Научная статья на тему 'ДНК «Минимальных» клеток (микоплазм) в метагеномах вечной мерзлоты'

ДНК «Минимальных» клеток (микоплазм) в метагеномах вечной мерзлоты Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
205
43
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Гены и клетки
Область наук
Ключевые слова
МИКОПЛАЗМЫ / МЕТАГЕНОМЫ / ВЕЧНАЯ МЕРЗЛОТА / "МИНИМАЛЬНАЯ" КЛЕТКА / ПЛАСТИЧНОСТЬ ГЕНОМА / ПАТОГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ / MYCOPLASMAS / METAGENOMES / PERMAFROST / "MINIMAL" CELL / GENOME PLASTICITY / PATHOGENIC POTENTIAL

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н., Каюмов А.Р., Шмакова Л.А., Ривкина Е.М.

В вечной мерзлоте в течение длительного геологического времени могут сохраняться ферменты, нуклеиновые кислоты, вирусы и жизнеспособные микроорганизмы. Сложно получить целостное представление о микробном сообществе многолетнемерзлых толщ, используя только классические микробиологические методы. Анализ метагеномов вечной мерзлоты позволил обнаружить генетический материал древних микоплазм патогенов человека, животных и растений. Отбор образцов, выделение тотальной ДНК из почвы, секвенирование (Illumina), обработка метагеномных данных (MG-RAST, M5nr, UniProt, Krona). Предсказан видовой состав микоплазм в почвенных образцах многолетнемерзлых отложений Арктики различного происхождения, но сопоставимого возраста (31-32 тыс. лет) Выполнен сравнительный анализ коротких полипептидов, кодируемых фрагментами древней ДНК, с участками белков современных микоплазм. Обсуждаются филогенетическая история Mollicutes, пластичность их генома и патогенный потенциал вечной мерзлоты

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н., Каюмов А.Р., Шмакова Л.А., Ривкина Е.М.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

DNA of ‘minimal’ cells (mycoplasmas) in the metagenomes of Arctic permafrost

During the long geological time enzymes, nucleic acids, viruses and viable microorganisms can be kept in permafrost. It is difficult to get a holistic view of the microbial community of permafrost using only classical microbiological methods. The analysis of metagenomes of permafrost allowed us to identify the genetic material of ancient mycoplasmas pathogens of humans, animals and plants Sampling, isolation of total DNA from soil, sequencing (Illumina), metagenomic data processing (MG-RAST, M5nr, UniProt, Krona). Mycoplasma species composition in permafrost soil samples of different origin, but of comparable age (31-32 thousand years), was predicted A comparative analysis of short polypeptides encoded by fragments of ancient DNA with corresponding parts of proteins of modern mycoplasmas was done We discuss the phylogenetic history of Mollicutes, the plasticity of mycoplasma genomes, and the pathogenic potential of the permafrost

Текст научной работы на тему «ДНК «Минимальных» клеток (микоплазм) в метагеномах вечной мерзлоты»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

днк «минимальных» клеток (микоплазм) в метагеномах вечной мерзлоты

И.Е. Вишняков 12, С.Н. Борхсениус1, А.Р. Каюмов 3, Л.А. Шмакова4, Е.М. Ривкина4

1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский Политехнический Университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия

3 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

4 Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия

DNA of 'minimal' cells (mycoplasmas) in the metagenomes of Arctic permafrost

I.E. Vishnyakov12, S.N. Borchsenius 1, A.R. Kayumov 3, LA. Shmakova 4, E.M. Rivkina 4 11nstitute of Cytology, Russian Academy of Sciences, Saint-Petersburg, Russia

2 Peter the Great Saint-Petersburg Rolytechnic University, Saint-Petersburg, Russia

3 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

4 Institute of Physicochemical and Biological Problems of Soil Science, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia

В вечной мерзлоте в течение длительного геологического времени могут сохраняться ферменты, нуклеиновые кислоты, вирусы и жизнеспособные микроорганизмы . Сложно получить целостное представление о микробном сообществе многолетнемерзлых толщ, используя только классические микробиологические методы . Анализ мета-геномов вечной мерзлоты позволил обнаружить генетический материал древних микоплазм — патогенов человека, животных и растений . Отбор образцов, выделение тотальной ДНК из почвы, секвенирование (Illumina), обработка метагеномных данных (MG-RAST, M5nr, UniProt, Krona). Предсказан видовой состав микоплазм в почвенных образцах многолетнемерзлых отложений Арктики различного происхождения, но сопоставимого возраста (31—32 тыс . лет) Выполнен сравнительный анализ коротких полипептидов, кодируемых фрагментами древней ДНК, с участками белков современных микоплазм . Обсуждаются филогенетическая история Mollicutes, пластичность их генома и патогенный потенциал вечной мерзлоты

Ключевые слова: микоплазмы, метагеномы, вечная мерзлота, «минимальная» клетка, пластичность генома, патогенный потенциал

