ДНК «Минимальных» клеток (микоплазм) в метагеномах вечной мерзлоты Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

днк «минимальных» клеток (микоплазм) в метагеномах вечной мерзлоты

И.Е. Вишняков 12, С.Н. Борхсениус1, А.Р. Каюмов 3, Л.А. Шмакова4, Е.М. Ривкина4

1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский Политехнический Университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия

3 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

4 Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия

DNA of 'minimal' cells (mycoplasmas) in the metagenomes of Arctic permafrost

I.E. Vishnyakov12, S.N. Borchsenius 1, A.R. Kayumov 3, LA. Shmakova 4, E.M. Rivkina 4 11nstitute of Cytology, Russian Academy of Sciences, Saint-Petersburg, Russia

2 Peter the Great Saint-Petersburg Rolytechnic University, Saint-Petersburg, Russia

3 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

4 Institute of Physicochemical and Biological Problems of Soil Science, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia

В вечной мерзлоте в течение длительного геологического времени могут сохраняться ферменты, нуклеиновые кислоты, вирусы и жизнеспособные микроорганизмы . Сложно получить целостное представление о микробном сообществе многолетнемерзлых толщ, используя только классические микробиологические методы . Анализ мета-геномов вечной мерзлоты позволил обнаружить генетический материал древних микоплазм — патогенов человека, животных и растений . Отбор образцов, выделение тотальной ДНК из почвы, секвенирование (Illumina), обработка метагеномных данных (MG-RAST, M5nr, UniProt, Krona). Предсказан видовой состав микоплазм в почвенных образцах многолетнемерзлых отложений Арктики различного происхождения, но сопоставимого возраста (31—32 тыс . лет) Выполнен сравнительный анализ коротких полипептидов, кодируемых фрагментами древней ДНК, с участками белков современных микоплазм . Обсуждаются филогенетическая история Mollicutes, пластичность их генома и патогенный потенциал вечной мерзлоты

Ключевые слова: микоплазмы, метагеномы, вечная мерзлота, «минимальная» клетка, пластичность генома, патогенный потенциал

During the long geological time enzymes, nucleic acids, viruses and viable microorganisms can be kept in permafrost . It is difficult to get a holistic view of the microbial community of permafrost using only classical microbiological methods . The analysis of metagenomes of permafrost allowed us to identify the genetic material of ancient mycoplasmas — pathogens of humans, animals and plants . Sampling, isolation of total DNA from soil, sequencing (Illumina), metagenomic data processing (MG-RAST, M5nr, UniProt, Krona). Mycoplasma species composition in permafrost soil samples of different origin, but of comparable age (31-32 thousand years), was predicted A comparative analysis of short polypeptides encoded by fragments of ancient DNA with corresponding parts of proteins of modern mycoplasmas was done . We discuss the phylogenetic history of Mollicutes, the plasticity of mycoplasma genomes, and the pathogenic potential of the permafrost

Keywords: mycoplasmas, metagenomes, permafrost, "minimal" cell, genome plasticity, pathogenic potential .

Введение

В вечной мерзлоте, как было показано [1—6], в течение длительного геологического времени, от нескольких тысяч до миллионов лет, могут сохраняться ферменты, нуклеиновые кислоты, вирусы и даже жизнеспособные микроорганизмы . Вместе с тем, весьма сложно получить целостное представление о микробном сообществе, используя только классические микробиологические методы. Современные подходы, основанные на анализе метагено-мов, расширяют наши представления о генетическом потенциале экосистем в целом, и экосистеме вечной мерзлоты, в частности . В последние несколько лет появились работы, направленные на анализ мета-геномов вечной мерзлоты [7—9], инициированные активно обсуждаемой проблемой отклика мерзлоты на потепление климата . Изучение биологического разнообразия мерзлых толщ и заключенного в них генетического материала поможет оценить их патогенный потенциал, а также скорость и особенности эволюционных процессов, при обнаружении

e-mail: kairatr@yandex . ru

различий в последовательности ДНК современных и древних видов прокариот . С этих позиций фундаментальный интерес представляют бактерии класса Mollicutes .

Микоплазмы (класс Mollicutes) являются наиболее просто организованными прокариотическими организмами, способными к росту на искусственных питательных средах . В отличие от большинства эубактерий, они не имеют клеточной стенки, не образуют классические покоящиеся стадии, характеризуются малым размером геномов и сравнительно низким метаболическим потенциалом . При этом ми-коплазмы являются весьма успешными патогенами людей, млекопитающих, птиц, насекомых и растений [10]. Предполагают, что микоплазмы в процессе эволюционного становления утратили значительное количество генетического материала их предковых форм (общих с лактобациллами), что привело к уменьшению размера геномов до близкого к теоретически рассчитанному минимуму для организма, способного к самостоятельной репродукции [11].

Микоплазмы было предложено считать естественной моделью «минимальной» клетки [12, 13].

