CC BY
1016. Споаб ощнки ступеня дисбюзу (дисбактерiозу) органiв i тканин: корисна модель 43140 Украша: МПК (2009) G01N 33/48 / А. П. Левицький [та шш.]; дата публ.: 10.08.2009, Бюл. № 15.
17. Николаева, А. В. Экспериментальные дистрофии тканей пародонта / А. В. Николаева, Е. С. Розовская // БЭБИМ. -1965. - т. 60, № 7. - С. 46-49.
18. Трухачева, Н. В. Математическая статистика в медико-биологических исследованиях с применением пакета Statistica /
Н. В. Трухачева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 379 с.
Адрес для корреспонденции:
65082, Украина, г. Одесса, Валиховский пер., 2, Одесский национальный медицинский университет, кафедра фармацевтической химии, тел.: +38 (048) 718-53-61, e-mail: vladimiranisimov@ukr. net, Анисимов В. Ю.
Поступила 27.05.2016г.
В. М. Насек, О. В. Винникова, Е. В. Санько-Счисленок, М. В. Макаренко, П. Т. Петров
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НОВОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА АНТИРЕФЛЮКСНОГО ДЕЙСТВИЯ
«АЛЬГИНОМАКС»
Государственное научное учреждение «Институт биоорганической химии
Национальной академии наук Беларуси», г. Минск, Республика Беларусь
Проведено доклиническое токсикологическое исследование безопасности нового антацидного лекарственного средства «АльгиноМАКС», обладающего анти-рефлюксным действием. Разработанное антацидное средство не вызывает летальности у самцов и самок мышей и крыс при однократном интрагастральном (per os) и внутрибрюшинном (в/б) введении в дозах до 5,5 г/кг (VI класс токсичности по классификации OECD). Установлено, что лекарственное средство «АльгиноМАКС» не обладает отрицательными нейротропными, кардиотропными, гематропными и органотропными эффектами при ежедневном 60-суточном per os введении в дозах до 2 г/кг, не оказывает местно-раздражающего действия на слизистую желудочно-кишечного тракта в дозах, 4-кратно превосходящих рекомендуемые для применения у человека. По исследованным показателям антенатального развития, «АльгиноМАКС» не обладает эмбриотоксическим действием.
Ключевые слова: антирефлюксное антацидное средство, лекарственная форма, токсичность острая, субхроническая, хроническая, аллергенность, гемокоагуло-грамма, сенсибилизация, эмбриотоксичность, гонадотоксичность, лабораторные животные.
ВВЕДЕНИЕ
АльгиноМАКС является комбинированным антацидным средством, обладающим антирефлюксными, адсорбирующими, обволакивающими и кислотонейтра-лизующими свойствами. Лекарственное средство (ЛС) предназначено для лечения различных форм гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ). АльгиноМАКС разработан в рамках Государственной программы «Импортозамещающая фармпродукция» [1, 2].
Активная фармацевтическая субстанция препарата представляет собой композицию натрия альгината, калия гидрокарбоната (КНС03), кальция карбоната (СаС03), магния гидроксида (Mg(OH)2, В качестве вспомогательных веществ использованы гидроксиаппатит, макрогол 4000 (полиэтиленгликоль 4000), коповидон (коллидон УА 64), магния стеарат, сорби-тол, натрия сахаринат и ароматизатор. ЛС «АльгиноМАКС» представляет собой мятную жевательную таблетку массой 1000 мг. Важным компонентом ЛС является натрия
альгинат, который образует вязкий противовоспалительный гель-антацид, плавающий как «плот» на поверхности желудочного содержимого и предохраняющий пищевод от агрессивной среды. При этом калия гидрокарбонат, являясь источником CO2, придает «плоту» плавучесть, тогда как катионы кальция и магния связывают молекулы альгината для укрепления образовавшегося защитного барьера-плота. Калия гидрокарбонат, кальция карбонат и магния гидроксид, обладающие кислото-нейтрализующими свойствами, являются известными компонентами антацидных средств.
Целью настоящего исследования является оценка токсического действия нового лекарственного средства антирефлюксно-го действия «АльгиноМАКС» в остром, субхроническом и хроническом опыте.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В представленных исследованиях использовали таблетки «АльгиноМАКС» по 1000 мг (серия 011213), содержащие следующие ингредиенты: натрия альгинат 250 мг, калия гидрокарбонат 75 мг, кальция карбонат 125 мг, магния гидроксид 45 мг. Тестирование на модельной системе in vitro разовой дозы (2 таблетки) показало кислотонейтрализующую активность (КНА) 9,9-10,1 мэкв, достигаемое значение pH 6,5-6,9 (норма: < 7,0).
Изучение общетоксического действия (острой, субхронической и хронической токсичности) ЛС проводили в соответствии с существующими требованиями GLP на половозрелых аутбред-ных животных обоего пола - мышах ICR (n=120, 2,0-2,5 мес., масса 20,0±2,0 г) и крысах Wistar (n=360, 1,5-2 мес., масса 180-200 г) [3]. Оценку острой токсичности осуществляли с использованием 2-х путей введения: внутрибрюшинного (в/б) и внутрижелудочного (в/ж). Животным контрольных групп вводили растворитель (вода очищенная). Внутрижелудоч-ное введение измельченного антацидного средства осуществляли с помощью специального металлического зонда. Для мышей использовали дозы 1000, 2000, 3000, 4000 и 5500 мг/кг, что соответствовало превышению суточной терапевтической дозы (СТД) для человека (64-86 мг/кг) в пересчете на мышь (832-1118 мг/кг)
в 5,5 раз. Для крыс использовали дозы 500, 1000, 2000, 3000 и 5500 мг/кг, что соответствовало превышению СТД для человека (64-86 мг/кг) и в пересчете на крысу (384-516 мг/кг) достигало 10-кратного превышения. При внутрибрюшинном введении подопытным крысам-самцам и самкам ЛС вводили в дозах 100, 200, 400, 800 и 1300 мг/кг. В опытах по изучению субхронической и хронической токсичности АльгиноМАКС вводили интрагастрально ежедневно (1 раз в сутки) на протяжении 28 и 60 дней крысам Wistar (по 10 самцов и 10 самок на дозу) в дозах 500 (СТД), 1000 и 2000 мг/кг, превышающих СТД соответственно в 2 и 4 раза. Животные контрольной группы получали растворитель в том же режиме. До начала исследования, через 1 и 2 месяца ежедневного введения изучаемого ЛС оценивали следующие показатели: общее состояние животных, поведение, динамика массы тела, потребление воды и корма, общий неврологический статус, функциональное состояние ЦНС [4, 5], сердца, печени, почек, состояние периферической крови. Оценку секреторной функции извитых канальцев почек проводили с помощью нагрузочной пробы с феноловым красным [9]. В конце экспериментов проводили биохимический анализ крови и аутопсию после эвтаназии животных (3-кратной передозировкой тиопента-ла натрия), гистологическое исследование органов с определением индексов по отношению к массе тела.
Аллергизирующие свойства исследовали на мышах линии DBA/2 (массой 20-22 г самки и 25-28 г самцы) путем вну-трикожной сенсибилизации с иммуностимулятором (полным адъювантом Фрейнда, Sigma). В опытные и контрольные группы включали по 10 особей обоего пола. О величине отека (показатель ТОЛМ - толщина отека лапы мыши), то есть о развитии гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), судили по разнице в толщине левой и правой лап, измеряемой через 24 ч после тестирования цифровым плетизмометром LE7500 («Panlab S.L.», Италия) [6].