During the long geological time enzymes, nucleic acids, viruses and viable microorganisms can be kept in permafrost . It is difficult to get a holistic view of the microbial community of permafrost using only classical microbiological methods . The analysis of metagenomes of permafrost allowed us to identify the genetic material of ancient mycoplasmas — pathogens of humans, animals and plants . Sampling, isolation of total DNA from soil, sequencing (Illumina), metagenomic data processing (MG-RAST, M5nr, UniProt, Krona). Mycoplasma species composition in permafrost soil samples of different origin, but of comparable age (31-32 thousand years), was predicted A comparative analysis of short polypeptides encoded by fragments of ancient DNA with corresponding parts of proteins of modern mycoplasmas was done . We discuss the phylogenetic history of Mollicutes, the plasticity of mycoplasma genomes, and the pathogenic potential of the permafrost

Keywords: mycoplasmas, metagenomes, permafrost, "minimal" cell, genome plasticity, pathogenic potential .

Введение

В вечной мерзлоте, как было показано [1—6], в течение длительного геологического времени, от нескольких тысяч до миллионов лет, могут сохраняться ферменты, нуклеиновые кислоты, вирусы и даже жизнеспособные микроорганизмы . Вместе с тем, весьма сложно получить целостное представление о микробном сообществе, используя только классические микробиологические методы. Современные подходы, основанные на анализе метагено-мов, расширяют наши представления о генетическом потенциале экосистем в целом, и экосистеме вечной мерзлоты, в частности . В последние несколько лет появились работы, направленные на анализ мета-геномов вечной мерзлоты [7—9], инициированные активно обсуждаемой проблемой отклика мерзлоты на потепление климата . Изучение биологического разнообразия мерзлых толщ и заключенного в них генетического материала поможет оценить их патогенный потенциал, а также скорость и особенности эволюционных процессов, при обнаружении

e-mail: kairatr@yandex . ru

различий в последовательности ДНК современных и древних видов прокариот . С этих позиций фундаментальный интерес представляют бактерии класса Mollicutes .

Микоплазмы (класс Mollicutes) являются наиболее просто организованными прокариотическими организмами, способными к росту на искусственных питательных средах . В отличие от большинства эубактерий, они не имеют клеточной стенки, не образуют классические покоящиеся стадии, характеризуются малым размером геномов и сравнительно низким метаболическим потенциалом . При этом ми-коплазмы являются весьма успешными патогенами людей, млекопитающих, птиц, насекомых и растений [10]. Предполагают, что микоплазмы в процессе эволюционного становления утратили значительное количество генетического материала их предковых форм (общих с лактобациллами), что привело к уменьшению размера геномов до близкого к теоретически рассчитанному минимуму для организма, способного к самостоятельной репродукции [11].

Микоплазмы было предложено считать естественной моделью «минимальной» клетки [12, 13].

К настоящему времени прочитано более 160 геномов представителей класса Mollicutes, из них аннотированы 62 полноразмерные последовательности (без учета геномов разных штаммов одного вида). Интерес к секвенированию геномов мико-плазм обусловлен как относительной простотой устройства этих микроорганизмов, в результате чего они могут служить удобной моделью для изучения фундаментальных процессов в живых клетках [14], так и их патогенностью по отношению к человеку, сельскохозяйственным растениям, домашнему скоту и промысловым животным

Данная работа является, вероятно, первой попыткой определения разнообразия микоплазм в вечной мерзлоте по обилию идентифицированных нукле-отидных последовательностей (фрагментов ДНК), принадлежащих известным представителям класса Mollicutes . Нами предсказан видовой состав микоплазм в почвенных образцах многолетнемерзлых отложений Арктики различного происхождения, но сопоставимого возраста (31—32 тыс . лет). Кроме того, выполнен сравнительный анализ коротких полипептидов, кодируемых фрагментами древней ДНК, вероятно, принадлежащей «вездесущей» микоплазме Acholeplasma laidlawii, с участками белков современного микроорганизма, подтверждающий гипотезу о высокой пластичности генома микоплазм. Обсуждаются филогенетическая история Mollicutes, пластичность их генома и патогенный потенциал вечной мерзлоты

Материал и методы

Отбор образцов

Почвенные образцы многолетнемерзлых отложений Арктики были собраны на Колымо-Индигирской низменности северо-восточной Сибири (69°299^ 156°599Е) в летний полевой сезон 2007 г . , согласно ранее описанной методике [15]. Образец 1С4 соответствует отложениям древнего старичного озера в пойме реки Пантелеиха: йН-2007/4; глубина - 22,5 м; 30696±394 лет [16]. Образец 1С8 был отобран из отложений ледового комплекса на реке Омолон: йН-2007/2; глубина 6 м . Возраст этого образца составляет 32000 лет [4]. Место отбора обоих образцов показано на карте (рис 1)

Выделение тотальной ДНК из почвы

и секвенирование

Из каждого образца брали по 200—300 мг почвы в восьми повторах . Для экстракции тотальной ДНК использовали Power Soil DNA extraction Kit (MoBIO, США). Затем ДНК концентрировали, применяя Genomic DNA Clean & Concentrator™ kit (Zymo Research, США). Метагеномное секвенирование выполняли в центре CRG (Centre for Genomic Regulation, Испания) с использованием v3 TruSeq SBS Kit на установке Illumina HiSeq 2000, протокол секвенирования 2x100 циклов . Полученные данные обрабатывали при помощи программы для удаления информации об адаптерах Cutadapt [17] и утилитой FastqJoin [18].