К настоящему времени прочитано более 160 геномов представителей класса Mollicutes, из них аннотированы 62 полноразмерные последовательности (без учета геномов разных штаммов одного вида). Интерес к секвенированию геномов мико-плазм обусловлен как относительной простотой устройства этих микроорганизмов, в результате чего они могут служить удобной моделью для изучения фундаментальных процессов в живых клетках [14], так и их патогенностью по отношению к человеку, сельскохозяйственным растениям, домашнему скоту и промысловым животным

Данная работа является, вероятно, первой попыткой определения разнообразия микоплазм в вечной мерзлоте по обилию идентифицированных нукле-отидных последовательностей (фрагментов ДНК), принадлежащих известным представителям класса Mollicutes . Нами предсказан видовой состав микоплазм в почвенных образцах многолетнемерзлых отложений Арктики различного происхождения, но сопоставимого возраста (31—32 тыс . лет). Кроме того, выполнен сравнительный анализ коротких полипептидов, кодируемых фрагментами древней ДНК, вероятно, принадлежащей «вездесущей» микоплазме Acholeplasma laidlawii, с участками белков современного микроорганизма, подтверждающий гипотезу о высокой пластичности генома микоплазм. Обсуждаются филогенетическая история Mollicutes, пластичность их генома и патогенный потенциал вечной мерзлоты

Материал и методы

Отбор образцов

Почвенные образцы многолетнемерзлых отложений Арктики были собраны на Колымо-Индигирской низменности северо-восточной Сибири (69°299^ 156°599Е) в летний полевой сезон 2007 г . , согласно ранее описанной методике [15]. Образец 1С4 соответствует отложениям древнего старичного озера в пойме реки Пантелеиха: йН-2007/4; глубина - 22,5 м; 30696±394 лет [16]. Образец 1С8 был отобран из отложений ледового комплекса на реке Омолон: йН-2007/2; глубина 6 м . Возраст этого образца составляет 32000 лет [4]. Место отбора обоих образцов показано на карте (рис 1)

Выделение тотальной ДНК из почвы

и секвенирование

Из каждого образца брали по 200—300 мг почвы в восьми повторах . Для экстракции тотальной ДНК использовали Power Soil DNA extraction Kit (MoBIO, США). Затем ДНК концентрировали, применяя Genomic DNA Clean & Concentrator™ kit (Zymo Research, США). Метагеномное секвенирование выполняли в центре CRG (Centre for Genomic Regulation, Испания) с использованием v3 TruSeq SBS Kit на установке Illumina HiSeq 2000, протокол секвенирования 2x100 циклов . Полученные данные обрабатывали при помощи программы для удаления информации об адаптерах Cutadapt [17] и утилитой FastqJoin [18].

Обработка метагеномных данных

Данные секвенирования (образец IC4: 143,7 млн нуклеотидных последовательностей, средняя длина 138 н . п . ; образец IC8: 131,7 млн нуклеотидных последовательностей, средняя длина 150 н . п . ) были загружены на метагеномный аналитический сервер MG-RAST [19] с целью обнаружения среди секвени-рованных фрагментов ДНК участков генов известных микроорганизмов . Всего 6,6% (IC4) и 3,4% (IC8) последовательностей не прошли контроль качества (QC) и были отброшены; 0,3% всех последовательностей в обоих массивах данных принадлежали генам рРНК. Аминокислотные последовательности, кодируемые идентифицированными фрагментами ДНК, были проверены по белковой базе данных M5nr [20] при параметрах по умолчанию (порог E-value — 1е-5, минимальный уровень сходства выравниваемых последовательностей — 60%, минимальная длина выравниваемого участка — 15 аминокислот) . В обоих случаях применяли метод классификации best-hit . Информация о метагеномах образцов IC4 и IC8 доступна в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank (Sequence Read Archive (SRA)) под номерами SRX763249 и SRX751044, соответственно . Краткая аннотация метагеномов представлена в публикации [21]. Для составления таблиц информацию о нуклеотидных последовательностях и их продуктах, о функции и роли белков в биологических процессах брали из базы данных UniProt [22]. Данные по видовому разнообразию микоплазм в исследуемых образцах визуализировали при помощи Krona [23].

Рис. 1. 68° Место отбора

почвенных образцов многолетнемерзлых отложений (обозначено стрелкой):

Колымо-Индигирская низменность северовосточной Сибири (Б9°299N, 156°599Е)

Результаты

Видовой состав представителей класса Mollicutes в древних многолетнемерзлых отложениях Арктики, по данным метагеномного секвенирования

В метагеноме образца IC4, взятого из отложений древнего старичного озера в пойме реки Пан-телеиха (возраст 31 тыс . лет), были обнаружены фрагменты ДНК, обладающие высоким уровнем сходства с участками генов 191 вида современных представителей класса Mollicutes . Что касается образца IC8, отобранного из отложений ледового комплекса на реке Омолон (возраст 32 тыс . лет), то его метагеном содержит информацию о последовательностях ДНК, сходных с участками генов 132 видов микоплазм Общее количество фрагментов ДНК, принадлежащих с высокой долей вероятности представителям класса Mollicutes в двух метагено-мах составляет 36377 и 31121 последовательностей, соответственно . Средняя длина предсказанных аминокислотных последовательностей, кодируемых фрагментами древней ДНК, в метагеноме IC4 — 41,26 остатков, в метагеноме IC8 — 44,02 остатка . Уровень сходства предсказанных полипептидов с участками белков современных микоплазм варьирует от 52% до 97% (средний уровень сходства для IC4 - 71,23%; для IC8 - 69,77%) .

