CC BY
51
УДК 612.015.3 : [615.739:612.398]: 599.323.4
С.Ю. Крыжановская, O.E. Гусева, O.A. Лебедько, E.H. Сазонова, С.С. Тимошин
ВЛИЯНИЕ АНАЛОГОВ ДЕРМОРФИНА И ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА НА БИОГЕНЕЗ АКТИВНЫХ КИСЛОРОДНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В КАРДИОРЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЕ НОВОРОЖДЕННЫХ БЕЛЫХ КРЫС
Дальневосточный государственный медицинский университет; Хабаровский филиал ДНЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН -Институт охраны материнства и детства, г. Хабаровск
Патология кардиореспираторной системы занимает ведущее место в структуре заболеваемости и представляет собой одну из основных причин летальных исходов у новорожденных. В большинстве случаев молекулярной основой патогенеза кардиореспиратор-ных заболеваний являются нарушения в системе биогенеза активных кислородных метаболитов (АКМ) с последующим развитием оксидативного стресса, когда АКМ из необходимых участников клеточной сигнализации и регуляции превращаются в повреждающие цитотоксичные агенты [6, 7].
В настоящее время большое внимание уделяется поиску веществ-протекторов, способных модулировать генерацию и деградацию АКМ, поддерживать их концентрацию в пределах уровней, необходимых для реализации физиологических ответов клетки.
В силу высокой эффективности и избирательности действия регуляторные пептиды являются одной из основ для создания нового поколения лекарственных средств. В наших предыдущих исследованиях были получены данные, свидетельствующие об участии ряда регуляторных пептидов в становлении и поддержании гомеостаза системы биогенеза АКМ на раннем этапе постнатального онтогенеза [4, 5].
Пептидными препаратами, проходящими в настоящее время этап доклинических исследований, являются синтетические производные на основе дермор-фина — седатин (Н-А^-Туг-Б-А1а-РЬе-С1у-ОН) и бе-заргининовый аналог седатина (Н-Туг-Б-А1а-РЬе-С1у-ОН), на основе лей-энкефалина - пептид с условным названием НАЛЭ или неопиоидный аналог лей-энкефалина (Н-Р1ге-БА1а-С1и-Р11е-Ьеи-А^-ОН).
Цель настоящей работы состояла в изучении особенностей влияния седатина, его безаргининового аналога и НАЛЭ на биогенез АКМ в тканях сердца, легких и в сыворотке крови новорожденных белых крыс.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на 103 новорожденных белых крысах. Для нивелирования генетически обусловленных межвыводковых различий группы формировали методом расщепления выводков. Пептиды в дозе 100 мкг/кг массы животного инъецировали внут-рибрюшинно, ежедневно, с 2 по 6 сут жизни: в первой
Резюме
Исследовали биогенез активных кислородных метаболитов (АКМ) в сыворотке крови, миокарде и легких новорожденных белых крыс на фоне введения биологически активных пептидов синтетического аналога дер-морфина — седатина (H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH) и неопиоидного аналога лей-энкефалина (H-Phe-DAla-Glu-Phe-Leu-Arg-OH). Использовали метод спонтанной и индуцированной биохемилюминесценции; 5-кратное | введение пептидов новорожденным животным модули-| рует биогенез АКМ. Активируются эндогенные механиз-1 мы детоксикации, снижается интенсивность генерации АКМ. Отмечены тканеспецифичные особенности полученных изменений. "Безаргининовьш" аналог седатина не влиял на биогенез АКМ у новорожденных животных. Обсуждается участие системы метаболизма N0 в реализации полученных эффектов.
S.Yu. Kriganovskaya, О.Е. Guseva, О.А. Lebedko, E.N. Sasonova, S.S. Timoshin
THE INFLUENCE OF SYNTHETIC ANALOGS OF DERMQRFINE AND LEI-ENKEFALIN ON BIOGENESIS ACTIVE METABOLITES OF OXYGEN IN NEWBORN RATS CARDIORESPIRATORY SYSTEM
Far Eastern State Medical University;
Khabarovsk Facility of State Founding Far-Eastern Scientific Center of Respiratory Pathology and Physiology SB RAMS - Scientific research institute of Mother and Child Care, Khabarovsk
Summary
We examined biogenesis active metabolites of oxygen (AMO) in blood, heart and lung of newborn rats after some biological active peptides injection. The synthetic analog of dermorfine - sedatin (H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH) and i unopioided analog of lei-enkefalin (H-Phe-DAla-Glu-Phe-Leu-Arg-OH) were examined. We used spontaneous and inducible chemiluminescencie. Date obtained demonstrate that the AMO synthesis significantly decreased aftei 5-time peptides injection. Accordingly, the antioxidant defense increased. Comparative effects of these peptides in different tissue was studied. The analog of sedatin without Arg did not influence on AMO biogenesis. Our data suggest that the NO-mechanism involved in these peptides realization.
Влияние седатина и его безаргининового аналога на показатели спонтанной и Ре2+ -индуцированной ХЛ гомогенатов миокарда, легких и сыворотки крови новорожденных белых крыс (М±ш)
Группа Инд. ХМЛ (Fe2+)
Ssp, отн. ед. HI, отн. ед. Sind-1, отн. ед.
Контроль Миокард 1,58+0,09 1,39±0,09 3,42+0,25
Легкие 1,44+0,08 1,32±0,10 3,27+0,21
Сыворотка крови 0,31+0,02 0,19+0,01 0,80±0,04
Седатин Миокард 1,42+0,07 0,9010,07* 2,81+0,14*
Легкие 1,49±0,06 0,82+0,05* 2,55±0,12*
Сыворотка крови 0,2210,02* 0,14+0,01* 0,5110.04*
Аналог седатина Миокард 1,70+0,10 1,55+0,12 3,84±0,21
Легкие 1,61 ±0,09 1,40±0,08 3,68±0,17
Сыворотка крови 0,34+0,03 0,22±0,02 0,8310,05
Примечание. * — р<0,05 по отношению к группе контроля.
серии экспериментов вводили либо седатин (H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH), либо его безаргининовый аналог (H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH), во второй серии — НАЛЭ (H-Phe-DAla-Glu-Phe-Leu-Arg-OH). Животным внутрисерийных контрольных групп в эквиобъ-емной дозе вводили изотонический раствор NaCl. Крыс декапитировали через 24 ч после заключительного воздействия (на 7 сут постнатального развития). Для интегральной оценки процессов биогенеза АКМ в гомо-генатах миокарда, легких и в сыворотке крови использовали метод хемилюминесценции (ХЛ). Регистрацию ХЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50В "PERKIN ELMER". Спонтанную и индуцированную Fe2+ ХЛ исследовали по методу Ю.А. Владимирова и соавт. [2.J Определяли светосумму за 1 мин спонтанной ХЛ (Ssp), величина которой коррелирует с интенсивностью генерации АКМ; максимум "быстрой" вспышки (HI) индуцированной ХЛ, свидетельствующей о содержании гидроперекисей липидов, светосумму (Sind-1) за 2 мин после "быстрой" вспышки, отражающую уровень накопления перекисных радикалов липидной природы. Кинетику ХЛ, инициированную H2Oa, в присутствии люминола анализировали по двум параметрам [ 1 ] — максимуму свечения (Н2), указывающему на потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению, и светосумме за 2 мин ХЛ (Sind-2), величина которой свидетельствует об активности антиоксидантной антирадикальной защиты (АОРЗ). Интенсивность ХЛ, измеренную в милливольтах, рассчитывали на 1 мг влажной ткани или 1 мл сыворотки крови и выражали в относительных единицах. Полученные данные обработаны статистически с использованием программы Statistica 6,0.
Результаты и обсуждение
Анализ ХЛ-показателей продемонстрировал (табл. 1,2), что 5-кратное введение седатина новорожденным животным модифицирует биогенез АКМ.
Влияние седатина и его безаргининового аналога на показатели Н202-индуцированной люминол-зависимой ХЛ гомогенатов миокарда, легких и сыворотки крови новорожденных белых крыс (М±т)
Группа Инд. ХМЛ (люминол-Н202)
Н2, отн. ед. Sind-2, отн. ед.
Контроль Миокард 4,72+0,28 8,01+0,63
Легкие 4,6310,25 8,2710,65
Сыворотка крови 1,6910,10 2,3410,20
Седатин Миокард 4,9310,35 8,37+0,68
Легкие 4,8710,20 6,4210,62*
Сыворотка крови 1,1610,08* 1,70+0,15*
Аналог седатина Миокард 5,1310,35 8,9410,72
Легкие 4,8010,26 8,5010,68
Сыворотка крови 1,8010,13 2,7210,25
Примечание. * — р<0,05 по отношению к группе контроля.
Наиболее выраженные изменения имели место на уровне организма. Об этом свидетельствуют соответствующие изменения ХЛ-показателей сыворотки крови. На фоне активации АОРЗ в целом (величина 5тс1-2 уменьшилась на 27%) и повышения устойчивости к перекисному окислению, в частности (амплитуда Н2 снизилась на 31%), зарегистрировано угнетение генерации АКМ (Б зр) на 30%, в том числе за счет снижения концентрации гидроперекисей липидов (Н1) на 26% и угнетения процесса накопления перекисных радикалов (БтсИ) на 36%. В легких интенсивность спонтанной ХЛ сохранялась в пределах контрольных цифр, как и устойчивость субстрата к перекисному стрессу. Однако зарегистрированы активация АОРЗ (величина 8тс1-2 уменьшилась на 22%), а также снижение содержания гидроперекисей липидов (амплитуда Н1 снизилась на 38%), понижение уровня образования и накопления перекисных радикалов (величина БшсИ уменьшилась на 22%). В миокарде изменения касались концентрации гидроперекисей липидов (амплитуда Н1 снизилась на 35%) и уровня накопления перекисных радикалов (величина БтсЫ уменьшилась на 18%).
По сравнению с последствиями воздействия седатина, эффекты НАЛЭ были более выражены как на организменном, так и на органном уровнях (табл. 3, 4). Так, интенсивность продукции АКМ (Б эр) снизилась на 28% в крови, на 20% в легких и на 43% в миокарде. Концентрация гидроперекисей липидов (Н1) уменьшилась на 27% в крови, на 42% в легких и на 48% в миокарде. Уровень накопления перекисных радикалов (БшсИ) снизился на 58% в крови, в легких — на 31 % и в миокарде — на 36%. Повысилась активность АОРЗ и устойчивость к перекисному окислению, о чем свидетельствуют соответствующие изменения — снижение величины 5тс1-2 и амплитуды Н2, соответственно, в крови — на 35 и 39%, в легких — на 35 и 31% , в миокарде — на 40 и 52%.
В ранее проведенных нами исследованиях, когда у новорожденных крыс оценивалось не прямое (как в данном случае), а опосредованное (антенатальное) воз-
Влияние НАЛЭ на показатели спонтанной Влияние НАЛЭ на показатели Н202-индуцированной
и Ре2*-индуцированной ХЛ гомогенатов миокарда, легких люминол-зависимой ХЛ гомогенатов миокарда, легких
и сыворотки крови новорожденных белых крыс (М±т) и сыворотки крови новорожденных белых крыс (М±т)
Группа Инд. ХМЛ (Fe2+)
Ssp, отн. ед. HI, отн. ед. Sind-i, отн. ед.
Миокард 1,41+0,08 1,22±0,07 3,28+0,20
Контроль Легкие 1,34+0,07 1,(7±0,0 8 3,19±0,24
Сыворотка крови 0,25+0,02 0,15+0,01 0,74±0,45
Миокард 0,80+0,04* 0,64±0,06* 2,10±0,15*
НАЛЭ Легкие 1,07±0,05* 0,67±0,05* 2,21±0,13*
Сыворотка крови 0,18±0,01* 0,11+0,01* 0,31 ±0,21*
Примечание. * — р<0,05 по о тношению к группе контроля.
Группа Инд. ХМЛ (лгоминол-Н2Ог)
Н2, отн. ед. Sind-2, отн. ед.
Миокард 4,26+0,24 7,80±0,50
Контроль Легкие 4,13±0,22 7,96±0,53
Сыворотка крови 1,61+0,11 2,16+0,18
Миокард 2,55+0,17* 3,72+0,25*
НАЛЭ Легкие 2,69±0,19* 5,48±0,27*
Сыворотка крови 1,04±0,07* 1,32±0,10*
Примечание. * — р<0,05 но отношению к группе контроля.
действие НАЛЭ, этот пептид также продемонстрировал способность активировать АОРЗ (ферментативное и неферментативное звенья) и угнетать пероксидацию липидов в легких и крови, в том числе у животных, перенесших внутриутробную гипоксию [3].
Полученные нами данные свидетельствуют о способности седатина и НАЛЭ модулировать биогенез АКМ определенным образом — активируя эндогенные механизмы детоксикации, снижать интенсивность генерации АКМ. В свою очередь степень выраженности эффекта каждого из пептидов в отношении биогенеза АКМ исследуемых биосубстратов можно представить в виде следующих ранговых порядков для седатина — "кровь > легкие > миокард", для НАЛЭ — "миокард > легкие > кровь".
Следует отметить, что влияние пептидов на генерацию АКМ, по-видимому, не определяется взаимодействием с опиоидными рецепторами. Седатин является смешанным опиоидным ц/5- агонистом ¡-¡ЛЛЭ, в отличие от седатина и его аналога, не является лигандом опиоидных рецепторов.
Однонаправленность исследуемого эффекта седатина и НАЛЭ в определенной степени могла быть обусловлена наличием в структуре обоих пептидов Ь-аргинина, который находится у седатина на Ы-флан-ге, а у НАЛЭ — на С-фланге. Расположенный таким образом Ь-аргинин высвобождается в ходе метаболизма пептидов [3] и может участвовать в реализации 1ЧО-зависимых механизмов влияния на биогенез АКМ. Известно, что в физиологических концентрациях Ь-аргинин, посредством активации МО-синте-тических процессов, угнетает процессы пероксидации липидов и защищает клетки от оксидативного стресса [9].
Выдвинутое нами предположение подтверждается отсутствием какого-либо эффекта на фоне введения безаргининового аналога седатина (зарегистрировано при ХЛ-анализе исследуемых биосубстратов) (табл. 1,2).
Выяснение причин особенностей распределения эффектов пептидов в различных биосубстратах требует дальнейших экспериментальных исследований. Это может быть связано с N-концевым (седатин) или С-концевым (НАЛЭ) положением аргинина в молекулярной структуре пептидов, а также со спецификой представленности на органном и организменном уровнях как ферментов NO-цикла (аргиназ, NO-син-таз и пр.), так и различных типов опиоидных рецепторов.
Таким образом, полученные нами данные открывают перспективу использования исследуемых пептидов в неонатологии для коррекции нарушений биогенеза АКМ на уровнях как кардиореспираторной системы, так и организма в целом.
Литература
1. Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., Зыбина H.H. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: Мет. рек. СПб., Наука, 2000. 198 с.
2. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. // ВИНИТИ АН СССР. Итоги науки и техники. Сер. биофизика М„ 1991. Т.29. 147 с.
3. Исакова О.Л., Сепетов Н.Ф., Беспалова Ж.Д. и др. // Биоорганическая химия. 1986. Т. 12. №1. С. 106-111.
4. Лебедько O.A., Тимошин С.С. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. Т. 117. №5. С. 535-537.
5. Лебедько O.A., Тимошин С.С. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2002. Т. 133. №5. С. 501-503.
6. Лебедько O.A., Тимошин С.С. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2003. Т 135. №3. С. 226-229.
7. Saugstad O.D. // Curr Opin Obstet Gynecol. 2001. Vol. 13, №2. P. 147-153.
8. Saugstad O.D. // Biol Neonate. 2005. Vol. 88, №3. P. 228-236.
9. Suschek C.V., Schnorrn O., Hemmrich K. et al. // Circulation. 2003. Vol. 107, P. 2607-2611.
□ □□