Обработка метагеномных данных

Данные секвенирования (образец IC4: 143,7 млн нуклеотидных последовательностей, средняя длина 138 н . п . ; образец IC8: 131,7 млн нуклеотидных последовательностей, средняя длина 150 н . п . ) были загружены на метагеномный аналитический сервер MG-RAST [19] с целью обнаружения среди секвени-рованных фрагментов ДНК участков генов известных микроорганизмов . Всего 6,6% (IC4) и 3,4% (IC8) последовательностей не прошли контроль качества (QC) и были отброшены; 0,3% всех последовательностей в обоих массивах данных принадлежали генам рРНК. Аминокислотные последовательности, кодируемые идентифицированными фрагментами ДНК, были проверены по белковой базе данных M5nr [20] при параметрах по умолчанию (порог E-value — 1е-5, минимальный уровень сходства выравниваемых последовательностей — 60%, минимальная длина выравниваемого участка — 15 аминокислот) . В обоих случаях применяли метод классификации best-hit . Информация о метагеномах образцов IC4 и IC8 доступна в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank (Sequence Read Archive (SRA)) под номерами SRX763249 и SRX751044, соответственно . Краткая аннотация метагеномов представлена в публикации [21]. Для составления таблиц информацию о нуклеотидных последовательностях и их продуктах, о функции и роли белков в биологических процессах брали из базы данных UniProt [22]. Данные по видовому разнообразию микоплазм в исследуемых образцах визуализировали при помощи Krona [23].

Рис. 1. 68° Место отбора

почвенных образцов многолетнемерзлых отложений (обозначено стрелкой):

Колымо-Индигирская низменность северовосточной Сибири (Б9°299N, 156°599Е)

Результаты

Видовой состав представителей класса Mollicutes в древних многолетнемерзлых отложениях Арктики, по данным метагеномного секвенирования

В метагеноме образца IC4, взятого из отложений древнего старичного озера в пойме реки Пан-телеиха (возраст 31 тыс . лет), были обнаружены фрагменты ДНК, обладающие высоким уровнем сходства с участками генов 191 вида современных представителей класса Mollicutes . Что касается образца IC8, отобранного из отложений ледового комплекса на реке Омолон (возраст 32 тыс . лет), то его метагеном содержит информацию о последовательностях ДНК, сходных с участками генов 132 видов микоплазм Общее количество фрагментов ДНК, принадлежащих с высокой долей вероятности представителям класса Mollicutes в двух метагено-мах составляет 36377 и 31121 последовательностей, соответственно . Средняя длина предсказанных аминокислотных последовательностей, кодируемых фрагментами древней ДНК, в метагеноме IC4 — 41,26 остатков, в метагеноме IC8 — 44,02 остатка . Уровень сходства предсказанных полипептидов с участками белков современных микоплазм варьирует от 52% до 97% (средний уровень сходства для IC4 - 71,23%; для IC8 - 69,77%) .

Микоплазмы в метагеномах исследуемых образцов (IC4 — рис . 2A; IC8 — рис . 2Б) представлены в основном тремя порядками: Acholeplasmatales, Entomoplasmatales и Mycoplasmatales . Mycoplas-matales по количеству обнаруженных в обоих ме-тагеномах фрагментов ДНК молликут находятся на первом месте (IC4 — 55%; IC8 — 54%) . На втором месте располагаются Acholeplasmatales (IC4 — 34%; IC8 — 35%) . Entomoplasmatales представлены в метагеномах в меньшей степени (IC4 — 11%;

IC8 — 12%) . Фрагменты ДНК анаэробных микоплазм Anaeroplasmatales были обнаружены только в метагеноме образца IC4, и все они с высокой долей вероятности принадлежат одному виду, Anaeroplasma abactoclasticum .

В образце IC4 род Mycoplasma в основном представлен следующими видами: Mycoplasma capricolum, M. penetrans, M. mycoides, M. pulmonis и M. gallisepticum; каждому из них принадлежит приблизительно по 4% от общего количества идентифицированных фрагментов ДНК микоплазм . Остальные виды рода Mycoplasma представлены 3% последовательностей и меньше . Среди них стоит отметить M. pneumoniae, M. artritidis, M. agalactiae и M. mobile . M. pneumoniae и M. penetrans являются патогенами человека [10, 24], M. agalactiae и M. capricolum заражают мелких жвачных животных [25, 26], M. artritidis вызывает артрит у человека и мышей [27], M. mycoides является широко распространенным патогеном коз [28], M. pulmonis вызывает пневмонию у грызунов [29], M. mobile инфицирует рыб [30], а M. gallisepticum — птиц [31]. В образце Ic8 среди видов рода Mycoplasma наиболее обильно представлены M. agalactiae (5% всех последовательностей ДНК микоплазм) . M. synoviae, M. pneumoniae, M. penetrans, M. mycoides и M. mobile представлены несколько меньшим количеством фрагментов ДНК (по 4%) M. synoviae является значимым патогеном домашних птиц [32] Остальные виды представлены 3% нуклеотид-ных последовательностей и меньше . Кроме того, к Mycoplasmatales относят и два вида уреаплазм, чья ДНК также была обнаружена в составе анализируемых метагеномов: Ureaplasma urealyticum и U. parvum (2—3%) . Оба вида вызывают заболевания урогенитального тракта и других органов человека [33]