Микоплазмы в метагеномах исследуемых образцов (IC4 — рис . 2A; IC8 — рис . 2Б) представлены в основном тремя порядками: Acholeplasmatales, Entomoplasmatales и Mycoplasmatales . Mycoplas-matales по количеству обнаруженных в обоих ме-тагеномах фрагментов ДНК молликут находятся на первом месте (IC4 — 55%; IC8 — 54%) . На втором месте располагаются Acholeplasmatales (IC4 — 34%; IC8 — 35%) . Entomoplasmatales представлены в метагеномах в меньшей степени (IC4 — 11%;

IC8 — 12%) . Фрагменты ДНК анаэробных микоплазм Anaeroplasmatales были обнаружены только в метагеноме образца IC4, и все они с высокой долей вероятности принадлежат одному виду, Anaeroplasma abactoclasticum .

В образце IC4 род Mycoplasma в основном представлен следующими видами: Mycoplasma capricolum, M. penetrans, M. mycoides, M. pulmonis и M. gallisepticum; каждому из них принадлежит приблизительно по 4% от общего количества идентифицированных фрагментов ДНК микоплазм . Остальные виды рода Mycoplasma представлены 3% последовательностей и меньше . Среди них стоит отметить M. pneumoniae, M. artritidis, M. agalactiae и M. mobile . M. pneumoniae и M. penetrans являются патогенами человека [10, 24], M. agalactiae и M. capricolum заражают мелких жвачных животных [25, 26], M. artritidis вызывает артрит у человека и мышей [27], M. mycoides является широко распространенным патогеном коз [28], M. pulmonis вызывает пневмонию у грызунов [29], M. mobile инфицирует рыб [30], а M. gallisepticum — птиц [31]. В образце Ic8 среди видов рода Mycoplasma наиболее обильно представлены M. agalactiae (5% всех последовательностей ДНК микоплазм) . M. synoviae, M. pneumoniae, M. penetrans, M. mycoides и M. mobile представлены несколько меньшим количеством фрагментов ДНК (по 4%) M. synoviae является значимым патогеном домашних птиц [32] Остальные виды представлены 3% нуклеотид-ных последовательностей и меньше . Кроме того, к Mycoplasmatales относят и два вида уреаплазм, чья ДНК также была обнаружена в составе анализируемых метагеномов: Ureaplasma urealyticum и U. parvum (2—3%) . Оба вида вызывают заболевания урогенитального тракта и других органов человека [33]

Рис. 2. Видовой состав представителей класса Mollicutes в почвенных образцах многолетнемерзлых отложений Северо-Восточной Арктики, по данным метагеномного секвенирования: А — IC4 — осадок озерного происхождения, возраст 31 тыс. лет; Б — IC8 — отложения в ледовом комплексе, возраст 32 тыс. лет

Entomoplasmatales в метагеномах в основном представлены свободноживущей микоплазмой Mesoplasma florum. Этот микроорганизм не обладает патогенными свойствами, он впервые был выделен из растений Solidago sp . [34]. В обоих образцах по 6% из всех последовательностей ДНК микоплазм принадлежит M. florum. Также к порядку Entomoplasmatales относят род Spiroplasma . В метагеномах присутствуют фрагменты ДНК двух видов этого рода: Spiroplasma kunkelii и S. citri (2—3%) . Эти спироплазмы являются патогенами растений; S. citri поражает также насекомых [35, 36].

Среди Acholeplasmatales бесспорным лидером по количеству идентифицированных нуклеотидных последовательностей в метагеномах является «вездесущая» микоплазма, Acholeplasma laidlawii. Эту бактерию в свое время выделяли из различных почв, компоста, сточных вод, а также из тканей человека, животных и растений [10]. Количество последовательностей, с высокой долей вероятности принадлежащих древней A. laidlawii, в каждом метагеноме насчитывает около 20% от ДНК микоплазм Кроме A. laidlawii, Acholeplasmatales в метагеномах представлены несколькими видами фитоплазм, мико-плазм-паразитов растений (Phytoplasma, Candidatus Phytoplasma) . Среди них — Onion Yellows Phytoplasma (Candidatus Phytoplasma asteris str . OY-M, 7%) . Фитоплазмы паразитируют на тканях флоэмы инфицированных растений, переносятся насекомыми и вызывают различные заболевания сельскохозяйственных культур [37].

Сравнительный анализ участков белков древних и современных микоплазм на примере A. Laidlawii

В связи с тем, что на долю «вездесущей» мико-плазмы A. laidlawii в метагеномах приходится примерно пятая часть от общего числа всех идентифицированных последовательностей ДНК Mollicutes, мы решили использовать информацию об этой

микоплазме для сравнительного анализа участков белковых молекул, закодированных в древней ДНК, обнаруженной в составе анализируемых ме-тагеномов, с данными о современных их аналогах, представленных в GenBank (А. laidlawii PG-8A, №СР000896 . 1).

