До методу отримання мезенхімальних стовбурових клітин великої рогатої худоби Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

HayKOBHH BicHHK .HHyBMET iMeHi C.3. IW^KOTO, 2016, T 18, № 2 (66)

HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro HaqioHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHoi' mcahuuhh Ta 6ioTexHonorm iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj

doi: 10.15421/nvlvet6627

ISSN 2413-5550 print ISSN 2518-1327 online

http://nvlvet.com.ua/

УДК 57.08:611.013.46:636.7

До методу отримання мезенхiмальних стовбурових кл^ин

великоУ рогато'1 худоби

А.Й. Мазуркевич, А.В. Грищук amaz@nauu.kiev.ua, vet-lubny@yandex.ru

Нацюнальний утверситет бюресурсгв i природокористування Укра'ни, вул. Геро'в Оборони, 11, м. Ки'в, 03041, Укра'на

Перспективтсть отримання i застосування мультипотентних мезенхiмальних стовбурових клтин дорослого оргат-зму, визначаеться 'ix основними властивостями i ознаками. Диплогдт культури клтин, отримат i3 тканин i оргатв ссав-щв, зберiгають свою видову i тканинну сnецифiчнiсть, але мають обмежений перiод пролiферацi'i вна^док стартня. Тому використання мезенxiмальниx стовбурових клтин е актуальним. Легюсть ix видыення i доступтсть бiологiчного матерiа-лу робить ix, на сьогодшшнш день, найбыьш перспективною клтинною системою. До^дження властивостей стовбурових клтин у ветеринарнш медицин мае своi особливостi. Вони полягають, зокрема, у врахуванш видових характеристик до^джуваного клтинного матерiалу, що мае важливе значення в практичнш регенератившй ветеринарнш терапй. В результатi проведеноiроботи, було вiдпрацьовано методи отримання, культивування i глибокого заморожування культур мультипотентних мезенxiмальниx стовбурових клтин, видыених з юсткового мозку велико'' рогатоi худоби. Порiвняльний аналiз ефективностi видыення мезенxiмальниx стовбурових клтин при використанш гепарину, або цитрату натрю вказуе на не суттевi вiдмiнностi i можуть використовуватись обидва препарати. При культуваннi мезенxiмальниx стовбурових клтин методом роздыення клтин в градiентi щiльностi фжола е быьш ефективним, хоча i другий метод також може бути.

Ключовi слова: юстковий мозок, мезенxiмальнi стовбуровi клтини, методика, велика рогата худоба

К методам получения мезенхимальных стволовых клеток крупного рогатого скота

А.Й. Мазуркевич, А. В. Грищук amaz@nauu.kiev.ua, vet-lubny@yandex.ru

Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, г. Киев, Украина ул. Героев Обороны, 11, Киев, 03041, Украина

Перспективность получения и применения мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток взрослого организма, определяется их основными свойствами и признаками. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, но имеют ограниченный период пролиферации в результате старения. Поэтому использование мезенхимальных стволовых клеток актуально. Легкость их выделения и доступность биологического материала делает их, на сегодняшний день, наиболее перспективной клеточной системой. Исследования свойств стволовых клеток в ветеринарной медицине имеют свои особенности. Они заключаются, в частности, в учете видовых характеристик исследуемого клеточного материала, что имеет важное значение в практике регенеративной ветеринарной терапии. В результате проведенной работы, были отработаны методы получения, культивирования и глубокого замораживания культур мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крупного рогатого скота. Сравнительный анализ эффективности выделения мезенхимальных стволовых клеток при

Citation:

Mazurkevych, A.Y., Hryshchuk. A.V. (2016). Method for obtaining mesenchymal stem cells cattle. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 2(66), 132-135.

использовании гепарина или цитрата натрия указывает на несущественные отличия, и могут использоваться оба препарата. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток методом разделения клеток в градиенте плотности фикола более эффективно, хотя и второй метод тоже может быть.

Ключевые слова: костный мозг, мезенхиальные стволовые клетки, методика, крупный рогатый скот.

Method for obtaining mesenchymal stem cells cattle

A.Y. Mazurkevych, A.V. Hryshchuk amaz@nauu.kiev.ua, vet-lubny@yandex.ru

National University of life and environmental sciences of Ukraine, Heroyiv Oborony Str., 11, Kyiv, 03041, Ukraine

Prospects receipt and use of multipotent mesenchymal stem cells of an adult organism, determined by their basic properties and characteristics. Diploid cell cultures derived from mammalian tissues and organs, preserve their species and tissue specificity, but have a limited period ofproliferation because of aging. Therefore, the use of mesenchymal stem cells is important. The ease of selection and availability of biological material makes them today to date, the most promising cell system. Studying the properties of stem cells in veterinary medicine has its own characteristics. They are in particular, taking into account specific characteristics of the cell material, which is important in practical veterinary regenerative therapy. There is a significant amount of minutes of culturing mes-enchymal stem cells, but none of the authors do not focuses on the expression of biological properties of these cells by culturing. In the study of the biological properties of mesenchymal stem cells, there are many mysteries and the unknown, but today conducted preclinical and clinical studies for the introduction of these cells to correct the damaged organs and tissues of an animal body. Thus, the study and knowledge of the underlying mechanisms that form the specific features of the biological properties of stem cells in cattle is important and urgent to develop scientifically based methods of use of mesenchymal stem cells in regenerative therapy of breast diseases in cows. Because of this work was perfected method of cultivation and crop deep freeze multipotent mesenchymal stem cells isolated from bone marrow of cattle. In studies we used mesenchymal stem cells derived from bone marrow of healthy donor cows. For bone marrow, we used our improved method. Comparative analysis of the efficiency of the allocation of mesenchy-mal stem cells using heparin or sodium citrate indicates no significant differences and can be used both drugs. When cultured mes-enchymal stem cells by cell separation density gradient fikola is more efficient, while the second method also can be. The proposed method of obtaining and culturing multipotent mesenchymal stem cells isolated from bone marrow of cattle makes it possible to obtain stem cells with high biological activity.

Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, methods, cattle

Вступ

Перше повгдомлення про юнування стовбурових клгган було доведено до науково! спшьноти росшсь-ким вченим Максимовим А.А. Ще в 1908 рощ А.А. Максимов вв1в термш «стовбурова клггина», для пояснения мехашзму швидкого самовадновлення кль тин кровг Шзшше професор Фрщенштейн тдтвердив здогади колеги, i вивчаючи можливосл цих клгган, став розробляти методи застосування стовбурових клгган на практищ (Fridenshtejn et al., 1970; Minguell, 2001).

Мезенхiмальнi стовбуровi клггани ссавщв на сьо-годш вважаються найбшьш перспективним видом аутогенного й алогенного матерiалу для клгганно! терапи (Mazurkevych et al., 2013).

Сучасний етап розвитку регенеративно! медицини характеризуешься стрГмким прогресом бютехнологш, що е наслгдком, передуам, успiхiв у дослвдженш бюлопчних властивостей стовбурових клгган.

Дослщження властивостей стовбурових клгган у ветеринарнш медициш мае сво! особливосл. Вони полягають, зокрема, у врахуванш видових характеристик дослщжуваного клгганного матерiалу, що мае важливе значення в практичнш регенеративнш ветеринарнш терапи.

Як вщомо, дипло!дш клгган, отриманi Гз тканин i органiв ссавщв, в культуральному середовищГ зберь гають свою видову i тканинну специфГчшсть, але мають обмежений перюд пролГфераци внаслшок ста-

ршня. Тому використання мезенхiмальних стовбурових клiтин е актуальним. Легкость 1х видiлення i дос-тупшсть бiологiчного матерiалу робить 1х на сьогод-нiшнiй день найбшьш перспективною клгганною системою (Volkova et al., 2012; Mazurkevych et al., 2013).

Перспектившсть отримання i застосування муль-типотентних мезенхiмальних стовбурових клгган дорослого органiзму визначаеться 1х основними влас-тивостями i ознаками. ДостовГрно встановлено, що мезенхiмальнi стовбуровГ клггани стабiльно самовгд-новлюються в клонах без анеуплодп, генетично! не-стабшьносп i малитазацп. При цьому вони здатш пролiферувати в культурГ тривалий час, формуючи стабiльнi дипловдш клгганш лшп. При Гндукци до диференщювання, клггани здатш диференцшватись в декшькох напрямках, утворюючи in vitro клггани шших тканин (Smith et al., 2003; Volkova et al., 2012; Mazurkevych et al., 2013).

1снуе значна кшьшсть протоколГв культивування мезенхГмальних стовбурових клгган, проте жоден Гз авторГв не акцентуе увагу на прояв бюлопчних властивостей цих клгган при культивуванш (Mazurkevych et al., 2013).

У вивченш бюлопчних властивостей мезенхГма-льних стовбурових клгган юнуе багато загадок та невшомого, проте уже сьогодш проводяться доклшч-m й клшГчш дослгдження щодо введения цих клгган з метою корекци ушкоджених оргашв i тканин тварин-ного оргашзму (Savchenkova and Guljukin, 2011).

HayKOBHH BicHHK .HHYBMET iMeHi C.3. I®HibKoro, 2016, t 18, № 2 (66)

TaKHM hhhom, BHBHeHHa i 3HaHHa ranÖHHHHx Mexa-

Hi3MiB, mi ^OpMyMTb BHgOBi 0C06jHB0CTi 6i0J0riHHHx BjacTHBOcreH CTOBÖypoBHx KjiTHH opraHi3My BejHKOi poraToi' xygo6u, e Ba®jiHBHM i gocHTb aKTyajibHHM gjia po3po6KH HayROBO oörpyHTOBaHHx MeiogiB 3acT0cyBaH-Ha Me3eHxiMajbHHx CTOBÖypoBHx KjiTHH y pereHepam-BHin Tepanii' xBopoö mojohhoi 3aj03H y KopiB.

MaTepia^ i MeTogH goc^ig^eNt

B gocgig®eHHax HaMH BHKopucTaHi Me3eHxiMajbHi CTOBÖypOBi KjiTHHH, OTpHMaHi i3 KiCTKOBOrO MO3Ky 3g0-poBHx KopiB-goHopiB. ,3ga OTpuMaHHa KiCTKOBOrO MO3Ky mh BHKopHCTajH BgoCkoHageHy HaMH MeioguKy.

,3ga nonepeg®eHHa npoieciB 3ropTaHHa KpoBi b OTpHMaHiH KjiTHHHin MaCi mh gogaBagu go ogHiel' nopiii OTpuMaHoro aCnipaTy KiCTKOBOrO MO3Ky renapuH y cniB-BigHomeHHi 2-3 0,3, Ha 1 cm3, go iHmoi - irnpaT HaipiM b KijbKOCTi 1-2 mj Ha 10 cm3. 3pa3KiB acnipaTy KicT-KOBoro MO3Ky gogaBajH TaKO® nogBiHHy go3y (20 mkj) aHTHÖioTHKa-aHTHMiKOTHKa. fflnpuiu 3 acnipaTOM no-Mi^ajH b TepMOKOHTeHHep 3 xojog egeMeHTaMH i npoia-roM 3 - 4 roguH gocraBjajH b ga6opaiopiM HYEin gga BHKopucTaHHa ix b nogajbmux gocgig®eHHax.

,3ga BugijeHHa 3 KiCTKOBOrO Me3eHxiMajbHux ctob-6ypoBHx KjiTHH BHKopucTOByBajH gBa MeTogu. nepmuH - po3gijeHHa KjiTHH b rpagiemi migbHOCTi ^iKOjy 3a MeTogoM, po3po6geHHM b jaöopaTopii HYEin.

CyTb MeTogy nogarae b TOMy, mo OTpuMaHHH acnipaT po3Boguju $0C$aTH0-6y$epHHM po3hhhom y Tpu pa3H. ^,aji p03ÖaBjeHy KjiTHHHy Macy i3 acnipaTy KiCTKOBOrO M03Ky HamapoByBaju Ha rpagieHT ^iKOjy (p = 1,076). noTiM npoöipKH 3 HamapoBaHHM ^kojom leHTpu^yry-BajH npu KiMHaTHin TeMnepaTypi 30 xbhjhh npu 1000 o6./xb. ,3ga yHHKHeHHa nepeMimyBaHHa npu ueHTpu^yryBaHHi BHKopucTOByBaju nocTynoBe rajbMy-BaHHa poTopa. B npoieci TaKoro leHTpH^yryBaHHa KjiTHHH KpoBi ocigajH Ha gHO npo6ipKH. Ha Me®i p03-nogijiy mapiB ^opMyBajiaca ^paKiiia ogHoagepHHx Kjii-thh y Burjagi onagecuMMHoro mapy, aKHH 06epe®H0 36upajH nineTKOM. Aaji $paKiiM ogHoagepHHx KjiTHH npoMHBajH $0C$aTH0-6y$epHHM po3hhhom 1:1 i no-btopho ueHTpu^yryBajH 5 xbhjhh, age npu 1700 o6./xb. OTpuMaHy cycneroiro KjiTHHHOi Macu BuciBagu y Kyjb-TypajbHi HamKH neTpi (d = 60 mm) i KyjibTHByBajiH go OTpHMaHHa M0H0mapy 80%-oi KOH^jMeHTHOCTi. Oipu-MaHy KyjbTypy KjiTHH KyjbTHByBajH 3a CTaHgapTHOM MeT0gHK0M b KyjbTypajbHux HamKax neTpi Ta CO2 iHKy6aT0pi (t 37 °C, 5 % CO2), BHKopucTOByMHH no®HB-He cepegoBHme TaKoro CKjagy: 80 % - DMEM, 20 % -eM6pi0HajbHa cupoBairca TegaTH 3 gogaBaHHaM 10 mkj/cm3 cepegoBuma aHTu6i0THKa-aHTHMiK0THKa. 3aMi-Hy cepegoBHma npoBogugu Hepe3 K0®Hi Tpu go6u.

3a gpyruM MeTogoM npoBoguju ueHTpu^yryBaHHa acnipaTy npoiaroM 5 xbhjhh npu 1,7 thc. o6epiiB/xB.

go HagocagKOBOi pigHHH gogaBaju 80% - DMEM, 20% - eM6pi0HajbH0i cupoBaTKH TegaTH 3 gogaBaHHaM nogBiHHoi g03H 20 mkj/cm3 cepegoBH^a aHTu6i0THKa-aHTHMiKOTHKa, BuciBaju b HamKH neipi i noMi^aju b CO2-iHKy6aTopi (t 37 °C, 5% CO2). 3aMiHy cepegoBH^a npoBogujH TaKO® Hepe3 K0®Hi Tpu go6u.

npu gocarHeHHi M0H0mapy 80%-oi KOH^jMeHTHOC-Ti, KjiTHHH nepeBogujH b cycneH3iM, BHKopucTOByMHH 0,5%-h po3HHH TpuncHHy/E^TA i p03ciBagu y cniBBig-HomeHHi 1:2.

r0T0Bi KyjibTypu KjiTHH, OTpHMaHi 3a gBOMa MeTO-gaMH, nepeHOCHjH gga 36epiraHHa b nocyguHi flraapa i3 pigKHM a30T0M. nepeg Kpi0K0HcepByBaHHaM KyjbTypy KjiTHH nepeHOCHjH y cepegoBH^e, ^0 CKjagaeTbca i3 ^eiajbHoi TejaHOi cupoBaTKH Ta 10% flMCO.

Pe3ymTara Ta ix oßroBopeHHH

Y cepii gocjig®eHb nicja BHciBaHHa KjiTHHHoro Ma-Tepiajy b KyjbTypajbHi HamKH neTpi Ta b npoieci noro KyjbTHByBaHHa npoBoguju oiiHKy xapaKTepy 6iojoriH-

HOi aKTHBHOCTi CT0B6yp0BHx KjiTHH 3a n0Ka3HHK0M

yTBopeHHa KOJOHin. nig Hac MiKpocKoniHHoro gocji-g®eHHa 6yjo BHaBjeHO B®e Ha 7 geHb KyjbTHByBaHHa 3HaHHy KijbKicTb KOJOHin. XapaKTepHOM 03HaK0M pociy CT0B6yp0BHx KjiTHH e Te, mo bohh MaMTb BHg0B®eHy $opMy i npuKpinjMMTbca go gHa HamKH (Mag. 1 - 3).

PHC.1. Ko^OHii" CTOBÖypoBHx K^iTHH, OTpHMaHHx ^juo^hNHM MeTogoM 3 renapHHOM;

7 denb Kynhmueyeauw, 36mhweHH% 10x30.

PHC. 2. Ko^ONi'i CTOBÖypOBHX K^iTHN, OTpHMaHHx ^iKO^tNHM MeTogoM 3 цнтpaтoм NaTpiro;

7 deHb Ky^bmueyeaHHM, 36iMbmeHHM 10x30.

Рис. 3. Колони стовбурових кл^ин, отриманих методом цшьноТ крови

7 день культивування, збшьшення 10х20.

В процес дослгджень встановлено, що клггани, культивоваш за першим методом (роздшення клгган в градаенп щГльносп фшолу), бшьш активно пролГфе-рували, шж клггани, отримаш за другим методом. В культурГ клгган, отриманих за другим методом, на 7 день було виявлено бшьше еритроципв, н1ж стовбурових клгган.

Причому, в культурГ клгган, отриманих за другим методом, Гз застосуванням гепарину, виявлено бшьше колонш стовбурових клгган, шж в пробах Гз цитратом натрш.

Вже на 10-й день на 0-му пасаж1 при мГкроскопп конфлюентшсть моношару клгган досягала 90%, а округлГ клггани випснялись фГброподГбними клгга-нами, що свГдчить про високу бюлопчну актившсть культивованих клгган (рис.4).

Рис. 4. Колони стовбурових, клггин отриманих фiкольним методом з гепарином;

10 день культивування, .збшьшення 10х12.

Встановлено, що в культуральних чашках, з вись вом клгган, отриманих другим методом, на 10-й день вщмГчалось збшьшення конфлюентностГ моно-

шару клгган до 80 %, що майже не поступалось щГль-носп в культурГ клгган, отриманих першим методом.

Висновки

1. Запропонований метод отримання i культивування мультипотентних мезенхГмальних стовбурових клгган, видшених з к1сткового мозку велико! рогато! худоби дае можливють отримувати стовбуровГ клтга-ни з високою бюлопчною актившстю.

2. ПорГвняльний аналГз ефективносп видшення мезенхГмальних стовбурових клгган при використанш гепарину, або цитрату натрш вказуе на несуттевГ ввдмшносп, що дае можливють використовувати обидва назваш препарати в якостГ стабшзаторГв.

3. Культивування мезенхГмальних стовбурових клгган методом роздшення клгган в градаенп щшьно-CTi фшолу (р = 1,076) е бГльш ефективним, шж культивування мезенхГмальних стовбурових клгган за другим методом.

Перспективи подальших дослгджень будуть спря-моваш на подальше вивчення клгган здатних при шдукцп формувати клггани кюткового мозку in vitro, яш являють собою перспективний матерГал для сшь-ськогосподарсько! бютехнологп.

Бiблiографiчнi посилання

Fridenshtejn, A.Ja., Chajlahjan, R.K., Lalykina, K.S. (1970). O fibroblastopodobnyh kletkah v kul'turah krovetvornyh tkanej morskih svinok. Citologija. 12, 1147 - 1155 (in Russian). Minguell, J.J. (2001). Mesenchymal stem cells. Exp. Biol.

Med. 226, 507 - 520. Mazurkevych, A.Y., Malyuk, M.O., Kovpak, V.V., Kharkevych, Yu.O., Zhurba, V.I. (2013). Stovburovi klityny u veterynarniy medytsyni. K.: TsP "Komprynt" (in Ukrainian). Volkova, I.M., Viktorova, E.V., Savchenkova, I.P., Guljukin, M.I. (2012). Harakteristika mezenhial'nyh stvolovyh kletok, vydelenyh iz kostnogo mozga i zhirovoj tkani krupnogo rogatogo skota. Sel'skohozjajstvennaja biologija. 2, 32 - 38 (in Russian).

Smith, R.K., Korda, M., Blunn, G.W., Goodship, A.E. (2003). Isolation and implantation of autologous equin mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment. Equine Vet. 35(1), 99 - 102. Savchenkova, I.P., Guljukin, M.I. (2011). Perspektivy ispol'zovanija stvolovyh kletok v veterinarii. Veterinarija. 7, 3 - 5 (in Russian). Mazurkevych, A.Y., Kovpak, V.V., Danilov, V.B. (2014). Klitynni tekhnolohiyi u veterynarniy medytsyni. K. (in Ukrainian).

Стаття над1йшла до редакцп 19.09.2016