Рис. 2. Видовой состав представителей класса Mollicutes в почвенных образцах многолетнемерзлых отложений Северо-Восточной Арктики, по данным метагеномного секвенирования: А — IC4 — осадок озерного происхождения, возраст 31 тыс. лет; Б — IC8 — отложения в ледовом комплексе, возраст 32 тыс. лет

Entomoplasmatales в метагеномах в основном представлены свободноживущей микоплазмой Mesoplasma florum. Этот микроорганизм не обладает патогенными свойствами, он впервые был выделен из растений Solidago sp . [34]. В обоих образцах по 6% из всех последовательностей ДНК микоплазм принадлежит M. florum. Также к порядку Entomoplasmatales относят род Spiroplasma . В метагеномах присутствуют фрагменты ДНК двух видов этого рода: Spiroplasma kunkelii и S. citri (2—3%) . Эти спироплазмы являются патогенами растений; S. citri поражает также насекомых [35, 36].

Среди Acholeplasmatales бесспорным лидером по количеству идентифицированных нуклеотидных последовательностей в метагеномах является «вездесущая» микоплазма, Acholeplasma laidlawii. Эту бактерию в свое время выделяли из различных почв, компоста, сточных вод, а также из тканей человека, животных и растений [10]. Количество последовательностей, с высокой долей вероятности принадлежащих древней A. laidlawii, в каждом метагеноме насчитывает около 20% от ДНК микоплазм Кроме A. laidlawii, Acholeplasmatales в метагеномах представлены несколькими видами фитоплазм, мико-плазм-паразитов растений (Phytoplasma, Candidatus Phytoplasma) . Среди них — Onion Yellows Phytoplasma (Candidatus Phytoplasma asteris str . OY-M, 7%) . Фитоплазмы паразитируют на тканях флоэмы инфицированных растений, переносятся насекомыми и вызывают различные заболевания сельскохозяйственных культур [37].

Сравнительный анализ участков белков древних и современных микоплазм на примере A. Laidlawii

В связи с тем, что на долю «вездесущей» мико-плазмы A. laidlawii в метагеномах приходится примерно пятая часть от общего числа всех идентифицированных последовательностей ДНК Mollicutes, мы решили использовать информацию об этой

микоплазме для сравнительного анализа участков белковых молекул, закодированных в древней ДНК, обнаруженной в составе анализируемых ме-тагеномов, с данными о современных их аналогах, представленных в GenBank (А. laidlawii PG-8A, №СР000896 . 1).

Общее количество нуклеотидных последовательностей, с высокой долей вероятности принадлежащих геному древней А. laidlawii, в метагеномах образцов 1С4 и 1С8 составляет 7793 и 5095, соответственно . Для сравнительного анализа мы выбрали лишь некоторые предсказанные полипептиды, кодируемые фрагментами ДНК древней ахолеплазмы . В таблице 1 представлена информация о 45 уникальных белках и соответствующих им генах А. laidlawii, чьи фрагменты были идентифицированы в метагеноме образца 1С4 . Среди них наибольшим сходством с современными аналогами обладают участки молекул рибосомных белков RplM и RpsK, а также белков и А^_0204, вовлеченных в процесс трансляции (кроме того, А^_0204 является белком холодового шока). 75% уровень сходства аминокислотных последовательностей и выше демонстрируют предсказанные полипептиды, вероятно, являющиеся частями белков А^_1219 (АТФаза АВС-типа, вовлеченная в транспорт олигопептидов), RecA (рекомбинация, индукция SOS-ответа), цитидилтрансфераза А^_1149 (синтез фосфолипидов), ОАРН-синтаза (синтез аминокислот), терминаза А^_0608 (трансфер генов), транскетолаза Тк1А (метаболизм карбогидратов), РНК-полимераза RpoB (транскрипция), шаперонин GгoEL; белки FabG1 (синтез жирных кислот), GlyA (биосинтез аминокислот), Рпр (катаболизм мРНК) и белки с неизвестной функцией А^_0036, А^_0039 и А^_1009 . Полипептиды, являющиеся, вероятно, участками белковых молекул ОарА (биосинтез лизина), металлопептидазы А^_1148 (гидролиз белков), ДНК-гиразы GyгA (изменение топологии ДНК) и ин-тегразы А^_0584 (семейство интеграз/рекомбиназ ХегСО), обладают меньшим уровнем сходства с последовательностями современных белков