Общее количество нуклеотидных последовательностей, с высокой долей вероятности принадлежащих геному древней А. laidlawii, в метагеномах образцов 1С4 и 1С8 составляет 7793 и 5095, соответственно . Для сравнительного анализа мы выбрали лишь некоторые предсказанные полипептиды, кодируемые фрагментами ДНК древней ахолеплазмы . В таблице 1 представлена информация о 45 уникальных белках и соответствующих им генах А. laidlawii, чьи фрагменты были идентифицированы в метагеноме образца 1С4 . Среди них наибольшим сходством с современными аналогами обладают участки молекул рибосомных белков RplM и RpsK, а также белков и А^_0204, вовлеченных в процесс трансляции (кроме того, А^_0204 является белком холодового шока). 75% уровень сходства аминокислотных последовательностей и выше демонстрируют предсказанные полипептиды, вероятно, являющиеся частями белков А^_1219 (АТФаза АВС-типа, вовлеченная в транспорт олигопептидов), RecA (рекомбинация, индукция SOS-ответа), цитидилтрансфераза А^_1149 (синтез фосфолипидов), ОАРН-синтаза (синтез аминокислот), терминаза А^_0608 (трансфер генов), транскетолаза Тк1А (метаболизм карбогидратов), РНК-полимераза RpoB (транскрипция), шаперонин GгoEL; белки FabG1 (синтез жирных кислот), GlyA (биосинтез аминокислот), Рпр (катаболизм мРНК) и белки с неизвестной функцией А^_0036, А^_0039 и А^_1009 . Полипептиды, являющиеся, вероятно, участками белковых молекул ОарА (биосинтез лизина), металлопептидазы А^_1148 (гидролиз белков), ДНК-гиразы GyгA (изменение топологии ДНК) и ин-тегразы А^_0584 (семейство интеграз/рекомбиназ ХегСО), обладают меньшим уровнем сходства с последовательностями современных белков

Таблица 1. Белки А. laidlawii и соответствующие им гены, фрагменты которых обнаружены в метагеноме осадка озерного происхождения из поймы реки Пантелеиха (образец Ю4, возраст около 31 тыс. лет)

Ген

Белок

° й I- л

° £

5 с

3 2 i

Ml-s

* I X

ItDl-i

я

к о

re u i-

o

о

X о

X

н

u s

I-

_ re 2 a о a i- о Ф о

о *

ф 3

re >

ш

Роль в биологических процессах

pdhD дигидролипоамиддегидрогеназа 39 62 85 2e-07 гликолиз

ACL_1219 АТФаза транспортной системы АВС-типа 57 77 88 4e-17 транспорт олигопептидов

ACL_1103 АТФаза транспортной системы АВС-типа 35 66 83 1e-06 транспорт веществ

infB фактор инициации трансляции ^-2 35 97 97 6e-11 трансляция

tgt квеунин-тРНК-рибозилтрансфераза 39 72 79 2e-07 модификация пуринов тРНК

Продолжение таблицы 1

Ген Белок Длина выравниваемого фрагмента в аминокислотах % сходства % сходства с учетом консервативных замен E-value Роль в биологических процессах

рибонуклеаза НИ 45 64 76 7e-10 деградация РНК

ACL_0285 гипотетический белок 56 71 80 ^-16 функция неизвестна

ACL_0036 гипотетический белок 39 77 85 8e-11 ACL_1116

ACL_1089 NAD-зависимая эпимераза 40 70 93 5e-10 превращение сахаров

rplM рибосомный белок L13 (50S субъединицы) 30 80 90 5e-06 трансляция

ACL_0765 оксидоредуктаза семейства альдо/кеторедуктаз 29 62 79 2e-04 оксидоредуктазная активность

ACL_1116 гипотетический белок поверхности 38 66 87 ^-07 функция неизвестна

pdhB пируватдегидрогеназа Е1, бета-субъединица 37 65 78 4e-06 гликолиз

ACL_1004 механочувствительный ионный канал 38 74 95 3e-09 трансмембранный транспорт

asd аспартатполуальдегид-дегидрогеназа 33 67 76 3e-04 биосинтез аминокислот

rpsK рибосомный белок S11 (30S субъединицы) 40 85 100 5e-14 трансляция

gyrA ДНК-гираза, субъединица А 37 59 73 1e-04 изменение топологии ДНК

ACL_0037 пермеаза транспортной системы АВС-типа 35 74 91 1e-06 транспорт веществ

ACL_1149 цитидилтрансфераза 32 75 81 2e-06 синтез фосфолипидов

ACL_0039 гипотетический белок 51 82 90 1e-18 функция неизвестна

uvrB эксцизионная нуклеаза системы АВС,субъединица В 36 64 83 5e-06 эксцизия нуклеоида

recA белок рекомбинации RecA 38 92 97 6e-13 рекомбинация, репарация, SOS-ответ

metK2 S-аденозилметионинсинтетаза 42 71 79 4e-10 метаболизм углерода

eno энолаза 40 68 78 3e-07 гликолиз

ACL_0204 трансляционная ГТФаза TypA/ BipA-типа 42 79 83 3e-09 трансляция, холодовой шок

ACL 0215 (1) DAHP-синтаза 43 60 72 2e-06 биосинтез ароматических аминокислот

ACL 0215 (2) DAHP-синтаза 31 71 81 3e-04 биосинтез ароматических аминокислот

ACL 0215 (3) DAHP-синтаза 55 85 93 2e-19 биосинтез ароматических аминокислот

Окончание таблицы 1

Ген Белок Длина выравниваемого фрагмента в аминокислотах % сходства % сходства с учетом консервативных замен E-value Роль в биологических процессах

fabB 3-оксоацил-АПБ-синтаза 2 44 70 77 3e-10 биосинтез жирных кислот

aroC хоризматсинтаза 33 61 70 3e-04 биосинтез ароматических аминокислот

groEL шаперонин GroEL 41 90 95 ^-12 фолдинг и ре-фолдинг белков

ACL_0608 терминаза, большая субъединица, вероятный белок 43 95 100 4e-17 перенос генов

