 53 49 56 41 34 0 0

2,5 24 ч 31 24 21 19 15 13 0 0

60 91 87 84 83 80 52 63 0

90 100 98 92 91 84 59 63 0

30 мин 120 100 100 100 100 100 >100 100 0

150 100 100 100 99 99 61 75 0

180 92 80 77 76 74 62 50 0

Примечание. Светодиодный источник оптического излучения 752 ± 14 нм. *Оценены в течение 75 сут после фотодинамической терапии; **В течение 1—3 сут после фотодинамической терапии.

Таблица 5. Фотоиндуцированная противоопухолевая активность бактериосенса в терапевтической дозе 2,5 мг/кг у мышей с саркомой S37 большого размера в зависимости от количества полей облучения

режим фотодинамической терапии Торможение роста опухоли, %, после фотодинамической терапии, сут Увеличение про- Критерий

суммарная плотность энергии, Дж/см2 количество полей облучения должительности жизни*, % излеченно-сти*, %

интервал М 9 12 14 16 19

15 мин 100 100 99 97 96 64 38

270 3 30 мин 100 100 100 100 100 43 38

1 ч 97 88 87 87 77 43 25

1 30 мин 100 100 99 99 99 47 25

Примечание. Светодиодный источник оптического излучения 752 ± 14 нм. *Оценены в течение 75 сут после фотодинамической терапии.

Наиболее высокий процент излеченных животных регистрировался при использовании дозы 2,5 мг/кг, однако при использовании высоких доз препарата (2,5-7,5 мг/кг) наблюдалась гибель части животных от фототоксического шока в течение 2 сут после сеанса ФДТ.

Увеличение интервала времени между введением «Бактериосенса» (2,5 мг/кг) и облучением (150 Дж/см2) до 2 ч приводило к 100 % излеченности животных группе при отсутствии гибели от фототоксичности на ранних сроках после лечения. Дальнейшее увеличе-

ние интервала до 4 и 24 ч приводило к резкому снижению эффективности: ТРО составляло 41-62 и 1531 % соответственно; УПЖ мышей не достигало биологически значимого уровня, излеченность животных составляла 0 %.

Оценка противоопухолевой активности с учетом доз света показала, что при всех используемых значениях плотности энергии (60-180 Дж/см2) выявлена высокая противоопухолевая эффективность фотодинамического воздействия: ТРО составило 74-100 %, УПЖ - от 52 % до >100 %, излеченность

таблица 6. Сравнительная оценка противоопухолевой эффективности препарата «Бактериосенс» у мышей с опухолями большого размера различного генеза при использовании оптимальных режимов проведения фотодинамической терапии

опухолевая размеры опухоли, мм3 оптимальный режим проведения фотодинамической терапии Противоопухолевая эффективность при оптимальных режимах проведения фотодинамической терапии

модель доза, мг/кг интервал между велением и облучением, мин плотность энергии, дж/см2 (доза света) торможение роста опухоли, % увеличение продолжительности жизни, % критерий изле-ченности, %

S37 344 ± 78 2,5 30 90 х 3 = 270 100 78 38*

LLC 414 ± 68 2,5 30 90 х 3 = 270 99-100 51 25*

C26 398 ± 40 2,5 30 90 х 3 = 270 100 54 0*

CR755 430 ± 67 2,5 30 90 х 3 = 270 90-100 88 38*

РС3 223 ± 35 1,0 30 90 х 3 = 270 100 - 100*

Примечание. Источник излучения ми 75 сут.

светодиод с А = 752 ± 14 нм. Плотность мощности 135мВт/см2. *Срок наблюдения за животны-

max 1 ' г

■

составила 50—100 %. Наиболее высокий противоопухолевый эффект был получен при использовании световых доз 120 и 150 Дж/см2.

Таким образом, терапевтическими режимами проведения ФДТ с препаратом «Бактериосенс» при лечении опухолей малого размера являются: дозы препарата 1,0—2,5 мг/кг, интервалы после введения 0,5—2 ч и дозы света 120—150 Дж/см2.

При лечении опухолей большого размера облучение проводили полипозиционно 3 перекрывающимися полями. Световая доза каждого поля облучения составляла 90 Дж/см2, суммарная — 270 Дж/см2. «Бактериосенс» вводили в дозе 2,5 мг/кг (табл. 5).