Таблица 1. Белки А. laidlawii и соответствующие им гены, фрагменты которых обнаружены в метагеноме осадка озерного происхождения из поймы реки Пантелеиха (образец Ю4, возраст около 31 тыс. лет)

Ген

Белок

° й I- л

° £

5 с

3 2 i

Ml-s

* I X

ItDl-i

я

к о

re u i-

o

о

X о

X

н

u s

I-

_ re 2 a о a i- о Ф о

о *

ф 3

re >

ш

Роль в биологических процессах

pdhD дигидролипоамиддегидрогеназа 39 62 85 2e-07 гликолиз

ACL_1219 АТФаза транспортной системы АВС-типа 57 77 88 4e-17 транспорт олигопептидов

ACL_1103 АТФаза транспортной системы АВС-типа 35 66 83 1e-06 транспорт веществ

infB фактор инициации трансляции ^-2 35 97 97 6e-11 трансляция

tgt квеунин-тРНК-рибозилтрансфераза 39 72 79 2e-07 модификация пуринов тРНК

Продолжение таблицы 1

Ген Белок Длина выравниваемого фрагмента в аминокислотах % сходства % сходства с учетом консервативных замен E-value Роль в биологических процессах

рибонуклеаза НИ 45 64 76 7e-10 деградация РНК

ACL_0285 гипотетический белок 56 71 80 ^-16 функция неизвестна

ACL_0036 гипотетический белок 39 77 85 8e-11 ACL_1116

ACL_1089 NAD-зависимая эпимераза 40 70 93 5e-10 превращение сахаров

rplM рибосомный белок L13 (50S субъединицы) 30 80 90 5e-06 трансляция

ACL_0765 оксидоредуктаза семейства альдо/кеторедуктаз 29 62 79 2e-04 оксидоредуктазная активность

ACL_1116 гипотетический белок поверхности 38 66 87 ^-07 функция неизвестна

pdhB пируватдегидрогеназа Е1, бета-субъединица 37 65 78 4e-06 гликолиз

ACL_1004 механочувствительный ионный канал 38 74 95 3e-09 трансмембранный транспорт

asd аспартатполуальдегид-дегидрогеназа 33 67 76 3e-04 биосинтез аминокислот

rpsK рибосомный белок S11 (30S субъединицы) 40 85 100 5e-14 трансляция

gyrA ДНК-гираза, субъединица А 37 59 73 1e-04 изменение топологии ДНК

ACL_0037 пермеаза транспортной системы АВС-типа 35 74 91 1e-06 транспорт веществ

ACL_1149 цитидилтрансфераза 32 75 81 2e-06 синтез фосфолипидов

ACL_0039 гипотетический белок 51 82 90 1e-18 функция неизвестна

uvrB эксцизионная нуклеаза системы АВС,субъединица В 36 64 83 5e-06 эксцизия нуклеоида

recA белок рекомбинации RecA 38 92 97 6e-13 рекомбинация, репарация, SOS-ответ

metK2 S-аденозилметионинсинтетаза 42 71 79 4e-10 метаболизм углерода

eno энолаза 40 68 78 3e-07 гликолиз

ACL_0204 трансляционная ГТФаза TypA/ BipA-типа 42 79 83 3e-09 трансляция, холодовой шок

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ACL 0215 (1) DAHP-синтаза 43 60 72 2e-06 биосинтез ароматических аминокислот

ACL 0215 (2) DAHP-синтаза 31 71 81 3e-04 биосинтез ароматических аминокислот

ACL 0215 (3) DAHP-синтаза 55 85 93 2e-19 биосинтез ароматических аминокислот

Окончание таблицы 1

Ген Белок Длина выравниваемого фрагмента в аминокислотах % сходства % сходства с учетом консервативных замен E-value Роль в биологических процессах

fabB 3-оксоацил-АПБ-синтаза 2 44 70 77 3e-10 биосинтез жирных кислот

aroC хоризматсинтаза 33 61 70 3e-04 биосинтез ароматических аминокислот

groEL шаперонин GroEL 41 90 95 ^-12 фолдинг и ре-фолдинг белков

ACL_0608 терминаза, большая субъединица, вероятный белок 43 95 100 4e-17 перенос генов

ACL_1050 аминотрансфераза 40 65 75 2e-06 азотистый обмен

tktA транскетолаза 39 85 90 3e-10 метаболизм углеводов

greA фактор элонгации транскрипции GreA 40 70 78 6e-07 транскрипция

ACL 1009 (1) гипотетический белок поверхности 32 75 91 7e-08 функция неизвестна

ACL 1009 (2) гипотетический белок поверхности 27 85 89 4e-06 функция неизвестна

gnd 6-фосфоглюконатдегидрогеназа 43 67 84 2e-10 пентозофосфатный шунт

tpiA триозофосфатизомераза 29 66 93 7e-04 гликолиз, пентозофосфатный шунт

fabG1 бета-кетоацил-АПБ-редуктаза 33 82 88 3e-07 биосинтез жирных кислот

g|yA глицингидроксиметилтрансфе-раза 40 78 93 9e-12 биосинтез аминокислот

ACL_0584 тирозинрекомбиназа/ интеграза семейства XerDC 38 58 68 9e-04 интеграция ДНК

rpoB РНК-полимераза, бета-субъединица 59 95 98 2e-26 транскрипция

dapA дигидропиколинатсинтаза 47 57 66 2e-06 биосинтез аминокислот

hsdM1 сайт-специфичная система рестрикции-модификации типа I, субъединица M 47 74 81 8e-13 модификация ДНК