ACL_1050 аминотрансфераза 40 65 75 2e-06 азотистый обмен

tktA транскетолаза 39 85 90 3e-10 метаболизм углеводов

greA фактор элонгации транскрипции GreA 40 70 78 6e-07 транскрипция

ACL 1009 (1) гипотетический белок поверхности 32 75 91 7e-08 функция неизвестна

ACL 1009 (2) гипотетический белок поверхности 27 85 89 4e-06 функция неизвестна

gnd 6-фосфоглюконатдегидрогеназа 43 67 84 2e-10 пентозофосфатный шунт

tpiA триозофосфатизомераза 29 66 93 7e-04 гликолиз, пентозофосфатный шунт

fabG1 бета-кетоацил-АПБ-редуктаза 33 82 88 3e-07 биосинтез жирных кислот

g|yA глицингидроксиметилтрансфе-раза 40 78 93 9e-12 биосинтез аминокислот

ACL_0584 тирозинрекомбиназа/ интеграза семейства XerDC 38 58 68 9e-04 интеграция ДНК

rpoB РНК-полимераза, бета-субъединица 59 95 98 2e-26 транскрипция

dapA дигидропиколинатсинтаза 47 57 66 2e-06 биосинтез аминокислот

hsdM1 сайт-специфичная система рестрикции-модификации типа I, субъединица M 47 74 81 8e-13 модификация ДНК

ACL_0724 субстрат-связывающий компонент транспортной системы типа АВС 48 60 79 2e-10 транспорт сахаров

ACL_1148 металлопептидаза семейства М50 54 56 69 2e-07 гидролиз белков

pnp полирибонуклеотиднуклео-тидилтрансфераза 37 84 95 4e-10 катаболизм мРНК

В табл . 2 собраны данные о 27 уникальных белках и генах А. laidlawii, фрагменты которых были обнаружены в метагеноме образца 1С8 . Среди них более, чем 75% сходством обладают участки белковых молекул А^_0651 (два фрагмента, транспортная система АВС-типа), RplD, LepA (трансляция), йеоА (метаболизм пиримидинов) и ДНК-гиразы GyгB . 6 полипептидов обладают сравнительно низким уровнем сходства с участками современных белков микоплазмы (менее 60% аминокислот в сравниваемых последовательностях являются идентичными): они относятся к белкам FusA (трансляция), SufB1

(сборка FeS-кластера, связанного с ассимиляцией серы), А^_1132 (транспорт катионов), А^_0869 (катаболизм нуклеозидов), NAD-зависимой эпи-меразе А^_1089 (превращение сахаров) и АптК (метаболизм карбогидратов). Уровень сходства остальных предсказанных полипептидов с участками белков современной А. laidlawii варьирует между 60 и 75% . В целом, в метагеноме образца 1С4 представлено больше последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды с высоким уровнем сходства (более 75%) с участками белков современных ми-коплазм, чем в метагеноме образца 1С8 .

Таблица 2. Белки A. laidlawii и соответствующие им гены, фрагменты которых обнаружены в метагеноме осадка из ледового комплекса на реке Омолон (образец IC8, возраст около 32 тыс. лет)

Ген

Белок

о

g 3

0 мо

лл^

М£0

1 О Ü cdmSO

ХЛ1-Х

saros ЧиФл

л

GÛ I-

о

и

о

X о

л

GÛ

5 s

Ч О

х •

О 7

X

н

GÛ S I-

л

GÛ

Я*

О о

- s

^о л о* о

ф

з

л >

Ш

Роль в биологических процессах

gltX глутамил-тРНК-синтетаза 38 68 82 5e-08 биосинтез белков

pyk пируваткиназа 52 60 71 1e-08 гликолиз

rpoA РНК-полимераза, альфа-субъединица 58 69 81 3e-15 транскрипция

ACL 0651 (1) АТФ-связывающий белок транспортной системы АВС-типа 41 90 100 5e-14 транспорт веществ

ACL 0651 (2) АТФ-связывающий белок транспортной системы АВС-типа 48 77 92 8e-15 транспорт веществ

ACL 0760 (1) АТФаза транспортной системы АВС-типа 45 64 82 6e-09 транспорт веществ

ACL 0760 (2) АТФаза транспортной системы АВС-типа 47 66 83 6e-11 транспорт веществ

sufB1(1) белок сборки FeS-кластера SUF системы 31 74 94 2e-06 образование железосерного кластера

sufB1 (2) белок сборки FeS-кластера SUF системы 44 57 80 2e-08 образование железосерного кластера

sufB1 (3) Белок сборки FeS-кластера SUF системы 29 72 90 6e-05 образование железосерного кластера

truB тРНК-псевдоуридинсинтаза В 35 69 83 1e-05 процессингтРНК

srmB1 DEAD box АТФ-зависимая РНК-геликаза 44 68 77 1e-08 изменение топологии РНК

pstB АТФаза транспортной системы АВС-типа 31 68 81 1e-04 импорт фосфатов

rplD рибосомный белок L4 48 79 85 5e-16 трансляция

eno (1) энолаза 31 65 77 5e-04 гликолиз

eno (2) энолаза 43 74 88 7e-12 гликолиз

rpsQ рибосомный белок S17 50 64 70 1e-09 трансляция

tdk тимидинкиназа 43 65 81 2e-08 биосинтез ДНК

Окончание таблицы 2

Ген

Белок

0

§ 8

1 ■ 5

rereq

иьо

I 5 И

cumSO ХЛ1-Х

re u

s ^ 2

8 ®

X

н

u s

Ire u a

е

о

т _

> О о *

Ф 3

re >

Ш

Роль в биологических процессах

ACL_1132 АТФаза катионного транспорта 45 56 73 9e-06 транспорт ионов металлов

ACL_1089 NAD-зависимая эпимераза 45 53 69 7e-06 превращение сахаров

fusA фактор элонгации G 37 54 76 2e-04 трансляция

prfB (1) фактор высвобождения пептидной цепи RF-2 41 73 83 1e-09 терминация трансляции