При облучении через все исследованные интервалы времени после введения препарата выявлен высокий противоопухолевый эффект: ТРО составило 77-100 %, УПЖ - 43-64 %, КИ - 25-38 %, однако при использовании наиболее короткого интервала (15 мин) у 75 % животных наблюдался обширный некроз мышечной ткани, находящейся в зоне облучения.

Таким образом, оптимальным терапевтическими режимами проведения ФДТ с препаратом «Бакте-риосенс» при лечении опухолей большого размера являются: доза препарата 2,5 мг/кг, интервалы после введения 0,5-1 ч и доза света одного поля облучения 90 Дж/см2, суммарная - 270 Дж/см2.

определение спектра фотоиндуцировнной противоопухолевой активности «Бактериосенса» при проведении фотодинамической терапии у мышей с опухолями различного гистогенеза. Спектр противоопухолевой активности ФДТ с «Бактериосенсом» оценен при оптимальных режимах проведения ФДТ: доза препарата 2,5 мг/кг, интервал после его введения - 30 мин, плотность энергии 270 Дж/см2 при трехпозиционном режиме облучения по 90 Дж/см2. Исследования проводили на перевивных моделях опухолей большого размера у иммунокомпетентных мышей с LLC, С26,

Са755 и у иммунодефицитных мышей линии BALB/c Nude с ксенографтами опухоли предстательной железы РС3. Результаты исследований представлены в табл. 6.

В течение 2 ч после сеанса ФДТ у животных начинал развиваться отек, который к 24 ч достигал максимальных размеров и сохранялся до 5 сут. После облучения мыши не погибали.

При лечении опухолей большого размера наиболее высокий противоопухолевый эффект выявлен у мышей с аденокарциномой предстательной железы РС3, наименее выраженный - у мышей с аденокарциномой толстой кишки С26, в 100 % метастазиру-ющей в легкие. Следует отметить, что у иммуноде-фицитных мышей с опухолью РС3 ФДТ можно проводить в более щадящем режиме путем уменьшения дозы препарата и плотности энергии, сохраняя при этом высокий противоопухолевый эффект. Противоопухолевая эффективность ФДТ увеличивается в ряду моделей С26 < LLC < S37 < Ca755 < PC3.

Заключение

Препарат «Бактериосенс» проявлял высокую фотоиндуцированную активность относительно опухолевых клеток человека эпителиального происхождения (РС3, LnCap4, А549, Hep2, BT-474, MCF-7, SK-BK-3, EJ, HT-29) и мыши различного генеза (S37, C26, LLC), характеризовался отсутствием тем-новой токсичности и эффективным проникновением в клетки. Величина ИК50 при оптимальном времени инкубации варьировала от 0,08 до 1,21 мкМ.

Препарат в максимальной терапевтической дозе 2,5 мг/кг быстро (в течение 30 мин) поступал, накапливался в опухолевой ткани S37, Colo26, LLC, РС3 и сохранялся на высоком уровне (5,4-10,4 у. е.) до 4 ч. Максимальная флуоресцентная контрастность относительно кожи регистрировалась через 5-60 мин после введения и составляла 1,9-3,9 у. е.

Определены терапевтические режимы проведения ФДТ с «Бактериосенсом»: доза 1,0—2,5 мг/кг, интервал между введением и облучением 0,5—2 ч, плотность энергии 120—150 Дж/см2 при лечении опухолей малого размера и 90 х 3 = 270 Дж/см2 при трехпозиционном облучении опухолей большого размера.

Использование оптимальных режимов проведения ФДТ с «Бактериосенсом» позволило добиться 100 % ТРО большого и малого размера; 100 и 38 % излеченности иммунокомпетентных мышей с опухолями малого и большого размеров соответственно.

У иммунодефицитных мышей с ксенографтами карциномы предстательной железы РС3, ФДТ с «Бактериосенсом» можно проводить в более щадящем режиме: доза препарата 1,0 мг/кг, плотность энергии 90 Дж/см2 при сохранении высокого противоопухолевого эффекта — 100 % излеченности животных.

«Бактериосенс» является перспективным препаратом для ФДТ опухолей как малого, так и большого размера и может успешно использоваться в качестве альтернативного, органосохраняющего малоинва-зивного метода лечения РПЖ.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Злокачественные новообразования в России в 2016 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Капри-на, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. 250 с. [Malignant neoplasms in Russia in 2016 (morbidity and mortality). Ed. by A.D. Kaprin, V.V. Starinskiy,

G.V. Petrova. Moscow: P.A. Hertsen Moscow Oncology Research Institute -Branch of the National Medical Research Center of Radiology, Ministry of Health of Russia, 2018, 250 p. (In Russ.)].