ACL_0724 субстрат-связывающий компонент транспортной системы типа АВС 48 60 79 2e-10 транспорт сахаров

ACL_1148 металлопептидаза семейства М50 54 56 69 2e-07 гидролиз белков

pnp полирибонуклеотиднуклео-тидилтрансфераза 37 84 95 4e-10 катаболизм мРНК

В табл . 2 собраны данные о 27 уникальных белках и генах А. laidlawii, фрагменты которых были обнаружены в метагеноме образца 1С8 . Среди них более, чем 75% сходством обладают участки белковых молекул А^_0651 (два фрагмента, транспортная система АВС-типа), RplD, LepA (трансляция), йеоА (метаболизм пиримидинов) и ДНК-гиразы GyгB . 6 полипептидов обладают сравнительно низким уровнем сходства с участками современных белков микоплазмы (менее 60% аминокислот в сравниваемых последовательностях являются идентичными): они относятся к белкам FusA (трансляция), SufB1

(сборка FeS-кластера, связанного с ассимиляцией серы), А^_1132 (транспорт катионов), А^_0869 (катаболизм нуклеозидов), NAD-зависимой эпи-меразе А^_1089 (превращение сахаров) и АптК (метаболизм карбогидратов). Уровень сходства остальных предсказанных полипептидов с участками белков современной А. laidlawii варьирует между 60 и 75% . В целом, в метагеноме образца 1С4 представлено больше последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды с высоким уровнем сходства (более 75%) с участками белков современных ми-коплазм, чем в метагеноме образца 1С8 .

Таблица 2. Белки A. laidlawii и соответствующие им гены, фрагменты которых обнаружены в метагеноме осадка из ледового комплекса на реке Омолон (образец IC8, возраст около 32 тыс. лет)

Ген

Белок

о

g 3

0 мо

лл^

М£0

1 О Ü cdmSO

ХЛ1-Х

saros ЧиФл

л

GÛ I-

о

и

о

X о

л

5 s

Ч О

х •

О 7

X

н

GÛ S I-

л

Я*

О о

- s

^о л о* о

ф

з

л >

Ш

Роль в биологических процессах

gltX глутамил-тРНК-синтетаза 38 68 82 5e-08 биосинтез белков

pyk пируваткиназа 52 60 71 1e-08 гликолиз

rpoA РНК-полимераза, альфа-субъединица 58 69 81 3e-15 транскрипция

ACL 0651 (1) АТФ-связывающий белок транспортной системы АВС-типа 41 90 100 5e-14 транспорт веществ

ACL 0651 (2) АТФ-связывающий белок транспортной системы АВС-типа 48 77 92 8e-15 транспорт веществ

ACL 0760 (1) АТФаза транспортной системы АВС-типа 45 64 82 6e-09 транспорт веществ

ACL 0760 (2) АТФаза транспортной системы АВС-типа 47 66 83 6e-11 транспорт веществ

sufB1(1) белок сборки FeS-кластера SUF системы 31 74 94 2e-06 образование железосерного кластера

sufB1 (2) белок сборки FeS-кластера SUF системы 44 57 80 2e-08 образование железосерного кластера

sufB1 (3) Белок сборки FeS-кластера SUF системы 29 72 90 6e-05 образование железосерного кластера

truB тРНК-псевдоуридинсинтаза В 35 69 83 1e-05 процессингтРНК

srmB1 DEAD box АТФ-зависимая РНК-геликаза 44 68 77 1e-08 изменение топологии РНК

pstB АТФаза транспортной системы АВС-типа 31 68 81 1e-04 импорт фосфатов

rplD рибосомный белок L4 48 79 85 5e-16 трансляция

eno (1) энолаза 31 65 77 5e-04 гликолиз

eno (2) энолаза 43 74 88 7e-12 гликолиз

rpsQ рибосомный белок S17 50 64 70 1e-09 трансляция

tdk тимидинкиназа 43 65 81 2e-08 биосинтез ДНК

Окончание таблицы 2

Ген

Белок

0

§ 8

1 ■ 5

rereq

иьо

I 5 И

cumSO ХЛ1-Х

re u

s ^ 2

8 ®

X

н

u s

Ire u a

е

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

о

т _

> О о *

Ф 3

re >

Ш

Роль в биологических процессах

ACL_1132 АТФаза катионного транспорта 45 56 73 9e-06 транспорт ионов металлов

ACL_1089 NAD-зависимая эпимераза 45 53 69 7e-06 превращение сахаров

fusA фактор элонгации G 37 54 76 2e-04 трансляция

prfB (1) фактор высвобождения пептидной цепи RF-2 41 73 83 1e-09 терминация трансляции

