CC BY
121
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 14 (18)2009
IZ VESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 14 (18)2009
УДК 577.3
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ПРИНАДЛЕЖНОСТИ БЕЛКА С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 57 кДа К СИСТЕМЕ АТФ-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО КАЛИЕВОГО ТРАНСПОРТА
В МИТОХОНДРИЯХ
© А.А. НЕДОРУБОВ, А.К. ВЕЛИЧКО Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского,
кафедра биохимии e-mail: shadowthorn@rambler.ru
Недорубов А.А., Величко А.К. - Доказательство принадлежности белка с молекулярной массой 57 кДа к системе АТФ-чувствительного калиевого транспорта в митохондриях // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2009.
№ 14 (18). С. 53-58. - Изучена структура и локализация в клетке белка, формирующего в БЛМ АТФ- зависимые селективные по калию каналы. Белок выделяется из митохондрий печени крысы в электрофоретически гомогенном состоянии. Изоэлектрическая точка белка определялась величиной 5.0 ± 0.2. Методом MALDI-TOFустановлено, что изучаемый белок обладает высокой степенью структурной гомологии с предшественником кальретикулина. Получены поликлональные антитела (AT) на этот белок. Проведены электронно-микроскопическое исследование срезов тканей печени и сердца крысы после их инкубации с АТна изучаемый белок и визуализации белка вторичными AT, меченными коллоидным золотом. Гранулы коллоидного золота были обнаружены как в мембранах митохондрий, так и мембранах эндоплазматического и саркоплазматического ретикулумов, причем в митохондриях сердца их значительно больше, чем в митохондриях печени. Обнаружение белка в митохондриях и ретикулуме, а также выявление общности в структуре между митохондриальным каналом и белком предшественником кальретикулина может указывать на принадлежность изучаемого белка к семейству кальретикулинов. Обсуждается возможная функция изучаемого белка-канала в качестве канальной субъединицы митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала.
Ключевые слова: митохондрии, белки
Nedorubov A.A., Velichko A.K. - Evidence of the protein's with m.w. 57 kda affiliation with system of atp-depen-dent potassium transfer in the mitochondria // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2009. № 14 (18).
P. 53-58. - The structure and localization in cell of the protein, which formed in blm the atp- dependent potassium-selective channels, were studied. The protein is isolated from rat liver mitochondria in electrophoretical homogenous state. An isoelectric point of the protein is equal to 5.0+/-0.2.Uusing the maldi-tof analysis it was found that the studied protein possessed a high level of structure homology with calreticulin precursor. Polyclonal antibodies (ab) against the protein were obtained. the electron-microscope investigation of rat liver and heart tissue sections after their incubation with ab against the studied protein and visualization of the protein with secondary ab conjugated by colloid gold were carried out. The colloid gold particles were observed both in mitochondrial membranes and in membranes of endoplasmic and sarcoplasmic reticulum. In heart mitochondria these particles was significantly greater then in liver mitochondria. The detection of the channel-protein localization both in mitochondria and reticulum, as well as the revelation of structure community between the mitochondrial channel and the precursor of calreticulin suggests that the channel-protein can belong to calreticulin's family. The possible function of the studied protein as a channel subunit of the mitochondrial atp-dependent potassium channel is discussed. Keywords: mitochondria, proteins.
АТФ-чувствительные каналы внутренней мембраны митохондрий (митоКАТф) были обнаружены в начале 90-х годов методом пэтч-кламп [1]. К тому времени подобные каналы были уже обнаружены в ци-топлазматической мембране (цитоКАТф) [2]. Однако, еще в 1981 году в нашей лаборатории из митохондрий сердца быка был выделен К+-транспортирующий бе-
лок, который при встраивании в бислойную липидную мембрану (БЛМ) был способен формировать селективные для калия каналы [3], чувствительные к АТФ [4, 5]. В настоящее время канал, обладающий подобными свойствами, обнаружен во внутренней мембране митохондрий многих тканей, включая лимфоциты, методом печ-кламп [1, 6-8], а также при реконструкции
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ им. В. Г. Белинского • Естественные науки • № 14 (1S) 2009 г.
в БЛM очищенных белков и мембранных фрагментов митохондрий [9-11]. Несмотря на то, что митоКАТф обнаружен в митохондриях многих тканей, его структура до сих пор не выяснена.
Структура цитоКАТф в настоящее время достаточно хорошо изучена. В его состав входят субъединицы двух типов: KIR (inward rectifying K+ channels) -субъединица, формирующая пору канала, и SUR (sulphonylurea receptor) - регуляторная субъединица, придающая каналу чувствительность к модуляторам [12, 13]. Считается, что цитоплазматический КАТф канал представляет собой комплекс из четырех KIR и четырех SUR субъединиц [14]. Однако механизмы молекулярного взаимодействия KIR и SUR в этом канале в настоящее время окончательно не выяснены.
В связи с наличием у обоих каналов общих ингибиторов и активаторов, существует гипотеза о возможном сходстве их структуры. Ранее нами была разработана рабочая модель структуры митоКАТф канала, в соответствии с которой в его состав также входит четыре канальных субъединицы, имеющие выпрямляющие характеристики и названные нами митоKIR и четыре регуляторных субъединицы [15]. При этом выделенный нами ранее из митохондрий белок c м.м. около 60 кДа [3] формирующий в БЛM АТф-ингиби-руемые каналы [4-5], принят нами в этой модели за канальную субъединицу [15]. Однако эта гипотеза требует дальнейшего подтверждения.
Целью настоящей работы было изучение структуры выделяемого нами из препарата митохондрий канального белка уточнение его молекулярной массы и определение ее локализации в клетке, используя антитела (АТ) к белку-каналу.
материал и методика
Получение и очистка антител к митохондри-альному К+-транспортирующему белку
к+-транспортирующий белок для иммунизации был выделен и очищен по описанной ранее схеме [4]. В качестве доноров иммунной сыворотки использовали лабораторных кроликов массой 2.4-2.6 кг. Схема процедуры иммунизации была подобрана в соответствии с требованиями декларации совета Европейского Союза 86/609/EEC.
За неделю до иммунизации у животных проводили забор крови из ушной вены в количестве 2-3 мл. Полученную из этой крови сыворотку в дальнейшем использовали в качестве отрицательного контроля. Антиген (80-100 мкг электрофоретически чистого митохондриального к+-транспортирующего белка, растворенного в 0.4 мл 0.9 % NaCl) тщательно смешивали с 0.6 мл полного адъюванта фрейнда (Sigma, USA) и вводили животным подкожно в область лопаток десятью последовательными инъекциями по 100 мкл на небольшом расстоянии друг от друга. Через 2, 6 и 10 недель проводили повторные иммунизации по той же схеме, используя неполный адъювант фрейнда (Sigma, USA). Через 7 дней после последней инъекции антигена брали кровь из ушной вены (50 мл) и путем центрифугирования (7000 g) полу-
чали обогащенную антителами сыворотку, которую смешивали с глицерином в соотношении 1:1 и хранили при температуре -20°С.
Перед очисткой иммуноглобулинов в имеющейся сыворотке измеряли концентрацию белка на спектрофотометре Shimadzu UV-2401 РС (Япония) при длине волны 280 нм. Сыворотку разводили 0.1М Na-фосфатным буфером, pH 7.0 до концентрации белка ~2 мг/мл. Разведенную сыворотку, из расчета 20 мг общего белка, наносили на колонку объемом 1 мл, упакованную конъюгированной с белком A се-фарозой (Amersham, Sigma, USA). После нанесения сыворотки колонку промывали тем же буфером до полного отсутствия белка в элюате. Наличие белка в элюате регистрировали при помощи Uvicord S-II LKB (Швеция).
IgG элюировали с колонки 0.1М Na-цитрат-ным буфером, pH 3.0. Элюат немедленно титровали 1М Трис-HCl, pH 9.0 до pH 7.0. Затем колонку отмывали 0.1 М Na-фосфатным буфером до pH 7.0.
Концентрацию белка в элюате измеряли на спектрофотометре Shimadzu uV-2401 РС (япония) при длине волны 280 нм. Чистота IgG проверялась при помощи денатурирующего электрофореза в полиакрила-мидном геле по методу Лэммли [16]. Очищенные IgG разводили глицерином в соотношении 1:1 и хранили при температуре -20°С.
Вестерн-блот анализ
Митохондрии печени и сердца, а также очищенный митохондриальный К+-транспортирующий белок наносили на ДСН-полиакриламидный гель и проводили электрофорез в денатурирующих условиях [16], используя камеру Mini-protein (BioRad, США). Нагрузка на полосу геля составляла 5-10 мкг суммарного белка митохондрий и 1-2 мкг очищенного К+-транспортирующего белка. Затем осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану при напряжении 7 вольт/см2 в течение двух часов. После переноса мембрану блокировали 30 мин в PBS-Tween-20-буфере, содержащем 0.15 М NaCl, 0.02 М NaH2P04 • 12 Н2О, рН 7.4, 0.1% Твин-20 и затем инкубировали 1 час с полученными нами очищенными антителами к к+-транспортирующему белку, разведенными в соотношении 1:500 PBS-Tween-20-молоко буфере, содержащем 0.15 М NaCl, 0.02 М NaH2P04 • 12 Н2О, рН 7.4, 0.1% Твин-20, 2% сухого молока (Amersham, Германия). После отмывания в PBS-Tween-20-буфере мембрану инкубировали 1 час с вторичными антителами, конъюгированными с пе-роксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG, AbD Serotec, UK), разведенными 1:1000 и затем снова отмывали 1 час в PBS-Tween-20-буфере. Визуализацию полос осуществляли с помощью окрашивания 3'3-диами-нобензидинтетрагидрохлорида (DAB) (Sigma, USA), растворенного в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5 и 0.02% Н2О2.
Двумерный электрофорез проводили по методу О'Фаррелла [17] в 10% ДСН-ПААГ с последующей изоэлектрофокусировкой в области рН -4.5-11.
биохимия ►►►►►
MS-MALDI-TOF/TOF- анализ был выполнен на базе ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН им. В.Н. Ореховича. Очищенный митохондриальный К+-транспортирующий белок подвергали ферментативному гидролизу трипсином в денатурирующих условиях в геле. Пептидную смесь из геля экстрагировали ацетонитрил/гидрокарбонат аммонием и затем проводили масс-спектральный анализ на времяпро-летном масс-спектрометре Ultraflex (Bruker, Daltonik) в режиме моноизотопической детекции 300-1800 Да. Масс-спектры анализировались через базу данных MSDC и NCBI программой Mascot (http://www.ncbi. nlm.nih.gov).
Иммунноэлектронная микроскопия. Ткань печени и сердца фиксировали в 4%-ном растворе па-раформальдегид/0.05% глутаровый альдегид в PBS -буфере (16.7 мМ Na2HP04- 12 Н20, 3.3 мМ KH2P04, 150 мМ NaCl, рН 7,4) в течение 4 ч при 4°С. Обезвоживание в спиртах и пропитку образца смолой LR-White (Sigma, USA) проводили при 4°С. Полимеризацию смолы осуществляли под ультрафиолетом в течение 48 часов при комнатной температуре. ультратонкие срезы готовили на ультратоме UC6 (Leica, Германия) и помещали на золотые сеточки, покрытые формва-ровой пленкой и укрепленные углем (Agar). Неспецифическое окрашивание блокировали обработкой
раствором, содержащим 3% БСА и 0.5% желатина в течение 1ч. Все дальнейшие процедуры проводили в PBS содержащем 1% БСА и 0.01% тритон Х-100. После каждой инкубации образцы отмывали PBS- буфером, содержащим 0.1% тритон Х-100 и 0.1% глицин и затем в растворе БСА и желатина в течение 20 мин [18]. В качестве первичных антител были использованы полученные нами антитела к митохондриальному К+-транспортирующему белку (в разведении 1:100), инкубацию с которыми проводили в течение ночи при 4°С. После тщательной отмывки сеточки с образцами помещали на каплю вторичных антител, меченных коллоидным золотом с размером гранул 10 нм (Anti-Rabbit IgG, Sigma, USA) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После отмывки образцы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали под электронным микроскопом Tesla BS-500 (Чехословакия). Специфичность метода проверяли заменой первичных антител на буфер.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенный нами электрофорез в ПААГ выделенного из митохондрий белка-канала в присутствии метчиков средней молекулярной массы, включая белок с м.м. 55 кДа показал, что эта канальная субъединица имеет молекулярную массу 57 кДа (рис.1а)
Рис. 1. ДСН-электрофорез, Вестерн-блот анализ и изоэлектрофокусировка митохондриального К+-транспортирующего белка. А - ДСН-электрофорез митохондрий (МХ) печени и сердца крыс и выделенного из них К+-транспортирующего белка (Б); Б - Вестерн-блот анализ митохондрий печени и сердца крыс и выделенного из них К+-транспортирующего белка; В - Двумерная электрофореграмма белка-канала окрашивание кумасси голубым Р-250, комбинация амфолинов 4.5-10. По оси абсцисс - значения изоэлектрической точки, по оси ординат - значения молекулярной массы. Стрелкой обозначен идентифицированный белок.
На белок-канал, выделенный из печени крысы, были получены поликлональные АТ, с высоким титром (1:50000). При этом титр АТ после очистки на колонке наполненной конъюги-рованной с белом А сефарозой практически не менялся.
Методом Вестерн-блот установлено, что в суспензии митохондрий печени и сердца полученные АТ связывались только с белком, находящимся в районе 57 кДа, но не с другими белками митохондрий печени
и сердца (Рис.1б), что свидетельствует об их высокой специфичности.
двумерный электрофорез белка-канала показал, что он является электрофоретически чистым (рис. 1в). Как следует из рисунка, изоэлектрическая точка белка определяется величиной 5.0+/-0.2.
Проведенный MS-MALDI-TOF/TOF анализ изучаемого белка-канала показал, что он на 54% гомологичен белку-предшественнику кальретикулина (база данных МСВ!*) (рис. 2).
биохимия ►►►►►
К ' jL • 4 * . ■R
. г ' i f v
9 •
* , Ф. •
'.* t
' '' ' • « •
• « * 1 а
Рис. 4. Электронная микроскопия эндоплазматический ретикулум (ЭР) на срезе гепатоцитов крысы. а - Срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку; б - Контроль только со вторичными антителами. Черные гранулы- сайты связывания антител с ЭР. Шкала 0, 2 мкм.
Рис. 5. Митохондрии и саркоплазматический ретикулум (СР) на срезе кардиомицитов крысы. а - срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку; б - контроль (Первичные антитела заменены буфером). Черные гранулы - сайты локализации К+-транспортирующего белка с м.м. ~ 57 кДа в митохондриях, а также сайты связывания антител с СР. Шкала 0, 2 мкм.
ся эти гранулы ближе к месту контакта внутренней и внешней мембраны митохондрий. В 16 препаратах митохондрий сердца из 24 был обнаружен такой характер локализации белка.
В ткани сердца гранулы были обнаружены и в саркоплазматическом ретикулуме (СР), однако в значительно меньшем количестве, чем в ткани печени. В контрольных экспериментах на тканях сердца гранулы коллоидного золота не выявлены ни в митохондриях, ни в СР (рис. 5б).
Иммунохимическое обнаружение в митохондриях белка, формирующего в БЛМ АТФ-зависимые калий селективные каналы, согласуется с полученными нами ранее данными об ингибировании этими АТ АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях [21]. Совокупность этих данных подтверждает высказанное нами ранее предположение [15] о принадлежности выделенного из митохондрий белка-канала имеющего м.м. 57 кДа к митохондриальной системе АТФ-зависимого транспорта калия. Мы полагаем, что этот белок, вместе с глибенкламид-связывающими белками
митохондрий [22, 23], входит в состав митохондриаль-ного АТФ-зависимого калиевого канала, являясь его канальной субъединицей (митоКШ).
Благодарности: авторы благодарят Ковалева А.И. (Институт Биохимии им. Баха РАН) за проведение двумерного электрофореза и Торопыгина И.Ю. (ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН им. В.Н. Орехо-вича) за проведение MS-MALDI-TOF/TOFанализа. Работа поддержана грантами РФФИ № 07-04-00759а, ISTC-3301 и программой «Развитие научного потенциала высшей школы» № 3840.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Inoue I., Nagase Н., Kishi К. & Higuti T. ATP-sensi-tive K+ channel in the mitochondrial inner membrane // Nature. 1991. V. 352. P. 244-247.
2. Noma А. ATP-regulated K+ Channels in cardiac muscle // Nature. 1983. V. 305. P. 147-148.
3. Миронова Г., Федотчева H., Макаров П., Проневич Л., Миронов Г.П. Белок из митохондрий сердца быка, индуцирующий канальную калиевую проводимость
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ им. В. Г. Белинского • Естественные науки • № 14 (18) 2009 г.
бислойных липидных мембран // Биофизика. 1981. Т. 26(3). P. 451-457.
4. Миронова Г., Скарга Ю., Григорьев С., Яров-Яровой В.М., Александров A.B., Коломыткин О.В. АТР-за-висимый калиевый канал митохондрий печени крысы. I. Выделение, очистка и реконструкция канала в БЛМ // Биологические мембраны 1996. Т.13. № 4. С. 396-404.
5. Mironova G.D., Skarga Yu.Yu., Grigoriev S.M., Nego-da A.E., Kolomytkin O.V., Marinov B.S. Reconstitution of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel into bilayer lipid membrane // J. Bioenerg. Biomembr. 1999. V. 31(2). P. 157-161.
6. DahlemY., Horn T., Butinas L., Gonoi T.,Wolf T., SiemenD. The human mitochondrial KATP channel is modulated by calcium and nitric oxide: a patch-clamp approach // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1656. P. 46-56.
7. Fikret E., Guido M., Gassanov N. Testosterone induces cytoprotection by activating ATP-sensitive K+ channel in the cardiac mitochondrial inner membrane // Circulation. 2004. V. 110(19). P. 3100-3107.
8. Bednarczyk P., Dolowy K., Szewczyk A. Matrix Mg2+ regulates mitochondrial ATP-dependent potassium channel from heart // FEBS. 2005. V. 579. P. 1625-1632.
9. Paucek P., Mironova G., Mahdi F., Beavis F., Wolde-giorgis G., Garlid K.D. Reconstruction and partial purification of the glibenclamide-sensitive, ATP-sensitive K+ channel from rat liver and beef heart mitochondria // J. Biol. Chem. 1992. V. 267(36). P. 26062-26069.
10. Zhang D., Chen Y., Campbell W., Zou A., Gross G., Li P. Characteristics and suproxide-induced activation of reconstituted myocardial mitochondrial ATP-sensitive potassium channel // Circ. Res. 2001. V. 89. P. 1177-1173.
11. Bednarczyk P., Dolowy K., Szewczyk A. New properties of mitochondrial ATP-regulated potassium channel // J.Bioenerg. Biomembr. 2008. V. 40(4). P. 325-335
12. Yokoshiki, Hisashi, Sunagava M., Seki T., Sperelakis N. ATP-sensitive K+ channels in pancreatic, cardiac, and vascular smooth muscle cells // Am. J. Physiol. 1998. V. 274 (Cell Physiol. 43). P. C25-C37.
13. Tucker S.J., Gribble F.M., Zhao C., Trapp S. and Ashcroft F.M. Truncation of Kir6.2 produces ATP-sensi-tive K+ channels in the absence of the sulphonylurea receptor // Nature. 1997. V. 387. P. 179-183.
14. Aguillar-Bryan L., Nichols C., Wechesler S., Clement J., Boyd A., Gonzales G., Herrera-Sosa H., Nguy K., Nelson D. Cloning of the beta cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin secretion // Science. 1995. V. 268. P. 423-426.
15. Mironova G., Negoda A., Marinov B., Paucek P., Costa A., Grigoriev S., Skarga Yu., Garlid K. Functional distinctions between the mitochondrial ATP-dependent K+ channel (mito KATP) and its inward rectifier subunit (mitoKIR) // J.Biomemb. Chem. 2004. V. 279(31). P. 32562-32568.
16. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227(5259). P. 680-685.
17. O'Farrell P.H. High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. V.250. P. 4007-4021.
18. Васильева В.С., Лушникова А.Л., Павлик Л.Л., Мош-ков Д.А., Бровко Ф.А. Разработка метода для имму-ноцитохимического исследования локализации цито-кин-связанного белка СВР70 в проростках кукурузы // Физиология растений. 2008. Т. 55. №4. С. 552-559.
19. Fliegel L., Burns K., Opas M., Michalak M. The high-affinity calcium binding protein of sarcoplasmic reticulum. Tissue distribution, and homology with calregulin // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 928. P. 1-8.
20. Bajgar R., Seetharaman S., Kowaltowski A.J. , Garlid K.D., andPaucek P. Identification and properties of a novel intracellular (mitochondrial) ATP-sensitive potassium channel in brain // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 33369-33374.
21. Скарга Ю.Ю., Долгачёва Л.П., Федотчева Н.И, Миронова Г. Влияние антител к митохондриальному К+-транспортирующему белку на транспорт К+ в митохондриях печени крысы // Укр. биохим. журн. 1987. Т. 59. № 6. С. 54-59.
22. Szewczyk A., Marban Е. Mitochondria: a new target for K+ channel openers? // Trends Pharmacol. Sci. 1999. V. 20. P. 157-161
23. Jaburek M., Yarov-Yarovoj V., Paucek P., Garlid K.D. State-dependent inhibition of the mitochondrial KATP channel by glyburide and 5-hydroxidecanoate // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 13578-13582.