2. Моисеенко Т.Н., Говоров А.В., Прокопович М.А., Пушкарь Д.Ю. Современные представления о радикальном лечении локализованного рака простаты с использованием ро-бот-ассистированной хирургии. Туберкулез и социально значимые заболевания 2014;3:66-71. [Moiseenko T.N., Govorov A.V., Prokopovich M.A., Pushkar D.Y. Modern aspects of the radical treatment of the prostate cancer using robotic surgery. Tuberkulez i sotsial'no znachimye zabolevaniya = Tuberculosis and socially significant diseases 2014;3:66-71 (In Russ.)].

3. Мартов А.Г., Пархонин Д.И. Лапароскопическая тазовая лимфа-денэктомия при локализованном раке простаты. Российский онкологический журнал 2010;6:39-41. [Martov A.G., Parkhonin D.I. Laparoscopic pelvic lymphadenectomy for located prostate cancer. Rossiysky Onkologichesky Zhurnal = Russian journal of oncology 2010;6:39-41

(In Russ.)].

4. Хмелевский Е.В., Паньшин Г. А., Канчели И.Н., Хорошков В.С. Вари-

анты гипофракционирования протонного буста при местнораспростра-ненном раке простаты. Вопросы онкологии 2012;58(6):787-94. [Khmelevsky E.V., Panshin G.A., Kancheli I.N., Khoroshkov V.S. Options of hypofractionation of proton boost in locally advanced prostate cancer. Voprosy onkologii = Problems in oncology 2012;58(6):787-94 (In Russ.)].

5. Singh A., Cheedella N.K. S., Shakil S.A. et al. Liver Metastases in Prostate Carcinoma Represent a Relatively Aggressive Subtype Refractory

to Hormonal Therapy and Short-Duration Response to Docetaxel Monotherapy. World J. Oncol. 2015;6(1);265-9. DOI: 10.14740/ wjon903w. PMID: 29147414.

6. Фомкин Р.Н., Попков В.М., Шатылко Т.В. Альтернативный вариант комбинированного лечения локализованного рака простаты. Бюллетень медицинских Интернет-конференций 2016;6(2):296-300. [Fomkin R.N., Popkov V.M., Shatylko T.V. Alternative variant

of the combined treatment of a localized cancer of a prostate. Byulleten' meditsinskih Internet-konferentsiy = Bulletin of Medical Internet Conferences 2016;6(2):296-300 (In Russ.)].

7. Аль-Шукри С.Х., Боровец С.Ю., Ры-балов М.А., Саидов Р.Б. Современные методы локальной терапии рака предстательной железы. Нефрология 2009;13(3):153-8. [Al-Shukri S.Kh., Borovets S.Yu., Rybalov M.A., Saidov R.B. Current methods for local treatment of prostate cancer. Nephrology 2009;13(3):153-8 (In Russ.)].

8. Фомкин Р.Н., Попков В.М., Масля-кова Г.Н. и др. Роботизированная высокоинтенсивная сфокусированная

ультразвуковая аблация в лечении локализованного рака простаты: 7 лет опыта. Бюллетень медицинских Интернет-конференций 2017;7(2):529-34. [Fomkin R.N., Popkov V.M., Masljakova G.N. et al. Robotized highintensive focused ultrasonic ablation in treatment of a localized cancer of a prostate: 7 years of experience. Byulleten' meditsinskih Internet-konferentsiy = Bulletin of Medical Internet Conferences 2017;7(2):529-34 (In Russ.)]. 9. Gheewala T., Skwor T., Munirathinam G. Photosensitizers in prostate cancer therapy. Oncotarget 2017;8(18):30524-38. DOI: 10.18632/oncotarget.15496. PMID: 8430624.

10. Кащенко В.А., Распереза Д.В., Творогов Д.А., Добрун М.В. Фотодинамическая терапия: от фундаментальных исследований к практике. Vestnik Sankt-Peterburgskogo universiteta = Вестник Санкт-Петербургского университета 2015;11(1):5— 12. [Kashchenko V.A., Raspereza D.V., Tvorogov D.A., Dobrun M.В. Photodynamic therapy: from fundamental research to Practice.

The bulletin of the St. Petersburg university 2015;11(1):5—12 (In Russ.)].

11. Zhu T.C., Kim M.M., Liang X. et al. In-vivo singlet oxygen threshold doses for PDT. Photonics Lasers Med. 2015;4(1):59-71.

DOI: 10.1515/plm-2014-0037. PMID: 25927018.

12. Agostinis P., Berg K., Cengel K.A. et. al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer J. Clin. 2011;61(4): 250-81. DOI: 10.3322/caac.20114. PMID: 21617154.

13. Barrett T., Davidson S.R., Wilson B.C. et al. Dynamic contrast enhanced MRI as a predictor of vascular-targeted

photodynamic focal ablation therapy outcome in prostate cancer post-failed external beam radiation therapy. Can Urol Assoc J. 2014;8(9-10):708-14. DOI: 10.5489/cuaj. 2176. PMID: 25408811.

14. Shafirstein G., Bellnier D., Oakley E. et al. Interstitial Photodynamic Therapy — A Focused Review. Cancers (Basel) 2017;9(2):E12. DOI: 10.3390/ cancers9020012. PMID: 28125024.

15. Chilakamarthi U., Giribabu L. Photodynamic Therapy: Past, Present and Future. Chem. Rec. 2017;17(8): 775-802. DOI: 10.1002/tcr.201600121. PMID: 28042681.

16. Миронов А.Ф., Грин М.А. Сенсибилизаторы бактериохлоринового ряда: перспективы использования в фотодинамической терапии. Вестник МИТХТ 2006;(4):5—28. [Mironov A.F., Grin M.A. Bacteriochlorin sensitizers: prospects of use in photodynamic therapy. Vestnik MITHT = Bulletin

of Moscow state University of Fine

Chemical Technologies 2006;(4):5—28 (In Russ.)].

17. Krzykawska-Serda M., D^browski J.M., Arnaut L.G. et al. The role of strong hypoxia in tumors after treatment

in the outcome of bacteriochlorin-based photodynamic therapy. Free Radic. Biol. Med. 2014;73:239-51. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed. 2014.05.003. PMID: 24835769.

18. Патент РФ на изобретение

№ 2549953/10.05.2015, Бюл. № 13. Макарова Е.А., Якубовская Р.И., Ворожцов Г.Н. и др. Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии [Электронный ресурс]. [Patent RU № 2549953/10.05.2015, Bul. № 13. Makarova E.A., Jakubovskaja R.I., Vorozhtsov G.N., et al. Photosensitizers for photodynamic therapy(In Russ.)] URL: http://www1. fips.ru/fips_servl/fips_servlet

19. American Type Culture Collection (ATCC) [Электронный ресурс]. URL:

https://www.lgcstandards-atcc.org/?geo_ country=ru

20. Институт цитологии РАН. Коллекция культур клеток позвоночных [Электронный ресурс]. URL: http://www. cytspb.rssi.ru/rkkk/rkkk_ru. htm. [Institute of Cytology RAS — collection of cell cultures of vertebrates (In Russ.)].

21. Якубовская Р.И., Казачкина Н.И., Кармакова Т.А. и др. Методические рекомендации по изучению фотоин-дуцированных противоопухолевых свойств лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова и др. М.: Гриф и К, 2012:657—71. [Yakubovskaya R.I., Kazachkina N.I., Karmakova T.A. et al. Methodical recommendations on the study

of photoinduced antitumor properties of drugs. In: Guide to conducting preclinical studies of medicines. Ed. by A.N. Mironov. Moscow: Grif i K, 2012:657—71 (In Russ.)].

ORCID авторов / ORCID of authors

Н.Б. Морозова / N.B. Morozova: https://orcid.org/0000-0002-7159-805X А.Д. Плютинская / A.D. Plyutinskaya: https://orcid.org/0000-0002-6898-2931 М.С. Воронцова / M.S. Vorontsova: https://orcid.org/0000-0002-9320-1746 А.А. Панкратов / A.A. Pankratov: https://orcid.org/0000-0001-7291-9743 Р.И. Якубовская / R.I. Yakubovskaya: https://orcid.org/0000-0002-9799-7622 Е.А. Макарова / E.A. Makarova: https://orcid.org/0000-0003-4144-6159 Е.А. Лукъянец E.A. Lukyanets: https://orcid.org/0000-0002-8853-6912 А.Д. Каприн / A.D. Kaprin: https://orcid.org/0000-0001-8784-8415

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 14. N08.12.0049).

Financing. The study was performed with financial support of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (government contract No. 14. N08.12.0049).