prfB (2) фактор высвобождения пептидной цепи RF-2 31 71 87 2e-04 терминация трансляции

lepA (1) ГТФ-связывающий белок LepA 46 89 93 5e-15 трансляция

lepA (2) ГТФ-связывающий белок LepA 34 65 79 2e-05 трансляция

trmD тРНК-(гуанин-^1)-)-метилтрансфераза 39 67 85 2e-08 процессингтРНК

ACL_0869 дезоксирибонуклеотидтри-фосфатпирофосфатаза 39 56 67 4e-05 катаболизм нуклеозидтри-фосфатов

pheS фенилаланил-тРНК-синтетаза, альфа-субъединица 43 74 86 9e-12 биосинтез белков

prfA фактор высвобождения пептидной цепи RF-1 35 66 86 1e-05 биосинтез белков

deoA тимидинфосфорилаза 55 87 95 6e-19 метаболизм пиримидинов

maf Maf-подобный белок 37 68 86 6e-07 ингибирование септообразования

anmK гипотетический белок 47 57 77 2e-08 метаболизм карбогидратов

atpD Н+-транспортная АТФаза F-типа, бета-субъединица 47 66 79 1e-10 регуляция протонного транспорта и синтеза АТФ

gyrB ДНК-гираза, субъединица В 53 83 87 2e-18 изменение топологии ДНК

Обсуждение

Приблизительная оценка основных этапов эволюции организмов класса Mollicutes была предложена Дж . Маниловым . Эта оценка выполнена на основании результатов анализа генов 16S рРНК современных микоплазм и сопоставления полученных филогенетических данных с известными геологическими и палеонтологическими событиями в истории Земли [38]. Исходя из размеров генома существующих микроорганизмов, предки современных микоплазм произошли, вероятно, из ветви стрептококков с низким содержанием G + C, содержащей виды организмов с размерами геномов 1700—2600 Кб и отделились от них в Позднем Протерозое, около 605 млн лет назад Первичные микоплазмы, вероятно, были похожи на ахолеплазм (то есть факультативных

аэробов, метаболически близких к стрептококкам) и на облигатных анаэробных анаэроплазм, развившихся позже из ахолеплазм . После отделения от стрептококков следующее ветвление этой линии произошло, вероятно, около 470 млн лет назад, во времена Среднего Ордовика, с образованием двух линий, обозначаемых как ААР (Acholeplasma, Anaeroplasma, Asteroleplasma и Phytoplasma) и SEM (Spiroplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, и Urea-plasma). Образование этих ветвей древних молли-кут, предположительно, сопровождалось сокращением геномов, потерей генов синтеза клеточной стенки, генов рРНК и, возможно, некоторых других генов . Далее, на границе Силура и Девона, примерно 410 млн лет назад, ветвь SEM разделилась, образовав две ветви предков современных семейств

Spiroplasmatacae-Entomoplasmataceae и ветвь Mycoplasmataceae (рис . 3). Предки современных Spiroplasmatacae и Entomoplasmataceae разошлись в средней Юре, около 170 млн лет назад [38]. Если эти эволюционные построения верны, предки микроорганизмов класса Mollicutes были дифференцированы на группы, соответствующие четырем порядкам и всем девяти современным семействам (включая фитоплазм, таксономический статус которых до сих пор не определен) не менее 170 млн лет назад . Поэтому не удивительно, что в пробах из многолетне-мерзлых отложений (31—32 тыс . лет) сохранились фрагменты ДНК, относящиеся к представителям столь многих видов и семейств класса Mollicutes

Рис. 3. Филогенетическое древо Mollicutes, показывающее расхождение их на две основные ветви: AAP (Acholeplasma, Anaeroplasma, Asteroleplasma и Phytoplasma) и SEM (Spiroplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, Ureaplasma). По [38], с изм.

В целом, соотношение микоплазм — паразитов животных и человека, свободноживущих микоплазм и фитопатогенных представителей класса Mollicutes в обоих метагеномах является примерно одинаковым . При этом доля фрагментов ДНК каждого вида Mollicutes среди всех последовательностей, относящихся к микоплазмам, между метагеномами варьирует незначительно, за исключением таких видов, как M. agalactiae и Ca . P. asteris str . OY-M . Это могло бы указывать на сходство древних арктических экосистем между собой . Однако, сравнительный анализ видового разнообразия ближайших родственников микоплазм — лактобацилл (Lactobacillales), представленных в метагеномах образцов IC4 и IC8 в значительно большем количестве, демонстрирует в разных образцах сопоставимое число видов (249 и 233, соответственно) и слабые изменения в их процентном соотношении, но при этом по обилию фрагментов ДНК лактобацилл многолетнемерзлые отложения озерного происхождения (IC4) значительно уступают ледовому комплексу позднего плейстоцена (IC8) (278 тыс . нуклеотидных последовательностей против 383 тыс ) Еще ярче подобные различия в обилии фрагментов ДНК проявляются для бактерий Bacillales: 2 млн последовательностей в образце IC8 против 1,3 млн в IC4 . Данный результат выглядит логичным: на дне озера должно обитать меньше бактерий, чем в верхнем слое почвы