Для оценки эмбриотоксического действия антацидного средства «Альгино-МАКС» изучали показатели антенатального развития и состояние потомства в постнатальном периоде жизни. Использовали крыс Wistar обоего пола. Самок подсаживали к самцам в стадии проэструса в
соотношении 2:1 сроком на 2 эстральных цикла. Оплодотворение регистрировали с помощью вагинальных мазков. АльгиноМАКС вводили беременным самкам один раз в сутки с первого до последнего дня беременности в виде 5% водного раствора в воде очищенной в дозе, эквивалентной терапевтической для человека - 500 мг/ кг. Путь введения - пероральный (адекватный клиническому использованию). Контрольная группа служила негативным контролем, подвергалась воздействию растворителя, используемого для приготовления рабочего раствора таблеток «Альги-ноМАКС» - воды очищенной. Осуществляли ежедневное наблюдение за общим состоянием и поведением беременных самок, ежедневно взвешивали, анализировали прирост массы тела. За 3 дня до родов беременные самки были размещены в индивидуальных клетках. В каждом помете оставляли по 8 новорожденных крысят. На 25-й день после рождения крысят отсаживали от матери. Поведение потомства в постнатальном периоде жизни изучали, наблюдая за его физическим развитием до окончания периода вскармливания, двигательной активностью и эмоциональным состоянием, способностью к координации движений после окончания вскармливания. В качестве показателей эмбриоток-сического действия определяли прирост массы тела беременных самок, количество крысят в помете, их массу и краниокау-дальный размер новорожденных крысят, морфологические (анатомические) пороки развития. Оценку поведения потомства проводили в тесте «открытое поле». «Открытое поле» представляет собой изолированную от внешней среды ярко освещенную квадратную площадку. Регистрация поведенческой активности животных проводилась в течение 3 минут после помещения в «открытое поле» в условиях комнатного освещения в одно и то же время суток. Исследования проводили через 1 ч после введения изучаемого средства «Аль-гиноМАКС». Регистрировали следующие поведенческие реакции: горизонтальную и вертикальную двигательную активность, «норковый» рефлекс, груминг, количество уринаций и дефекаций [7]. Разновидностью ориентировочно-исследовательского поведения крыс является показатель «норкового рефлекса», который свидетельствует о способности животного исследовать
«открытое поле», в частности, заглядывать в норки.
Груминг (косметическое поведение) крыс является важной характеристикой поведения животных в «открытом» поле. Более того, крысы большую часть времени уделяют вычесыванию своего тела по сравнению с перемещением в пространстве. Груминг тесно коррелирует с двигательной активностью. Поэтому при исследовании лекарственных средств эта характеристика поведения особенно ценна.
Показатели коагулограммы (активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время и концентрацию фибриногена) определяли на отечественном коагулометре СТ 2410 фирмы СОЛАР (Беларусь). Прибор предназначен для определения времени свертывания плазмы крови турбидиметрическим методом путем непрерывного контроля изменений светопропускания, происходящих в перемешиваемом и термостатируемом растворе. Прибор пригоден для определения всех тестов, заканчивающихся образованием фибринового сгустка. АЧТВ является самым чувствительным тестом для оценки внутреннего пути I фазы свертывания крови - протромбиназообразования. Протромбиновое время является наиболее чувствительным тестом для оценки образования тромбина. Источником факторов протромбинового комплекса служит исследуемая плазма.
Для оценки структуры поведения потомства крыс, получавших во время беременности антацидное средство, анализировали результаты, полученные в тесте «открытое поле». Регистрацию поведенческой активности животных проводили в течение 3 мин после помещения в центр площадки в условиях комнатного освещения. Исследования проводили через 4 недели после рождения (после окончания периода вскармливания).
Оценку статистической значимости результатов проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики для множественных сравнений с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Порошок измельченного ЛС «Альги-ноМАКС», вводимый однократно интрага-
стрально в максимально возможных дозах (в диапазоне доз 1000, 2000, 3000, 4000 и 5500 мг/кг мышам и 500, 1000, 2000, 3000 и 5500 мг/кг крысам), не приводил к гибели и не оказывал значимого токсического действия на организм грызунов (таблица 1). В первые часы после введения ЛС отмечались незначительная заторможенность животных и снижение потребления корма, которые обусловлены стрессом, связанным с процедурой введения ЛС в больших объёмах в желудок. В течение последующих двух недель ежедневного наблюдения у подопытных мышей не отмечалось существенных изменений спонтанной двигательной активности, вегетативных расстройств и признаков нейротоксичности. Случаев
Субхроническое (28 дней) и хроническое (60 дней) внутрижелудочное введение ЛС «АльгиноМАКС» животным в дозах 1500 мг/кг и 3000 мг/кг не оказывало вредного воздействия на показатели адаптационных систем (ЦНС, ССС, дыхательная, кроветворная, антитоксическая, выделительная), обмена веществ, общего состояния и развития, а также на основные гомеостатические параметры организма. Макроскопические пато-логоанатомические исследования и определение относительных коэффициентов массы внутренних органов показали, что исследуемое средство не вызывало токсических дегенеративных изменений лимфоидных и важнейших внутренних органов. ЛС не обладало аллергизирующими свойствами, не влияло на формирование гиперчувствительности замедленного типа.
При изучении хронической (включая субхроническую) токсичности ЛС «Аль-гиноМАКС» получены следующие интегральные показатели. После первого
гибели не было отмечено. На протяжении последующих 13 дней подопытные грызуны потребляли обычное количество воды и корма, соответствующее массовому приросту. Массовые коэффициенты органов подопытных животных обоего пола находились в пределах нормы для данных видов животных, что указывало на отсутствие у ЛС способности вызывать токсические изменения важнейших внутренних органов. Полученные данные позволяют отнести ЛС «АльгиноМакс» к относительно безвредным лекарственным средствам (VI класс токсичности по классификации OECD) и свидетельствуют о большой широте его терапевтического действия, хорошей переносимости и безопасности [3].
и каждого последующего однократного ежедневного интрагастрального введения антацидного средства в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг заметных отклонений общего состояния и поведения крыс по сравнению с контрольными животными не было. Установлено, что ежедневное введение ЛС «АльгиноМАКС» на протяжении 60 дней в дозах 500, 1000, и 2000 мг/кг не вызывало случаев гибели и видимых изменений вегетативных функций, поведения, двигательной активности, нервно-мышечной координации, болевой чувствительности и эмоциональной реактивности подопытных животных. Поведение животных в группах, которые получили дозу антацидного средства, в 1-4 раза превышающую суточную терапевтическую дозу, было в пределах нормы. Гибели животных за период наблюдения (60 суток) не было. Динамика нарастания массы тела у животных была также в пределах физиологической нормы (таблица 2). Потребление корма и воды по-
Таблица 1 - Оценка острой токсичности лекарственного средства «АльгиноМАКС»
Исследование Изменения в сравнении с контролем
- общее состояние; - общий неврологический статус (по S. Irwin (1959) в модификации C. Morpurgo (1971): состояние простых и сложных моторных рефлексов, абдоминальный тонус, мышечная сила (хватательный рефлекс), мышечный тонус, нарушения позы, координации движений, наличие ката-лептоидных явлений, гипотермии, состояние дыхания, наличие мидриаза или миоза, реакция на звуковой стимул, роговичный рефлекс); - состояние вегетативных функций (наличие пилоэрекции, птоза, экзофтальма, нарушений дефекации и диуреза); - определение индексов по отношению к массе тела (сердце, печень, селезенка, почки, надпочечники, простата, яички, яичники, головной мозг, гипофиз). отсутствуют
допытными крысами во всем периоде наблюдения не отличалось от контроля. Это свидетельствовало об отсутствии отрицательного влияния ЛС «АльгиноМАКС» на общее состояние животных, при котором наблюдается нормальный аппетит.
При оценке структуры поведения в тесте «открытое поле» следует отметить небольшие отличия в поведенческих реакциях после 14 и 28 дней введения в желудок ЛС «АльгиноМАКС» в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг крысам Wistar в опытных группах животных по сравнению с контролем. Из
таблицы 3 видно, что общая двигательная активность (горизонтальная и вертикальная) у крыс-самцов на протяжении всего опыта по изучению субхронической токсичности оставалась примерно на одном уровне, незначительно угасая. Причем угасание двигательной активности к 28-му и 60-му дням можно трактовать как привыкание к индифферентной окружающей среде. Аналогичная динамика изменения общей двигательной активности наблюдается и у крыс-самок (таблица 4), однако она имеет более выраженную тенденцию, нежели у самцов.
Таблица 2 - Влияние ЛС «АльгиноМАКС» при длительном однократном ежедневном
интрагастральном введении в диапазоне доз в течение 2-х месяцев крысам Wistar обоего пола на массу тела, характеризующую хроническую (включая субхроническую) токсичность антацидного средства ( х ± ; 0-й-14-й день п = 30; 15-й-28-й день п=25)
Сроки исследования (сутки) Экспериментальная группа и пол
Контроль 500 мг/кг 1000 мг/кг 2000 мг/кг
М F М F М F М F
Фон (0-е сутки) 178,8±4,44 162,8±3,74 177,0±4,87 162,8±3,09 172,3±5,03 161,5±3,33 176,8±4,12 162,5±3,35
Период введения
7 сутки 185,8±4,46 176,5±3,57 182,8±4,48 175,5±3,59 190,5±4,67 176,8±2,27 196,5±3,70 175,3±3,88
14 сутки 209,5±3,53 189,8±3,39 210,3±4,58 191,3±2,94 214,0±4,55 186,8±2,77 220,0±3,79 188,8±3,75
21 сутки 223,0±6,40 202,0±4,65 234,7±6,86 209,3±6,19 235,0±9,75 204,0±6,08 237,3±5,85 203,7±5,29
28 сутки 241,7±6,84 207,7±4,65 239,7±8,47 209,3±6,11 251,7±7,41 203,0±7,43 243,0±7,10 203,3±4,59
35 сутки 250,0±8,27 212,5±4,43 245,5±6,34 212,0±7,27 251,0±11,40 200,0±4,71 257,5±10,09 214,5±4,25
42 сутки 268,5±9,78 218,5±4,28 259,0±7,18 207,5±7,08 260,0±11,13 209,0±4,93 282,0±11,26 215,0±6,28
49 сутки 309,5±11,5 233,0±6,88 305,0±8,23 221,5±6,71 294,5±8,67 225,0±4,59 312,5±9,41 227,0±4,42
60 сутки 327,0±12,2 243,5±7,75 333,5±8,23 233,5±6,37 323,5±11,76 229,5±4,74 334,5±10,86 235,5±5,29
Примечание: различия статистически не достоверны (критерии Ньюмена-Кейлса и Крускала-Уоллиса): Р>0,05
Таблица 3 - Показатели двигательной и исследовательской активности крыс-самцов в тесте «открытое поле» в динамике ежедневного введения ЛС «АльгиноМАКС» в течение 60 суток в диапазоне доз (х ± ; п=5)
Группа; доза, мг/кг Сроки тестирования от начала введения Активность Количество актов
Горизонтальная Вертикальная Выход в центр Норковый рефлекс Груминг Болюсы Диурез
Контроль Фон 19,6±1,9 13,8±1,7 0,2±0,2 1,0±0,3 3,0±0,7 1,0±0,3 0,8±0,2
500 21,0±2,3 15,0±2,0 0,4±0,2 0,8±0,4 3,0±1,0 1,0±0,3 0,8±0,2
1000 19,4±2,5 16,6±1,5 0,2±0,2 0,6±0,4 3,2±0,9 1,2±0,2 1,0±0,0
2000 21,2±2,2 14,2±2,4 0,4±0,2 0,8±0,4 2,8±0,9 1,0±0,3 1,2±0,2
Контроль 14 дней 21,2±2,9 14,2±2,3 0,4±0,2 1,0±0,3 3,6±0,9 1,0±0,3 1,0±0,3
500 24,8±4,0 16,4±1,7 0,8±0,4 1,4±0,7 4,4±1,9 0,8±0,4 0,8±0,2
1000 20,8±4,1 13,0±1,8 0,4±0,2 0,8±0,4 4,0±1,3 0,6±0,2 1,0±0,0
2000 23,4±3,9 15,8±1,9 0,8±0,4 1,8±0,7 2,8±0,9 0,6±0,2 0,8±0,2
Контроль 28 дней 23,0±5,1 16,6±2,1 0,6±0,2 1,6±0,2 3,6±0,7 1,2±0,2 0,8±0,2
500 22,8±3,7 15,2±2,3 0,4±0,2 1,8±0,6 2,8±0,9 0,8±0,2 0,6±0,2
1000 20,6±3,3 14,4±2,3 0,6±0,2 1,2±0,2 4,0±1,9 0,8±0,2 0,6±0,2
2000 18,4±3,8 12,4±1,1 0,4±0,2 1,0±0,3 3,8±1,4 0,6±0,2 0,8±0,2
Контроль 60 дней 21,2±2,2 12,2±1,7 0,6±0,2 1,2±0,4 2,4±0,7 0,6±0,2 0,8±0,2
500 20,4±2,4 12,4±2,0 0,6±0,2 1,0±0,3 2,2±0,6 0,6±0,2 0,8±0,2
1000 20,2±2,3 12,6±1,9 0,6±0,2 0,8±0,2 2,6±0,8 0,8±0,2 1,0±0,0
2000 18,4±3,2 12,2±2,7 0,8±0,4 0,8±0,4 1,8±0,7 0,4±0,2 0,6±0,2
Примечание: достоверных различий не выявлено (р > 0,05).
Таблица 4 - Показатели двигательной и исследовательской активности крыс-самок в тесте «открытое поле» в динамике ежедневного введения ЛС «АльгиноМАКС»
в течение 60 суток
Группа; доза, мг/кг Сроки тестирования от начала введения Активность Количество актов
Горизонтальная Вертикальная Выход в центр Норковый рефлекс Груминг Болюсы Диурез
Контроль Фон 18,2±2,6 16,6±1,6 0,4±0,2 0,8±0,4 4,0±1,0 0,6±0,2 0,8±0,2
500 19,6±2,2 15,8±2,1 0,4±0,2 1,0±0,3 3,8±1,2 0,6±0,4 1,0±0,0
1000 19,0±2,7 17,6±1,1 0,2±0,2 0,8±0,4 2,4±1,0 0,6±0,2 0,8±0,2
2000 19,2±1,7 16,0±1,8 0,6±0,2 0,8±0,2 3,4±0,9 0,4±0,2 0,8±0,2
Контроль 14 дней 25,6±4,2 17,0±4,6 0,6±0,2 2,0±0,4 3,6±1,3 1,4±0,2 0,8±0,4
500 26,6±3,4 16,6±2,9 0,8±0,4 1,6±0,4 3,0±1,3 1,0±0,3 0,8±0,2
1000 25,4±3,6 17,4±2,2 1,0±0,3 1,8±0,6 4,2±1,5 1,4±0,4 1,0±0,3
2000 27,2±5,5 17,0±2,6 1,4±0,7 1,8±0,6 4,2±1,5 0,8±0,4 0,8±0,2
Контроль 28 дней 22,6±3,6 13,2±2,8 0,4±0,2 1,2±0,4 3,4±0,9 1,0±0,3 0,8±0,2
500 21,6±3,4 13,4±1,8 0,4±0,2 1,2±0,2 3,4±1,0 0,8±0,2 0,8±0,2
1000 23,8±3,5 15,2±2,5 0,6±0,2 0,8±0,4 4,0±1,7 0,8±0,2 1,0±0,0
2000 17,8±3,8 15,2±1,7 0,6±0,2 1,0±0,3 3,4±1,3 0,8±0,4 0,6±0,2
Контроль 60 дней 20,0±3,1 11,2±2,5 0,6±0,2 0,8±0,4 2,2±0,6 0,8±0,2 0,8±0,2
500 20,2±2,9 11,0±1,9 0,6±0,2 0,8±0,4 2,4±0,9 0,6±0,2 0,8±0,2
1000 20,4±2,8 10,8±1,7 0,6±0,2 0,6±0,2 2,0±0,7 0,6±0,2 0,6±0,2
2000 19,4±3,3 10,6±1,2 0,4±0,2 0,6±0,2 2,6±0,5 0,8±0,2 0,8±0,2
Примечание: достоверных различий не выявлено (р > 0,05).
Так, на 14 день исследования наблюдалось увеличение двигательной активности по сравнению с фоновыми показателями, а к 28-му и 60-му дням - снижение. Изменение общей активности у самцов и самок относительно контроля до 17%; р > 0,05 в сторону увеличения и до 25%; р > 0,05 в сторону уменьшения этого показателя.
Предварительные испытания (фон) показали невысокий уровень ориентировочно-исследовательского поведения по показателю «норковый рефлекс». При повторном исследовании через 14 и 28 дней ежедневного внутрижелудоч-ного введения ЛС «АльгиноМАКС» он увеличивался в сравнении с фоновыми показателями, но оставался почти на одном уровне у опыта и контроля. Таким образом, антацидное средство при субхроническом введении вызывало незначительное увеличение ориентировочно-исследовательского поведения, что может быть связано не с действием ЛС, а с определенным периодом развития животных в дни проведения теста.
Предварительные испытания (фон) показали, что груминг у крыс-самцов составляет 2,8-3,0, у крыс-самок - 2,4-4,0 актов. Через 14 и 28 дней ежедневного внутриже-лудочного введения антацидного средства в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг наблюдалось незначительное увеличение данного показателя у крыс-самцов и у крыс-самок
по сравнению с контролем и фоновыми показателями. Через 60 дней ежедневного введения наблюдалось снижение количества груминга относительно фоновых значений, что свидетельствовало о привыкании животных к среде «открытого поля».
Уровень эмоционального состояния крыс оценивается по количеству дефекаций. В таблицах 3 и 4 также представлены результаты экспериментального исследования по влиянию 60-дневного введения лекарственного средства «АльгиноМАКС» на эмоциональное состояние крыс. Исследование этого показателя показало, что уровень дефекаций животных за время тестирования в «открытом поле» незначительно отличался относительно фоновых показателей и контроля, что является нормой для данного вида животных. Оценка уровня диуреза показала, что количество уринаций в тесте «открытое поле» в контрольных и опытных группах крыс обоего пола через 14, 28 и 60 дней ежедневного внутрижелудочного введения ЛС «Альги-ноМАКС» во всем диапазоне доз также незначительно отличалось относительно фоновых показателей.
Таким образом, при оценке структуры поведения в тесте «открытое поле» не наблюдалось статистически значимых отличий между контрольными и подопытными группами животных при испытанных дозах ЛС «АльгиноМАКС».
Анализ электрокардиограмм показал, что у крыс контрольных и опытных групп на протяжении всего срока эксперимента при периодическом исследовании не отмечалось нарушений сердечного ритма и существенных различий частоты сердечных сокращений. Учащение дыхания и сердцебиения, которые наблюдались сразу после введения во всем диапазоне исследованных доз, были аналогичны контрольным животным и продолжались до 0,5 часа. На второй день после введения и после каждого последующего введения антацидного средства «АльгиноМАКС» каких-либо видимых нарушений функций сердечно-сосудистой системы и дыхания не обнаружено.
Исследование мочи экспериментальных крыс, получавших антацидное средство в дозах 500-2000 мг/кг в течение 60 суток, позволило установить, что спонтанный диурез существенно не отличался от такового у контрольных животных, которым вводили равные по объему количества
воды очищенной (таблицы 5 и 6). Удельный вес мочи подопытных крыс достоверно не отличался от контрольных значений. Не было выявлено также существенных отклонений показателей рН и окраски мочи у подопытных крыс обоего пола по сравнению с контрольными животными. Случаев протеинурии и бактериурии, характерных для почечной патологии, не наблюдалось. В пробах мочи крыс-самцов, взятых через 28 и 60 суток, количество эритроцитов не превышало контрольных показателей.
При анализе осадка мочи у крыс обоего пола количество лейкоцитов, эритроцитов, эпителиальных клеток колебалось в пределах физиологической нормы. Ок-салаты, ураты, трипельфосфаты обнаруживались в небольшом количестве в моче подопытных и контрольных крыс. Не выявлено достоверных изменений массовых коэффициентов почек у подопытных крыс обоего пола относительно контрольных значений.
Экспериментальная группа
Показатели Фон 28 сутки
Контроль 500 мг/кг 1000 мг/кг 2000 мг/кг
Объем мочи, мл 3,70±0,24 4,56±0,67 4,76±0,7 4,88±0,48 4,12±0,43
Билирубин, мкмоль/л 0 0 0 0 0
Уробилиноген, мкмоль/л < 30 < 30 < 30 < 30 < 30
Кетоны, ммоль/л 0 0 0 0 0
Аскорбиновая кислота, ммоль/л 0 0 0 0 0
Глюкоза, ммоль/л <2,8 <2,8 <2,8 <2,8 <2,8
Общий белок, г/л 0 0 0 0 0
Эритроциты, кл/мкл 32,50±6,29 30,0±12,25 12,0±9,5 22,0±11,47 30,0±12,25
РН 6,83±0,17 6,40±0,24 6,8±0,20 6,8±0,20 6,8±0,20
Нитриты, мкмоль/л 0 0 0 0 0
Лейкоциты, кл/мкл 0 0 0 0 0
Относит. плотность 1,003±0,001 1,005±0,000 1,005±0,000 1,005±0,000 1,005±0,000
60 сутки
Объем мочи, мл 6,76±0,82 5,64±0,81 6,76±0,39 6,56±0,49
Билирубин, мкмоль/л 0 0 0 0
Уробилиноген, мкмоль/л < 30 < 30 < 30 < 30
Кетоны, ммоль/л 0 0 0 0
Аскорбиновая кислота, ммоль/л 0 0 0 0
Глюкоза, ммоль/л 0 0,56±0,56 0 0
Общий белок, г/л 0 0 0 0
Эритроциты, кл/мкл 13,0±9,30 41,0±9,00 31,0±11,66 22,0±11,47
РН 6,8±0,20 7,0±0,00 6,6±0,24 6,8±0,20
Нитриты, мкмоль/л 0 0 0 0
Лейкоциты, кл/мкл 0 115,0±97,34 0 0
Относит. плотность 1,005±0,000 1,005±0,000 1,006±0,001 1,005±0,000
Таблица 5 - Показатели мочи крыс-самцов Wistar после 28- и 60-суточного ежедневного однократного внутрижелудочного введения ЛС «АльгиноМАКС» в хроническом
эксперименте (х ± ; п=5)
Таблица 6 - Показатели мочи крыс-самок Wistar после 28- и 60-суточного ежедневного однократного внутрижелудочного введения ЛС «АльгиноМАКС» в хроническом
эксперименте (х ± 8х; п=5)
Экспериментальная группа
Показатели Фон 28 сутки
Контроль 500 мг/кг 1000 мг/кг 2000 мг/кг
Объем мочи, мл 3,91±0,20 3,88±0,47 4,40±0,36 3,96±0,51 3,96±0,32
Билирубин, мкмоль/л 0 0 0 0 0
Уробилиноген, мкмоль/л < 30 < 30 < 30 < 30 < 30
Кетоны, ммоль/л 0 0 0 0 0
Аскорбиновая кислота, ммоль/л 0 0 0 0 0
Глюкоза, ммоль/л <2,8 <2,8 <2,8 <2,8 <2,8
Общий белок, г/л 0 0 0 0 0
Эритроциты, кл/мкл 31,33±5,33 13,0±9,43 30,0±12,25 10,0±10,00 20,0±12,25
РН 7,0±0,22 6,8±0,20 7,4±0,24 6,8±0,20 7,2±0,20
Нитриты, мкмоль/л 0 0 0 0 0
Лейкоциты, кл/мкл 0 0 0 0 0
Относит. плотность 1,004±0,001 1,005±0,000 1,004±0,001 1,005±0,000 1,005±0,000
60 сутки
Объем мочи, мл 4,10±0,43 4,32±0,47 5,98±1,02 5,72±0,86
Билирубин, мкмоль/л 0 0 0 0
Уробилиноген,мкмоль/л < 30 < 30 < 30 < 30
Кетоны, ммоль/л 0 0 0 0
Аскорбиновая кислота, ммоль/л 0 0 0 0
Глюкоза, ммоль/л 0 0 0 0
Общий белок, г/л 0 0 0 0,06±0,06
Эритроциты, кл/мкл 130,0±48,99 21,0±11,87 53,0±49,26 104,0±59,61
РН 7,8±0,12 7,6±0,29 7,6±0,40 8,0±0,22
Нитриты, мкмоль/л 0 0 0 0
Лейкоциты, кл/мкл 0 0 2,0±2,0 4,0±2,45
Относит. плотность 1,011±0,002 1,008±0,001 1,011±0,002 1,011±0,002
При оценке функциональной активности почек крыс по выведению с мочой фенолового красного в исходном состоянии, через 14, 28 и 60 суток от начала ежедневного введения антацидного средства «Альгино-МАКС» влияния ЛС на секреторную функцию почек не было выявлено (таблица 7).
Гематологические исследования проводились через 28 и 60 дней после ежедневного введения ЛС «АльгиноМАКС» крысам-самцам и самкам Wistar. Результаты исследования влияния длительного введения антацидного средства на гематологические показатели периферической крови крыс в
эксперименте при изучении хронической токсичности приведены в таблицах 8 и 9.
Из представленных данных следует, что у контрольных крыс-самцов, получавших ежедневно плацебо, через 28 суток концентрация гемоглобина и эритроцитов в крови составила 116±2,40 г/л и 6,52±0,11*1012/л соответственно, а у самцов крыс, получавших ЛС в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг, аналогичные показатели мало отличались и находились в пределах 114-121 г/л и 6,54-6,83х1012/л, что в обоих случаях является физиологической нормой для крыс Wistar.
Таблица 7 - Влияние ЛС «АльгиноМАКС» при хроническом введении в желудок на секреторную функцию почек у крыс, оцениваемую по количеству фенолового красного, выведенного с мочой (мг/100 г веса) ( х ± ; п=5)
Сроки исследования (сутки) Дозы, мг/кг
Контроль 500 1000 2000
Самцы
Фон 0,495±0,033 0,430±0,040 0,408±0,057 0,380±0,016
28 0,310±0,021 0,267±0,028 0,246±0,015 0,253±0,018
60 0,155±0,026 0,154±0,030 0,100±0,008 0,131±0,036
Самки
Фон 0,505±0,038 0,467±0,044 0,536±0,051 0,514±0,053
28 0,235±0,021 0,255±0,026 0,280±0,023 0,221±0,029
60 0,114±0,020 0,099±0,013 0,128±0,14 0,121±0,013
Таблица 8 - Гематологические показатели и морфологический состав периферической крови у самцов крыс Wistar после хронического введения ЛС «АльгиноМАКС» ( х ± ; п=5)
Исследуемые показатели Экспериментальная группа. Дозы, мг/кг
контроль 500 1000 2000
28 суток
Лейкоциты, 109/л 7,9±0,87 7,2±0,60 6,2±0,74 5,9±0,62
Эритроциты, 1012 /л 6,52±0,11 6,54±0,03 6,64±0,18 6,83±0,13
Концентрация гемоглобина, г/л 116±2,40 114±2,01 118±1,08 121±1,85
Гематокрит, % 36,4±0,9 35,6±0,6 36,8±0,2 37,5±0,5
Нейтрофилы, % 20,4±5,4 26,9±4,4 20,4±0,9 20,2±1,6
Лимфоциты, % 76,3±5,1 71,2±4,0 77,2±0,9 76,6±1,9
«Средние клетки»*, % 3,3±0,5 2,4±0,4 2,8±0,3 3,6±0,6
Тромбоциты, 109/л 737±26,04 680±59,30 636±32,90 804±97,20
СОЭ, мм/час 1,5±0,4 1,6±0,4 1,7±0,3 1,6±0,5
60 суток
Лейкоциты, 109/л 7,6±0,28 6,3±0,51 5,3±0,7 29% p<0,05 5,6±0,48 26% p<0,05
Эритроциты, 1012 /л 7,00±0,24 6,64±0,11 6,92±0,13 7,00±0,21
Концентрация гемоглобина, г/л 122±3,72 119±0,87 123±1,81 123±2,71
Гематокрит, % 37,7±1,3 37,1±0,4 38,3±0,4 38,6±0,7
Нейтрофилы, % 23±2,1 23,7±1,7 24,4±5,2 20,6±3,1
Лимфоциты, % 74,9±2,1 74,6±1,6 68,7±4,5 74,1±3,6
«Средние клетки»*, % 2,1±0,3 1,7±0,2 2,7±0,4 3,0±0,1
Тромбоциты, 109/л 716±21 673±40 756±88 699±48
СОЭ, мм/час 1,5±0,4 1,6±0,3 1,7±0,4 1,8±0,3
Примечание: * - базофилы, моноциты, преимущественно эозинофилы.
Таблица 9 - Гематологические показатели и морфологический состав периферической крови крыс-самок Wistar после хронического введения ЛС «АльгиноМАКС» ( х ± ; п=5)
Исследуемые показатели Экспериментальная группа. Дозы, мг/кг
Контроль 500 1000 2000
28 суток
Лейкоциты, 109/л 7,3±0,81 4,9±0,64 6,8±1,28 5,9±0,54
Эритроциты, 1012 /л 6,21±0,16 6,04±0,21 6,03±0,15 6,32±0,10
Концентрация гемоглобина, г/л 118±1,60 113±4,23 115±1,04 117±1,88
Гематокрит, % 35,6±0,5 34,6±1,3 34,4±0,04 36,0±0,7
Нейтрофилы, % 27,7±5,0 27,2±4,4 30,9±5,0 22,5±2,6
Лимфоциты, % 69,2±4,8 70,3±4,4 67,0±5,0 74,2±2,7
«Средние клетки»*, % 3,1±0,3 2,5±0,4 2,2±0,03 3,3±0,4
Тромбоциты, 109/л 674±50,37 690±40,15 488±162,59 700±51,13
СОЭ, мм/час 2,6±0,24 2,4±0,24 2,75±0,48 2,4±0,40
60 суток
Лейкоциты, 109/л 5,4±0,24 5,1±0,44 4,3±0,54 6,3±0,35
Эритроциты, 1012 /л 6,3±0,13 6,5±0,16 6,39±0,2 6,43±0,22
Гематокрит, % 36,7±0,4 36,7±0,8 36,7±0,6 36,9±0,9
Нейтрофилы, % 26,0±1,3 20,7±1,6 23,6±0,3 27,1±1,4
Лимфоциты, % 70,0±1,9 77,8±1,9 74,2±2,4 70,5±1,4
«Средние клетки»*, % 3,2±0,2 2,9±0,1 2,8±0,3 2,5±0,1
Тромбоциты, 109/л 706±20 663±30 823±81 757±35
СОЭ, мм/час 2,6±0,2 2,7±0,3 2,8±0,4 2,9±0,3
Примечание: * - базофилы, моноциты, преимущественно эозинофилы.
Концентрация гемоглобина и эритроцитов в крови у контрольных крыс-самок через 28 суток составила 118±1,60 г/л и 6,21±0,16х1012/л , а у самок крыс, которым
вводили ЛС в диапазоне доз, эти показатели находились в пределах 113-117 г/л и 6,03-6,32*1012/л и достоверно не отличались от контрольных. Количество лей-
коцитов крови и лейкограмма в динамике 28-суточного ежедневного однократного введения ЛС «АльгиноМАКС» в испытуемом диапазоне доз существенно не изменялись у крыс обоего пола. К 60-м суткам хронического эксперимента продолжала наблюдаться спокойная картина морфологического состава периферической крови, при этом у крыс-самцов наблюдалось снижение количества лейкоцитов после введения антацидного средства в дозе 1000 мг/кг (29% р<0,05), которое с увеличением ежедневно вводимой дозы до 2000 мг/кг не усиливается (26% р<0,05). СОЭ колебалась в пределах контрольных величин, что может свидетельствовать об отсутствии
Результаты исследований, выполненных на 14-й и 28-й день испытания субхронической токсичности антацидного анти-рефлюксного препарата на крысах Wistar, показывают, что контрольные показатели были в пределах физиологической нормы для каждого пола животных. Так, по данным гемокоагулограммы, полученной у контрольных крыс-самцов, протромбино-вая активность крови, характеризующая внешний механизм свертывания крови, на 14-е сутки после ежедневного однократного введения составила 30,5±1,2 с, а на 28-е сутки - 31,3±1,4 с. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), характеризующее внутренний путь активации процесса свертывания, на 14-е сутки в контроле составило 25,5±1,7 с, а на 28-е - 26,5±2,1 с. Концентрация фибриногена на 14-е сутки в контрольной группе равна 2,5±0,2 г/л, а на 28-е сутки - 3,0±0,5 г/л. По данным гемокоагулограммы, получен-
признаков повреждения миелоидного кроветворения и воспалительных явлений.
Статистически значимых изменений в количестве тромбоцитов по отношению к контролю не отмечалось у животных всех подопытных групп. Таким образом, ЛС «АльгиноМАКС» при субхроническом введении не оказывает существенного влияния на гематологические показатели периферической крови, систему кроветворения, содержание гемоглобина и СОЭ, как в периоде введения, так и в восстановительный период (через 30 суток после отмены ежедневного введения).
Показатели гемокоагулограммы представлены в таблице 10.
ной у контрольных крыс-самок, протром-биновое время на 14-е сутки после ежедневного однократного введения составило 20,5±2,0 с, а через 28 суток - 24,3±1,8 с. АЧТВ через 14 суток составило 19,0±0,4 с, а на 28-е сутки - 19,6±0,7 с, концентрация фибриногена через 14 суток равна 2,3±0,3 г/л, а через 28 суток - 2,5±0,3 г/л. Как видно из показателей гемокоагулограммы крыс-самцов и крыс-самок, получавших антацидное средство в дозах 500, 1000, 2000 мг/кг в течение 14 и 28 дней, в таких показателях, как АЧТВ, протром-биновое время, фибриноген и количество тромбоцитов, статистически значимых различий не выявлено по сравнению с соответствующими данными у контрольных животных обоего пола. С увеличением продолжительности введения антацидного средства до 60 дней в таких показателях гемокоагулограммы, как АЧТВ и протром-биновое время, наблюдаются статистиче-
Таблица 10 - Влияние длительного интрагастрального введения в течение 14 и 28 дней ЛС «АльгиноМАКС» на показатели гемокоагулограммы крыс Wistar ( х ± ; п=5)
Показатели системы гемостаза Величины показателей гемокоагулограммы в периоды
После введения в течение 14 дней в дозах (мг/кг) После введения в течение 28 дней в дозах (мг/кг)
Контроль 500 1000 2000 Контроль 500 1000 2000
Самцы
Тромбоциты, х 109 /л 652±24,7 698±22,1 669±63,9 673±36,1 674±50,4 690±40,1 530±132,5 700±51,1
АЧТВ, с 25,5±1,7 25,9±1,4 26,6±1,5 27,0±0,9 26,5±2,1 24,5±1,9 24,4±1,8 27,2±1,7
Протромбиновое время, с 30,5±1,2 27,5±1,5 28,1±2,1 28,6±1,4 31,3±1,4 27,3±1,8 27,7±2,2 28,3±1,4
Фибриноген, г/л 2,5±0,2 2,4±0,1 2,1±0,1 2,2±0,1 3,0±0,5 2,8±0,5 2,7±0,4 2,5±0,5
Самки
Тромбоциты, х 109 /л 673±47,3 742±31,8 651±40,4 712±21,9 737±26,0 680±59,3 636±32,9 804±97,2
АЧТВ, с 19,0±0,4 21,4±0,8 19,0±1,0 20,6±0,6 19,6±0,7 21,5±1,2 18,8±0,9 21,3±0,4
Протромбиновое время, с 20,5±2,0 18,1±1,0 19,3±0,5 18,8±0,4 24,3±1,8 20,8±2,0 20,0 ±2,4 22,3±1,1
Фибриноген, г/л 2,3±0,3 2,2±0,1 2,3±0,3 2,3±0,3 2,5±0,3 2,3±0,3 2,3±0,4 2,3±0,2
ски значимые изменения. После введения в течение 60 дней у контрольных крыс-самцов протромбиновое время составило 31,3±2,0 с, а АЧТВ - 22,9±1,1 с. У крыс-самцов, получавших ЛС «АльгиноМАКС» в дозе 500 мг/кг ежедневно внутрижелу-дочно в течение 60 дней, изменения в показателе гемокоагулограммы «протромби-новое время» по сравнению с контролем незначительны. С увеличением вводимой дозы до 1000 и 2000 мг/кг этот показатель изменяется в сторону снижения соответственно на 29% (р<0,002) и 31% (р<0,001) по сравнению с контролем. АЧТВ при этом также снижается только при «высоких» дозах 1000 и 2000 мг/кг и не превышает 22% (р<0,01-0,02) по сравнению с контролем. Увеличение времени образования сгустка может свидетельствовать о наклонности к гиперкоагуляции. Через 60 суток эксперимента у контрольных крыс-самок про-тромбиновое время составило 25,6±1,5 с, а АЧТВ - 17,9±0,5 с. У крыс-самок также как и у самцов, длительно получавших ан-тацидное средство, протромбиновое время снижается только в группах животных после введения антацидного средства «Аль-гиноМАКС» в «высоких» дозах 1000 и 2000 мг/кг (28% и 35%; р<0,001), а АЧТВ у крыс-самок после введения антацидного средства в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг по сравнению с контролем не изменяется.
Таким образом, антацидное средство «АльгиноМАКС», вводимое внутрижелу-дочно в течение 60 дней только в «высоких» дозах, значительно превышающих «терапевтические для крыс» (1000 и 2000 мг/кг), приводит к достоверному изменению таких показателей гемокоагулограм-мы, как протромбиновое время и АЧТВ. Изменение этих показателей в сторону их снижения свидетельствует о повышении коагуляции, что, в свою очередь, возможно связано с повышением уровня кальция в плазме крови при длительном введении ЛС экспериментальным животным, так как в состав испытуемого средства входит кальция карбонат. Количество тромбоцитов в крови подопытных крыс-самцов и самок не претерпевало существенных отклонений и колебалось в пределах значений у контрольных групп животных.
В восстановительный период через 30 дней после окончания ежедневного однократного внутрижелудочного введения ЛС «АльгиноМАКС» в течение 60 дней существенных отличий в показателях гемо-коагулограммы не отмечено (таблица 11). Протромбиновое время и активированное парциальное (частичное) тромбопла-стиновое время снижено по сравнению с контролем только в группе крыс-самцов, получивших «максимальную» дозу анта-цидного средства, при этом количество
Таблица 11 - Показатели гемокоагулограммы крыс Wistar при однократном ежедневном интрагастральном введения ЛС «АльгиноМАКС» в течение 60 суток и в
восстановительный период ( х ± ; п=5)
Показатели системы гемостаза Величины показателей гемокоагулограммы в периоды
Самцы, дозы (мг/кг) Самки, дозы (мг/кг)
Контроль 500 1000 2000 Контроль 500 1000 2000
После введения в течение 60 дней
Тромбоциты, х 109 /л 716±20,8 673±39,6 756±87,7 699±48,3 706±20,7 663±29,8 823±80,5 757±3,5
АЧТВ, с 22,9±1,1 20,4±1,5 17,9±0,5 22%; р<0,01 17,9±0,7 22%; р<0,02 17,9±0,5 17,4±0,8 17,0±0,2 16,6±0,3
Протромбиновое время, с 31,3±2,0 27,3±0,9 22,3±0,7 29%; р<0,001 21,6±1,3 31%; р<0,001 25,6±1,5 22,7±0,9 18,4±0,6 28%; р<0,001 16,7±0,6 35%; р<0,001
Восстановительный период
Тромбоциты, х 109 /л 627±57 622±11 708±12 628±52 625±99 703±17 701±32 727±35
АЧТВ, с 21,7±1,3 20,5±1,4 18,9±0,5 17,3±0,3 20%; р<0,05 19,6±1,6 16,6±0,2 17,6±0,4 17,3±0,2
Протромбиновое время, с 27,1±0,5 24,9±1,2 24,5±0,7 20,7±1,1 24%; р<0,001 19,2±1,5 20,7±0,8 21,5±0,8 20,9±1,7
тромбоцитов в крови крыс обоего пола не претерпевало существенных отклонений и колебалось в пределах значений у контрольных групп животных.
Макроскопическое изучение органов и тканей экспериментальных животных было выполнено после окончания 28- и 60-дневного ежедневного внутрижелудочного введения изучаемого антацидного средства «АльгиноМАКС» и в восстановительный период после отмены введения. Животных вывели из эксперимента мгновенной дека-питацией, вскрыли и провели макроскопическую оценку внутренних органов, после чего органы удалили, взвесили и определили относительные индексы внутренних органов. Результаты осмотра показали, что все животные в опытных группах крыс-самцов и самок Wistar, получивших терапевтические и максимальные дозы изучаемого средства, введение которых было технически осуществимо, к концу эксперимента были правильного телосложения. Все крысы имели сплошной волосяной покров, опрятный вид, гладкую блестящую шерсть, зубы сохранены, видимые слизистые оболочки и кожные покровы нормальной окраски, очагов облысения не определяется. Половые органы самцов развиты правильно, деформации или отека конечностей нет. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали.
При макроскопическом исследовании видовых и половых отличий, а также влияния пути введения на состояние внутренних органов не установлено. При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечалось. Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы имели овальную или округлую форму, однородный розоватый или желтоватый цвет и умеренную плотность. Щитовидная железа плотно прилежала к гортани, имела обычные размеры и плотность, розовато-красноватый цвет. Тимус имел треугольную форму, беловатый цвет и умеренно плотную консистенцию. Величина и форма сердца изменений не представляли. Мышца сердца была коричневатой, плотной. Поверхность легких имела бледно-розовую окраску; легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую окраску. Слизистая оболочка внелегочных бронхов была гладкой, блестящей, бледно-розовой. Желудок имел
обычную форму и размеры, просвет был заполнен кашицеобразным пищевым содержимым. Слизистая тела желудка была бледно-розовой, блестящей, складчатой. Слизистая тонкой и толстой кишки была блестящей, гладкой. Величина и форма печени изменений не представляли. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию. Поджелудочная железа была бледно-розовой, дольчатой. Величина и форма почек не отличались от контроля, капсула легко снималась. Поверхность органа была гладкой, однородной, коричневато-сероватой окраски. На разрезе почек отчетливо различались корковое и мозговое вещества. Форма, размеры и плотность надпочечников, яичников или семенников не отличались от контрольных. Селезенка имела темно-вишневый цвет, гладкую поверхность и плотноватую консистенцию. Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество головного мозга имело умеренную плотность. Расширения желудочков мозга не наблюдалось. Массовые коэффициенты внутренних органов животных, получавших ЛС «Аль-гиноМАКС», не имели каких-либо существенных отклонений как по отношению к контролю, так и по сравнению с видовой нормой, что можно расценить как результат отсутствия хронического токсического действия антацидного препарата.
В экспериментах по оценке возможного сенсибилизирующего действия по тесту опухания лапы мышей установлено, что показатели аллергизации мышей линии DBA/2 при внутрикожном введении ЛС «АльгиноМАКС» подопытным животным статистически значимо не различались от таковых показателей у контрольных животных по абсолютному показателю ТОЛМ (таблица 12). Уровень сенсибилизации составил 2%; р > 0,05 и 6%; р > 0,05 соответственно у самцов и самок по сравнению с контрольными значениями.
Как показали исследования, внутри-кожная сенсибилизация мышей линии DBA/2 антацидным препаратом по изменению (разнице) в уровне жидкости при погружении опытной лапы существенно не отличалась от такового при погружении контрольной лапы (неиммунизированной) по абсолютному показателю ТОЛМ (4%; р>0,05 и 6%; р>0,05 у самцов и самок соответственно).
Таблица 12 - Показатели аллергизации мышей линии DBA/2 при внутрикожном тестировании «АльгиноМАКС» ( х ± 3-; п=5)
Показатель ТОЛМ Пол Контроль Антацидное средство «АльгиноМАКС»
Правая лапа (неиммунизи-рованная) Левая лапа (опытная) Правая лапа (неиммунизи-рованная) Левая лапа (опытная)
Абсолютные значения, мл Самцы 0,054 ± 0,002 0,058 ± 0,002 7% (по сравнению с правой лапой) 0,057 ± 0,002 6% (по сравнению с контролем) 0,050 ± 0,002 2% (по сравнению с контролем) 4% (по сравнению с правой лапой)
Самки 0,048 ± 0,002 0,051 ± 0,002 6% (по сравнению с правой лапой) 0,051 ± 0,002 6% (по сравнению с контролем) 0,054 ± 0,002 6% (по сравнению с контролем) 6% (по сравнению с правой лапой)
Примечание: достоверных различий с контрольной группой животных не выявлено (р > 0,05).
Результаты проведенного эксперимента на мышах линии DBA/2 показали, что ЛС «АльгиноМАКС» с учетом статистической значимости среднегрупповых показателей аллергологического тестирования (ТОЛМ) в опыте по сравнению с контролем по ^критерию Стьюдента, а также по частоте положительных тестов аллергодиагностики относится к IV классу аллергенной активности (слабым аллергенам) [3].
Для оценки эмбриотоксического действия лекарственного средства «Альгино-МАКС» изучали показатели антенатального развития и состояние потомства в
постнатальном периоде жизни. Из данных, представленных в таблице 13, следует, что внутрижелудочное введение изучаемого средства в дозе 500 мг/кг на протяжении периода беременности статистически значимо не повлияло на прирост массы тела беременных самок, количество крысят в помете, массу и краниокаудальный размер новорожденных крысят по сравнению с контрольными животными. Гибели беременных самок и новорожденных крысят не было. То есть, ЛС «АльгиноМАКС» по исследованным показателям антенатального развития не обладает эмбриотоксиче-ским действием.
Таблица 13 - Влияние интрагастрального введения ЛС «АльгиноМАКС» в дозе 500 мг/кг беременным самкам крыс Wistar на антенатальное развитие потомства
Показатели эмбриотоксического действия Контроль ЛС «АльгиноМАКС»
Летальность беременных самок 1/15 0/12
Летальность крысят 0/135 0/124
Прирост массы тела беременных самок, г/день 6,04±0,51 6,83±0,53
Количество крысят в помете 9,00±0,73 10,33±0,51
Масса новорожденных крысят, г 5,97±0,06 6,10±0,07
Краниокаудальный размер новорожденных крысят, мм 64,10±0,51 64,45±0,47
Примечание: достоверных различий не выявлено (р>0,05).
Обнаруженные в результате проведения теста «открытое поле» отличия в поведенческих реакциях потомства в возрасте 1 месяц после ежедневного однократного интрагастрального введения исследуемого средства в дозе 500 мг/кг беременным самкам крыс Wistar приведены в таблице 14.
Из таблицы 14 видно, что после введения антацидного средства беременным самкам наблюдается повышение общей двигательной активности (горизонтальной
и вертикальной) потомства по сравнению с контролем. В случае горизонтальной активности различие имеет высокую статистическую достоверность (154%; р<0,001), вертикальной - выявлена тенденция увеличения по сравнению с контрольным уровнем на 36%; р>0,05.
Уровень эмоционального состояния экспериментальных крысят в тесте «открытое поле» оценивали также по такому показателю, как количество дефекаций.
В опытной группе наблюдается статистически достоверное увеличение количества болюсов на 99%; р<0,05 по сравнению с контролем. Оценка диуреза в тесте «открытое поле» выявила тенденцию на увеличение их количества у потомства крыс, получавших ЛС «АльгиноМАКС» на протяжении беременности, которая достигала 114%; р>0,05 относительно контроля. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что введение ГЛФ исследуемого средства крысам во время беременности приводит к повышению эмоционального состояния потомства по показателям уровня диуреза и количества дефекаций. Испытания эмбриотоксиче-ского действия антацидного средства не выявили статистически достоверных различий ориентировочно-исследовательского поведения по этому показателю. Груминг (косметическое поведение) крыс является важной характеристикой поведе-
Таким образом, изучение эмбрио-токсического и гонадотоксического действия ЛС «АльгиноМАКС» показало, что его ежедневное однократное интра-гастральное введение в дозе 500 мг/кг (с первого до последнего дня беременности) не приводит к гибели и не влияет на динамику массы тела беременных самок. ЛС «АльгиноМАКС» не оказывает отрицательного влияния на количество крысят в помете, массу тела и краниокау-дальный размер новорожденных крысят. То есть, по исследованным показателям антенатального развития ЛС «Альгино-МАКС» не обладает эмбриотоксическим действием.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе изучены токсикологические свойства ЛС «АльгиноМАКС». Резуль-
ния животных в «открытом поле», тесно коррелирует с двигательной активностью. Косметические движения (груминг) у потомства крыс, получавших ЛС «Альги-ноМАКС» на протяжении всего периода беременности, и потомства контрольных крыс статистически значимо не различаются за период наблюдения в «открытом поле». Анализируя результаты, полученные в тесте «открытое поле», наблюдается повышение общей двигательной активности у потомства подопытных животных по сравнению с потомством контрольных животных, что может свидетельствовать о повышении уровня ориентировочно-исследовательского поведения в результате введения ЛС «АльгиноМАКС» на протяжении периода беременности. При этом повышается уровень эмоционального состояния животных (испуг, тревога, неуверенность). Об этом свидетельствует уровень дефекаций и диуреза.
таты, полученные в остром, субхроническом и хроническом опыте на двух видах лабораторных животных обоего пола: мышах JCR и крысах Wistar при двух путях введения - интрагастральном и внутри-брюшинном, позволяют отнести его к относительно безвредным лекарственным средствам (VI класс токсичности по классификации OECD). ЛС «АльгиноМАКС» в дозах, превышающих СТД (до 4 раз) (per os; однократно), не вызывает летальности у мышей ICR и крыс Wistar, при дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг (per os; 2 мес) не вызывает токсических дегенеративных изменений в обследованных органах и системах крыс и мышей обоего пола, не проявляет местно-раздражающего, сенсибилизирующего и аллергизирующего действия, не оказывает эмбриотоксиче-ского действия, не влияет на постнаталь-ное развитие потомства.
Таблица 14 - Влияние интрагастрального введения ЛС «АльгиноМАКС» в дозе 500 мг/кг беременным самкам крыс Wistar на двигательную активность и параметры эмоциональной реакции потомства в тесте «открытое» поле ( х ± ; п=20-25)
Характеристика поведения (количество актов) Контроль(n=25) «АльгиноМАКС» (n=20)
Горизонтальная активность 6,68±1,07 17,00±1,91 154%; р<0,001
Вертикальная активность 5,96±0,85 8,10±1,06 36%; р>0,05
Норковый рефлекс 0,48±0,13 0,60±0,18
Груминг 1,88±0,30 1,75±0,40
Болюсы 0,68±0,16 1,35±0,21 99%; р<0,05
Диурез 0,28±0,09 0,60±0,15 114%; р>0,05
Таким образом, результаты доклинического изучения общей токсичности ан-тацидного средства «АльгиноМАКС», обладающего антирефлюксным действием, свидетельствуют об отсутствии местного и системного токсического действия ЛС при однократном и длительном интрага-стральном введении.
SUMMARY
U. М. Nasek, О. V. Vinnikova,
Е. U. Sanko-Schyslionоk, M. V. Makarenko, P. T. Petrov
PRECLINICAL TOXICITY STUDY OF A NEW ANTIREFLUX ANTACID DRUG «ALGINOMAX»
Preclinical toxicological study of safety of antireflux antacid drug «AlginoMAX» were carried out. No animals were lost after «AlginoMAX» acute oral administration at a maximum dose of 5500 mg/kg in male and female rats and mice. Also it does not cause lethality in male and female rats at a single in-traperitoneal introduction at the dose of 1300 mg/kg. «AlginoMAX» administered per os during 2 months in rats (both males and females) at the doses of 500, 1000 and 2000 mg/kg induced no irreversible pathological changes in organs and systems studied. The tested antireflux antacid drug «AlginoMAX» exhibited no allergenic activity, local irritation and did not affect generative function and the antenatal and postnatal development of progeny.
Keywords: аntireflux antacid drug, medicinal form, acute toxicity, subchronic and chronic toxicity, allergenicity, hemocoagulo-gram, sensibilization, embryotoxicity toxic-ity, gonadotoxicity, laboratory animals.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фармацевтическая композиция в качестве субстанции антирефлюксного антацидного препарата: пат. 17792 Респ. Беларусь / С. А. Усанов, М. В. Гаврилов, М. В. Макаренко, Г. А. Ильянок, О. А. Ка-зючиц Д. И. Демид, П. Т. Петров; дата публ.: 30.12.2013, Афщыйны бюл. / Нац. цэнтр штэлектуал. уласнасщ. - 2013. -№ 6. - С. 157.
2. Альгиномакс - антирефлюксный
антацидный препарат / М. В. Макаренко [и др.] // Белорусские лекарства: материалы Междунар. научно-практической конференции, Минск, 27-28 ноября 2014 г. / Ин-т биоорганической химии НАН Беларуси; редкол.: С. А. Усанов [и др.]. -Минск, 2014. - С. 118-123.
3. Технический кодекс установившейся практики «Надлежащая лабораторная практика». Основные положения: ТКП 125-2008 (02040). - Введ. 01.05.2008. -Минск, 2008. - 35 с.
4. Irwin, S. Drug screening and evaluation of new compounds in animal. Animal and clinical techniques in drug evaluation / S. Irwin, J. Nodine, P. Siegler. Chicago: Year book medical, 1964. - P. 36-40.
5. Morpurgo, C. A new design for the screening of CNS-active drugs in mice. A multidimentional observation procedure and the study of pharmacological interactions / С. Morpurgo // Arzneimitted-Forsch. (Drug. res.). - 1971. - Vol. 21, № 2. - P. 1720-1733.
6. Требования к постановке экспериментальных исследований для первичной токсикологической оценки и гигиенической регламентации веществ. Инструкция 1.1.11-12-35-2004: утв. Главным гос. санитарным врачом Республики Беларусь 14.12.2004: - Минск, 2004. - 44с.
7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / М-во здравоохранения и соц. развития Рос. Федерации; редкол.: А. Н. Миронов [и др.]. - М.: Гриф и К, 2012. -Ч. 1. - С.13-17.
8. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - Москва: Практика, 1999. - 459 с.
9. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия) / Академия медицинских наук СССР; под ред. И.В. Саноцкого. - М.: Медицина, 1970. - 343 с.
Адрес для корреспонденции:
220141, Республика Беларусь, г. Минск, ул. акад. Купревича, 5, кор. 2, ГНУ «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси», тел. 8 (017) 369-87-72, +375(29) 685-70-40, e-mail: [email protected], Петров П. Т.
Поступила 29.08.2016г.