prfB (2) фактор высвобождения пептидной цепи RF-2 31 71 87 2e-04 терминация трансляции

lepA (1) ГТФ-связывающий белок LepA 46 89 93 5e-15 трансляция

lepA (2) ГТФ-связывающий белок LepA 34 65 79 2e-05 трансляция

trmD тРНК-(гуанин-^1)-)-метилтрансфераза 39 67 85 2e-08 процессингтРНК

ACL_0869 дезоксирибонуклеотидтри-фосфатпирофосфатаза 39 56 67 4e-05 катаболизм нуклеозидтри-фосфатов

pheS фенилаланил-тРНК-синтетаза, альфа-субъединица 43 74 86 9e-12 биосинтез белков

prfA фактор высвобождения пептидной цепи RF-1 35 66 86 1e-05 биосинтез белков

deoA тимидинфосфорилаза 55 87 95 6e-19 метаболизм пиримидинов

maf Maf-подобный белок 37 68 86 6e-07 ингибирование септообразования

anmK гипотетический белок 47 57 77 2e-08 метаболизм карбогидратов

atpD Н+-транспортная АТФаза F-типа, бета-субъединица 47 66 79 1e-10 регуляция протонного транспорта и синтеза АТФ

gyrB ДНК-гираза, субъединица В 53 83 87 2e-18 изменение топологии ДНК

Обсуждение

Приблизительная оценка основных этапов эволюции организмов класса Mollicutes была предложена Дж . Маниловым . Эта оценка выполнена на основании результатов анализа генов 16S рРНК современных микоплазм и сопоставления полученных филогенетических данных с известными геологическими и палеонтологическими событиями в истории Земли [38]. Исходя из размеров генома существующих микроорганизмов, предки современных микоплазм произошли, вероятно, из ветви стрептококков с низким содержанием G + C, содержащей виды организмов с размерами геномов 1700—2600 Кб и отделились от них в Позднем Протерозое, около 605 млн лет назад Первичные микоплазмы, вероятно, были похожи на ахолеплазм (то есть факультативных

аэробов, метаболически близких к стрептококкам) и на облигатных анаэробных анаэроплазм, развившихся позже из ахолеплазм . После отделения от стрептококков следующее ветвление этой линии произошло, вероятно, около 470 млн лет назад, во времена Среднего Ордовика, с образованием двух линий, обозначаемых как ААР (Acholeplasma, Anaeroplasma, Asteroleplasma и Phytoplasma) и SEM (Spiroplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, и Urea-plasma). Образование этих ветвей древних молли-кут, предположительно, сопровождалось сокращением геномов, потерей генов синтеза клеточной стенки, генов рРНК и, возможно, некоторых других генов . Далее, на границе Силура и Девона, примерно 410 млн лет назад, ветвь SEM разделилась, образовав две ветви предков современных семейств

Spiroplasmatacae-Entomoplasmataceae и ветвь Mycoplasmataceae (рис . 3). Предки современных Spiroplasmatacae и Entomoplasmataceae разошлись в средней Юре, около 170 млн лет назад [38]. Если эти эволюционные построения верны, предки микроорганизмов класса Mollicutes были дифференцированы на группы, соответствующие четырем порядкам и всем девяти современным семействам (включая фитоплазм, таксономический статус которых до сих пор не определен) не менее 170 млн лет назад . Поэтому не удивительно, что в пробах из многолетне-мерзлых отложений (31—32 тыс . лет) сохранились фрагменты ДНК, относящиеся к представителям столь многих видов и семейств класса Mollicutes

Рис. 3. Филогенетическое древо Mollicutes, показывающее расхождение их на две основные ветви: AAP (Acholeplasma, Anaeroplasma, Asteroleplasma и Phytoplasma) и SEM (Spiroplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, Ureaplasma). По [38], с изм.

В целом, соотношение микоплазм — паразитов животных и человека, свободноживущих микоплазм и фитопатогенных представителей класса Mollicutes в обоих метагеномах является примерно одинаковым . При этом доля фрагментов ДНК каждого вида Mollicutes среди всех последовательностей, относящихся к микоплазмам, между метагеномами варьирует незначительно, за исключением таких видов, как M. agalactiae и Ca . P. asteris str . OY-M . Это могло бы указывать на сходство древних арктических экосистем между собой . Однако, сравнительный анализ видового разнообразия ближайших родственников микоплазм — лактобацилл (Lactobacillales), представленных в метагеномах образцов IC4 и IC8 в значительно большем количестве, демонстрирует в разных образцах сопоставимое число видов (249 и 233, соответственно) и слабые изменения в их процентном соотношении, но при этом по обилию фрагментов ДНК лактобацилл многолетнемерзлые отложения озерного происхождения (IC4) значительно уступают ледовому комплексу позднего плейстоцена (IC8) (278 тыс . нуклеотидных последовательностей против 383 тыс ) Еще ярче подобные различия в обилии фрагментов ДНК проявляются для бактерий Bacillales: 2 млн последовательностей в образце IC8 против 1,3 млн в IC4 . Данный результат выглядит логичным: на дне озера должно обитать меньше бактерий, чем в верхнем слое почвы

Тот факт, что почти 20% аннотированных последовательностей микоплазм в метагеномах принадлежит одному виду, «вездесущей» микоплазме A. laidlawii, не только говорит о повышенных адаптационных возможностях этой бактерии по сравнению с другими представителями молликут, но и коррелирует с представлениями о том, что, вероятно, ахо-леплазмы являются предками остальных микоплазм [38], хотя 30 тыс . лет — это всего лишь 0,005% от предполагаемого общего времени филогенетической истории Mollicutes .

Заслуживает внимания информация об уровне сходства аминокислотного состава аннотированных последовательностей микоплазм с их современными аналогами . Среднее значение в 70%, при колебаниях от 52 до 97%, даже если учесть возможные отличия между различными штаммами микроорганизмов одного вида, говорит о том, что за 30 тыс лет, по-видимому, многие гены микоплазм и кодируемые ими белки подверглись значительным модификациям . Это хорошо коррелирует с феноменально высоким темпом реорганизации генома микоплазм, создающим определенные трудности в классификации «минимальных» бактерий [39, 40]. Значительно больше информации об эволюции «минимальной» клетки могло бы дать сравнение полных геномов микроорганизмов одного вида, древних и современных, но для их сборки имеющихся метагеномных данных крайне недостаточно, а выделить живые микоплаз-мы из вечной мерзлоты пока не удалось . Однако, можно предположить, что количество неконсервативных аминокислотных замен, вероятно, коррелирует со степенью важности белков для обеспечения протекания ключевых процессов в микоплазменной клетке

В целом малое по сравнению со многими другими классами бактерий (Bacilli, Clostridia) количество последовательностей ДНК, обладающих высоким уровнем сходства с участками генов микоплазм, в образцах арктических почв говорит о низкой вероятности обнаружения живых микроорганизмов класса Mollicutes в вечной мерзлоте Сложно говорить и о жизнеспособности клеток микоплазм, вероятно, сохраняющихся в мерзлых почвах. Особенно это касается облигатных паразитов человека и животных, которым для существования и размножения строго необходим организм-хозяин Однако, в условиях усиливающегося год от года сезонного таяния многолетнемерзлых толщ, вероятно, связанного с изменениями климата, а также в результате промышленных разработок, учитывая пластичность генома мико-плазм, нельзя исключать возможности выхода на поверхность древних высокоинвазивных штаммов с повышенной инфектогенностью В связи с этим приобретает особую важность комплексная оценка патогенного потенциала вечной мерзлоты с использованием методов классической микробиологии и метагеномного анализа .

Благодарности

Работа выполнена за счет средств Российского научного фонда (Проект №14-14-01115).

ЛИТЕРАТУРА:

I. Vorobyova E ., Soina V ., Gorlenko M . et al . The deep cold biosphere: facts and hypothesis . FEMS Microbiol . Rev . 1997; 20(3): 277-90 .

2 . Gilichinsky D .A ., Wagener S ., Vishnivetskaya T .A . Permafrost microbiology . Permafrost Periglacial Processes 1995; 6: 281-91.

3 . Gilichinsky D .A., Rivkina E . M . Permafrost Microbiology. In: Reitner J ., Thiel V . , editors . Encyclopedia of Geobiology . New York: Springer; 2011. p . 726-32 .

4 . Legendre M ., Bartoli J ., Shmakova L. et al . Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology . PNAS USA 2014; 111(11): 4274-9 .

5 . Legendre M ., Lartigue A., Bertaux L . et al . In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba . PNAS USA 2015; 112(38): E5327-35 .

6 . Steven B ., Briggs G ., McKay С . P . et al . Characterization of the microbial diversity in a permafrost sample from the Canadian high Arctic using culture-dependent and culture-independent methods . FEMS Microbiol . Ecol . 2007; 59(2): 513-23 .

7 . Graham D ., Wallenstein M ., Vishnivetskaya T . et al . Microbes in thawing permafrost: the unknown variable in the climate change equation . ISME J . 2012; 6(4): 709-12 .

8 . Jansson J . K ., Ta§ N . The microbial ecology of permafrost . Nature Rev . Microbiol . 2014; 12(6): 414-25 .

9 . Mackelprang R ., Waldrop M . P, DeAngelis K . M . et al . Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw . Nature 2011; 480(7377): 368-71.

10 . Razin S ., Yogev D ., Naot Y . Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas . Microbiol . Mol . Biol . Rev . 1998; 62(4): 1094-156 .

II. Morowitz H . J ., Tourtelotte M . E . The smallest living cells . Scientific American 1962; 206: 117-26 .

12 . Morowitz H . J . The completeness of molecular biology . Isr . J . Med . Sci . 1984; 20(9): 750-3 .

13 . Woese С . R . Bacterial evolution . Microbiol . Rev . 1987; 51(2): 221-71.

14 . Вишняков И . Е . , Борхсениус С . Н . Белки теплового шока ми-коплазм и кодирующие их гены . Микробиология 2013; 82(6): 64359 . (перевод: Vishnyakov I . E ., Borchsenius S . N . Mycoplasma heat shock proteins and their genes . Microbiology (Mikrobiologija) 2013; 82(6): 653-67

15 . Shi T ., Reeves R . H ., Gilichinsky D .A . et al . Characterization of viable bacteria from Siberian permafrost by 16S rDNA sequencing . Microbiol . Ecol . 1997; 33(3): 169-79 .

16 . Краев Г . Н ., Шульце Э .Д ., Ривкина Е . М . Криогенез как фактор распределения метана в горизонтах мёрзлых пород . ДАН 2013; 451(6): 684-7 .

17 Martin M Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads . EMBnet J . 2011; 17(1): 10-2 .

18 . Aronesty E . Comparison of sequencing utility programs . The Open Bioinformatics J . 2013; 7: 1-8 .

19 . Meyer F ., Paarmann D ., D'Souza M . et al . The metagenomics RAST server — a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes . BMC Bioinformatics 2008; 9: 386 .

20 . Wilke A ., Harrison T ., Wilkening J . et al . The M5nr: a novel non-redundant database containing protein sequences and annotations from multiple sources and associated tools . BMC Bioinformatics 2012; 13: 141.

21. Krivushin K ., Kondrashov F ., Shmakova L . et al . Two metagenomes from Late Pleistocene Northeast Siberian permafrost . Genome Ann . 2015; 3(1): e01380-14 .

22 . UniProt Consortium . UniProt: a hub for protein information . Nucl . Acids Res . 2014; 43(Database issue): D204-12 .

23 . Ondov B . D ., Bergman N . H ., Phillippy A. M . Interactive metagenomic visualization in a web browser. BMC Bioinformatics 2011; 12: 385 .

24 . Medjo B ., Atanaskovic-Markovic M ., Radic S . et al . Mycoplasma pneumoniae as a causative agent of community-acquired pneumonia in children: clinical features and laboratory diagnosis Ital J . Pediatr . 2014; 40: 104.

25 . March J . B . , Harrison J . C ., Borich S . M . Humoral immune responses following experimental infection of goats with Mycoplasma capricolum subsp . capripneumoniae . Vet. Microbiol . 2002; 84(1-2): 29-45 .

26 . Kumar A., Rahal A. , Chakraborty S . et al . Mycoplasma agalactiae, an etiological agent of contagious agalactia in small ruminants: a review . Vet . Med . Int . 2014; 2014: 286752 .

27 . Koening C . L ., Mu H . H ., Van Schelt A . et al . Hepcidin is elevated in mice injected with Mycoplasma arthritidis . J . Inflamm . tLond . ) 2009 . 6: 33

28 . Thiaucourt F ., Bolske G . Contagious caprine pleuropneumonia and other pulmonary mycoplasmoses of sheep and goats Rev Sci Tech . 1996; 15(4): 1397-414.

29 Jacoby R O , Lindsey J R Health care for research animals is essential and affordable . FASEB J . 1997; 11(8): 609-14 .

30 . Kirchhoff H ., Rosengarten R . Isolation of a motile mycoplasma from fish . J . Gen . Microbiol . 1984; 130(9): 2439-45 .

31. Wijesurendra D . S . , Kanci A ., Tivendale K .A . et al . Development of a Mycoplasma gallisepticum infection model in turkeys Avian Pathol 2015; 44(1): 35-42 .

32 . Kursa O ., Wozniakowski G ., Tomczyk G . et al . Rapid detection of Mycoplasma synoviae by loop-mediated isothermal amplification Arch . Microbiol . 2015; 197(2): 319-25 .

33 . Murtha A. P . , Edwards J . M . The role of Mycoplasma and Ureaplasma in adverse pregnancy outcomes . Obstet . Gynecol . Clin . North Am . 2014; 41(4): 615-27 .

34 Whitcomb R , Tully J , Rose D et al Wall-less prokaryotes from fall flowers in central United States and Maryland Curr Microbiol 1982; 7: 285-90

35 Carpane P , Melcher U , Wayadande A et al An analysis of the genomic variability of the phytopathogenic mollicute Spiroplasma kunkelii . Phytopathology 2013; 103(2): 129-34 .

36 Duret S , Batailler B , Dubrana M P et al Invasion of insect cells by Spiroplasma citri involves spiralin relocalization and lectin/ glycoconjugate-type interactions . Cell . Microbiol . 2014; 16(7): 1119-32 .

37 Kirkpatrick B C Mycoplasma-like organisms: plant and invertebrate pathogens . In: Balows A ., Truper H . G ., Dworkin M . et al ., editors . The Prokaryotes . 2nd ed . New York: Springer-Verlag; 1992 . p.4050-67 .

38 Maniloff J Phylogeny and evolution In: Rasin S , Herrmann R , editors Molecular biology and pathogenisity of mycoplasmas New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers; 2002 . p . 31-44 .

39 Brown D R , Bradbury J M The contentious taxonomy of Mollicutes In: Browning G F , Citti C , editors Mollicutes: Molecular Biology and Pathogenesis Norfolk, UK: Horizon Scientific Press; 2014 . p . 1-14 .

40 Marenda M Genomic mosaics In: Browning G F , Citti C , editors Mollicutes: Molecular Biology and Pathogenesis Norfolk, UK: Horizon Scientific Press; 2014 . p . 15-54 .

Поступила: 15.10.2015