Тот факт, что почти 20% аннотированных последовательностей микоплазм в метагеномах принадлежит одному виду, «вездесущей» микоплазме A. laidlawii, не только говорит о повышенных адаптационных возможностях этой бактерии по сравнению с другими представителями молликут, но и коррелирует с представлениями о том, что, вероятно, ахо-леплазмы являются предками остальных микоплазм [38], хотя 30 тыс . лет — это всего лишь 0,005% от предполагаемого общего времени филогенетической истории Mollicutes .

Заслуживает внимания информация об уровне сходства аминокислотного состава аннотированных последовательностей микоплазм с их современными аналогами . Среднее значение в 70%, при колебаниях от 52 до 97%, даже если учесть возможные отличия между различными штаммами микроорганизмов одного вида, говорит о том, что за 30 тыс лет, по-видимому, многие гены микоплазм и кодируемые ими белки подверглись значительным модификациям . Это хорошо коррелирует с феноменально высоким темпом реорганизации генома микоплазм, создающим определенные трудности в классификации «минимальных» бактерий [39, 40]. Значительно больше информации об эволюции «минимальной» клетки могло бы дать сравнение полных геномов микроорганизмов одного вида, древних и современных, но для их сборки имеющихся метагеномных данных крайне недостаточно, а выделить живые микоплаз-мы из вечной мерзлоты пока не удалось . Однако, можно предположить, что количество неконсервативных аминокислотных замен, вероятно, коррелирует со степенью важности белков для обеспечения протекания ключевых процессов в микоплазменной клетке

В целом малое по сравнению со многими другими классами бактерий (Bacilli, Clostridia) количество последовательностей ДНК, обладающих высоким уровнем сходства с участками генов микоплазм, в образцах арктических почв говорит о низкой вероятности обнаружения живых микроорганизмов класса Mollicutes в вечной мерзлоте Сложно говорить и о жизнеспособности клеток микоплазм, вероятно, сохраняющихся в мерзлых почвах. Особенно это касается облигатных паразитов человека и животных, которым для существования и размножения строго необходим организм-хозяин Однако, в условиях усиливающегося год от года сезонного таяния многолетнемерзлых толщ, вероятно, связанного с изменениями климата, а также в результате промышленных разработок, учитывая пластичность генома мико-плазм, нельзя исключать возможности выхода на поверхность древних высокоинвазивных штаммов с повышенной инфектогенностью В связи с этим приобретает особую важность комплексная оценка патогенного потенциала вечной мерзлоты с использованием методов классической микробиологии и метагеномного анализа .

Благодарности

Работа выполнена за счет средств Российского научного фонда (Проект №14-14-01115).

ЛИТЕРАТУРА:

I. Vorobyova E ., Soina V ., Gorlenko M . et al . The deep cold biosphere: facts and hypothesis . FEMS Microbiol . Rev . 1997; 20(3): 277-90 .

2 . Gilichinsky D .A ., Wagener S ., Vishnivetskaya T .A . Permafrost microbiology . Permafrost Periglacial Processes 1995; 6: 281-91.

3 . Gilichinsky D .A., Rivkina E . M . Permafrost Microbiology. In: Reitner J ., Thiel V . , editors . Encyclopedia of Geobiology . New York: Springer; 2011. p . 726-32 .

4 . Legendre M ., Bartoli J ., Shmakova L. et al . Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology . PNAS USA 2014; 111(11): 4274-9 .

5 . Legendre M ., Lartigue A., Bertaux L . et al . In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba . PNAS USA 2015; 112(38): E5327-35 .

6 . Steven B ., Briggs G ., McKay С . P . et al . Characterization of the microbial diversity in a permafrost sample from the Canadian high Arctic using culture-dependent and culture-independent methods . FEMS Microbiol . Ecol . 2007; 59(2): 513-23 .

7 . Graham D ., Wallenstein M ., Vishnivetskaya T . et al . Microbes in thawing permafrost: the unknown variable in the climate change equation . ISME J . 2012; 6(4): 709-12 .

8 . Jansson J . K ., Ta§ N . The microbial ecology of permafrost . Nature Rev . Microbiol . 2014; 12(6): 414-25 .

9 . Mackelprang R ., Waldrop M . P, DeAngelis K . M . et al . Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw . Nature 2011; 480(7377): 368-71.

10 . Razin S ., Yogev D ., Naot Y . Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas . Microbiol . Mol . Biol . Rev . 1998; 62(4): 1094-156 .

II. Morowitz H . J ., Tourtelotte M . E . The smallest living cells . Scientific American 1962; 206: 117-26 .

12 . Morowitz H . J . The completeness of molecular biology . Isr . J . Med . Sci . 1984; 20(9): 750-3 .

13 . Woese С . R . