CC BY
33
УДК 577.2
ДНК-ПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ РЯДА ВЕЩЕСТВ В УСЛОВИЯХ ГЕНЕРАЦИИ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ
© 2004 г. Н.Н. Тимошкина
In conditions of Fenton’s reaction with ions of iron and copper are shown DNA-protective properties of some substance: ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glutathione reduced (GSH), urea, mannitol, lysine (Lys), arginine (Arg), gistidin (Gis), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), phenylalanine (Phe), gystidin (Gys), albumin bovine.
Одна из практических сторон применения молекулярно-генетических методов заключается в их использовании для идентификации продуктов переработки объектов, попадающих под юрисдикцию CITES (Конвенция о международной торговле видами дикой фауны и флоры, находящимися под угрозой исчезновения). На подготовительном этапе для таких работ необходимо собрать репрезентативную коллекцию ДНК-содержащих образцов от типичных представителей таксона, которые будут служить эталонами.
Длительное хранение образцов для геномного анализа связано с некоторыми трудностями. Основная проблема при транспортировании и хранении ДНК - свободно-радикальные процессы, протекающие в биологических системах с участием кислорода. Активные формы кислорода (АФК): суперок-сидный анион-радикал, синглетный кислород, пероксид водорода и гидроксильный радикал необходимы для регуляции метаболических процессов организма и в норме образуются как их побочный продукт, дезактивируются компонентами антиоксидантной системы. В противоположность живой структуре в архивных образцах защитные системы клетки уже не функционируют. Более того, в случае хранения препаратов ДНК в виде чистого её раствора вообще отсутствуют клеточные структуры. Обычно для хранения генетических образцов необходимо создание специальных условий (96%-й этанол, -70 °С). По мнению ряда исследователей в замороженном состоянии повреждающее действие свободных радикалов может быть более глубоким [1]. Очевидно, что применение в процессе коллекционирования и хранения веществ-ингибиторов свободно-радикальных процессов позволит повысить стойкость образцов ДНК к действию свободных радикалов и, как следствие, улучшит воспроизводимость молекулярно-генетических исследований.
Цель данной работы - исследовать в экспериментах in vitro ряд веществ с хорошо известными антиоксидантными свойствами, разными по механизму действия, и природные вещества, ДНК-протекторное действие которых не изучалось.
Материалы и методы
В качестве возможных ДНК-протекторов были протестированы вещества: хелатор ионов металлов - этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), белок-антиоксидант - бычий сывороточный альбумин (БСА), перехватчик активных форм кислорода (АФК) - маннитол, мочевина, глутатион восстановленный (GSH), лизин (Lis), аргинин (Arg), гистидин (His), глутаминовая кислота (Glu), глицин (Gly), фенилаланин (Phe). Концентрация тестируемых веществ в реакционной смеси составляла 4 мМ, за исключением альбумина. Его концентрация - 0,4 мМ.
В опытах использовались препараты ДНК - продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведенной на ДНК осетровых рыб. Источник проб -филиал «Национальной генетической коллекции ДНК-содержащих образцов осетровых рыб», функционирующий на базе АзНИИРХ.
Для очистки ПЦР-продуктов от белков и низкомолекулярных примесей использовали модифицированный фенол-хлоро формный метод [2]. Качественную и количественную оценку выделенной ДНК проводили при помощи электрофореза в 1,0%-м агарозном геле в присутствии бромида этидия.
В качестве системы генерации гидроксильного радикала использовали реакцию Фентона с ионами железа или меди. Предварительно в серии опытов были подобраны конечные концентрации реагентов, которые не разрушали полностью препараты ДНК: для ионов двухвалентного железа она составила 1,625 мМ, для перекиси водорода - 0,39 М. После сбора реакционной смеси её инкубировали при 37 °С в течение 15 мин. Процессы генерации АФК останавливали путём быстрого охлаждения проб до 0 °С.
Эксперименты проводились в восьми повторностях. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК, не обработанную реактивом Фентона. Она обладала максимальной светимостью после окраски бромистым этидием. Положительным контролем служила ДНК, на которую воздействовали свободными радикалами в отсутствие ДНК-протекторов.
Для оценки результатов обработки использовали электрофорез в 2%-й агарозе с последующей визуализацией фракций ДНК в проходящем УФ свете [3] в присутствии бромистого этидия. Значения светимости определяли при помощи установки «УВТ-1» и программы «Биотест» фирмы Биоком (Москва). В серии предварительных экспериментов была подтверждена прямая пропорциональность соотношения светимости и массы ДНК окрашенной пробы. Полученные данные светимости обрабатывали, принимая за точку отсчёта вариант отрицательного контроля. Его уровень светимости принят соответствующим 0 % деградации ДНК.
Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методам биометрии [4] с помощью программы «Statistica».
Результаты и обсуждение
Данные, полученные в ходе экспериментов, показали, что разрушение ДНК регистрируется в обеих использованных системах генерации гидроксильных радикалов. Экспозиция препаратов ДНК с перекисью водорода в присутствии 0,6125 мМ Си2+ вызывает их более сильную деградацию (72,5 %), по сравнению с 0,6125 мМ Ре2+ (58,6 %).
Результаты экспериментов представлены в табл. 1,2.
Таблица 1
Деградация ДНК под действием гидроксильного радикала (реакция Фентона с ионами железа) в присутствии тестируемых веществ
Состав реакционной среды Среднее значение светимости, условные единицы Уровень деградации ДНК, %
ПЦР-ДНК (отрицательный контроль) 140,4 ±3,89 0,0
ПЦР-ДНК + Fe2+ + Н2О2 (положительный контроль) 26,8 ±2,16 58,5
ПЦР-ДНК + Fe2+ + Н2О2 + Arg 80,7 ± 2,4 43,5
ПЦР-ДНК + Fe2+ + Н202 + Lis 103,3 ± 5,9 27,9
ПЦР-ДНК + Fe2+ + Н202 + His 68,8 ±6,7 51,8
ПЦР-ДНК + Fe2+ + Н202 + Phe 83,8 ± 4,9 8,9
ПЦР-ДНК + Fe2+ + H202 + Gly 87,6 ± 0,9 38,7
ПЦР-ДНК + Fe2+ + H202 + Glu 66,9 ± 1,9 53,2
ПЦР-ДНК + Fe2+ + H202 + GSH 102,6 ± 1,3 28,2
ПЦР-ДНК + Fe2+ + H202 + маннитол 71,9 ±0,9 49,7
ПЦР-ДНК + Fe2+ + H2O2 + мочевина 97,1 ± 1,6 32,0
ПЦР-ДНК + Fe2+ + H202 + ЭДТА 140,5 ± 2,3 1,7
ПЦР-ДНК + Fe2+ + Н202 + БСА 130,2 ±5,1 41,4
Примечание. Во всех вариантах получены достоверные различия между светимостью в опыте и положительном (отрицательном) контроле; достоверность оценивалась с помощью коэффициента Стьюдента для уровня значимости Р = 0,95.
Максимальный ДНК-протекторный эффект обнаружили ЭДГА (уровень деградации 1,7 %) и БСА (уровень деградации 8,9 %). В среднем диапазоне оказались лизин, восстановленный глутатион и мочевина, уровень деградации ДНК в их присутствии составил соответственно - 27,9; 28,2; 32 %. Сравнительно низкие ДНК-протекторные свойства проявили аминокислоты и глутатион, составляющие ряд в порядке убывания: глицин > фенилаланин > аргинин > маннитол > гистидин > глютаминовая кислота.
Таблица 2
Деградация ДНК под действием гидроксильного радикала (реакция Фентона с ионами меди) в присутствии тестируемых веществ
Состав реакционной среды Среднее значение светимости, условные единицы Уровень деградации ДНК, %
ПЦР-ДНК (отрицательный контроль) 135,6 ±0,74 0,0
ПЦР-ДНК + Си2+ + Н202 (положительный контроль) 98,3 ± 1,11 72,5
ПЦР-ДНК + Си2+ + Н2О2+ Arg 55,7 ± 1,47 60,3
ПЦР-ДНК + Cu2+ + Н202+ Lis 83,5 ± 1,82 40,5
ПЦР-ДНК + Cu2+ + Н202+ His 56,3 ± 1,67 59,9
ПЦР-ДНК + Cu2+ + Н202+ Phe 34,4 ± 2,9 75,7
ПЦР-ДНК + Cu2+ + Н202+ Gly 31,9 ±2,0 77,3
ПЦР-ДНК + Cu2+ + Н202+ GSH 65,8 ± 1,2 53,2
ПЦР-ДНК + Си2+ + Н202 + маннитол 76,0 ± 4,08 45,8
ПЦР-ДНК + Си2+ + Н202+ мочевина 104,9 ± 1,47 25,3
ПЦР-ДНК + Си2+ + Н202+ ЭДТА 86,8 ± 1,38 38,2
ПЦР-ДНК + Си2+ + Н202+ БСА 127,9 ± 2,63 9,1
Примечание. Во всех вариантах получены достоверные различия между светимостью в опыте и положительном (отрицательном) контроле; достоверность оценивалась с помощью коэффициента Стьюдента для уровня значимости Р = 0,95.
Из представленных в табл. 2 данных следует, что максимальный ДНК-протекторный эффект обнаружили бычий сывороточный альбумин (уровень деградации 9,1 %), мочевина (показатель деградации ДНК - 25,3 %) и ЭДГА (уровень деградации 38,2 %). Остальные вещества проявили сравнительно низкую ДНК-протективную активность и составили ряд в порядке её убывания: лизин > маннитол > глутатион восстановленный > > гистидин > аргинин > фенилаланин > глицин.
Максимально низкий уровень ДНК деградации, обнаруженный для альбумина, в случае генерации АФК как в присутствии ионов железа, так и меди, согласуется с описанными для этого фермента антиоксидантными свойствами. Сывороточный альбумин содержит центры высокого сродства ионов меди и ряда других ионов металлов, которые, связываясь в этих центрах, становятся недоступными для реакции с пероксидом водорода. Несмотря на то что часть ионов железа и меди, связанная во вторичных центрах белка, участвует в генерации гидроксильных радикалов, последние, в основном, повреждают саму молекулу альбумина и не попадают в раствор.
По полученным данным высокий ДНК-протекторный эффект продемонстрирован ЭДГА. Являясь хелатирующим агентом, ЭДТА останавливает про-
цессы образования свободных радикалов, соединяясь с металлами-катализаторами и, таким образом, исключая их из реакции.
Защитное действие мочевины (уровень деградации ДНК 32 % в варианте с ионами железа и 25,3 % - с ионами меди) может быть связано с тем, что мочевина препятствует окислительному переходу Ме2+ —> Ме3+, образуя комплексы с двухвалентными ионами металлов.
Ожидаемое ДНК-протекторное действие восстановленного глутатиона определяется его непосредственным взаимодействием с АФК и обменными реакциями с дисульфидными связями. В опыте для этого вещества определено среднее значение деградации препаратов ДНК, что, возможно, связано с ки-слородзависимым окислением С8Н. в результате которого выделяется перекись водорода.
Исследованные аминокислоты обнаружили более низкий уровень ДНК-протекторного действия. Антиоксидантное действие аминокислот связано, во-первых, с инактивацией двухвалентных ионов металлов путем образования координационных связей с атомами азота аминогрупп. Если все шесть координационных связей ионов железа и меди оказываются связанными с остатками аминокислот, то это затрудняет доступ к ним молекул перекиси водорода. Во-вторых, возможно прямое взаимодействие аминокислот с активными формами кислорода [5].
Таким образом, присутствие в тканях природных антиоксидантов - один из важнейших факторов, определяющих их пригодность для генетического коллекционирования. Эти вопросы подробно были рассмотрены нами в работах [6, 7]. В то же время, для многоэтапных исследований удобно иметь очищенный геном организма и, возможно, набор ряда ампликонов. Для препаратов, хранящихся в таком виде, исключаются деструктивные процессы, возможные в тканевых пробах - перекисное окисление липидов, запускающее каскад свободно-радикальных реакций; нуклеазная активность внутренних ферментов; физические повреждения кристаллами льда и т.п. Рядом исследователей рекомендованы наиболее приемлемые условия хранения ДНК- в растворе хлорида цезия с бромистым этидием при 5 °С в темноте [4]. Показано, что в этом случае на 200 тыс.н.п. приходится один разрыв в течение года консервирования ДНК [1]. Часто в виде консерванта применяется и 96%-й этанол. В литературе не описаны какие-либо ДНК-тропные эффекты для этого спирта.
Однако очевидно, что длительная консервация чистых препаратов ДНК подразумевает и более строгий контроль условий хранения. Необходимо строго выдерживать температурный режим, а сам препарат разделять на аликвоты, чтобы избежать в процессе замораживания-оттаивания вымораживания солей, провоцирующих одно- и двуцепочечные разрывы молекулы ДНК. Как уже говорилось выше, присутствие металлов переменной валентности -
54
потенциальных центров радикалообразования, также способствует разрушению ДНК. Важно поддержание оптимального значения pH 8,5 - низкие значения pH вызывают депуринизацию. На качество хранения ДНК может влиять и способ её выделения. Так, следы фенола, окисляясь, приводят к разрыву фосфодиэфирных связей. Таким образом, остается актуальной разработка консервирующих сред с добавлением веществ защиты ДНК, в частности, от АФК.
Полученные результаты данной работы позволяют рекомендовать введение наиболее активных из изученных ДНК-протекторов в препараты ДНК для длительного хранения.
Литература
1. Корниенко И.В. и др. Подготовка биологического материала для молекулярногенетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. Ростов н/Д, 2001.
2. Saiki R.K. et al. 11 Science. 1985. № 230. P. 1350.
3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование. М., 1984.
4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990.
5. Чистяков В.А. и др. И Основные проблемы рыбного хозяйства и охраны рыбохозяйственных водоемов Азовского бассейна: Сб. научн. тр. АзНИИРХа. Ростов н/Д, 1996.
6. Войнова Н.В. и др. // Вопр. ихтиологии. 2001. Т. 41. № 6. С. 842-845.
7. ЧеренковаИ.Ф. и др. //Вопр. ихтиологии. 2003. Т. 43. № 1. С. 142-144.
Азовский научно-исследовательский институт
рыбного хозяйства 13 апреля 2004 г.
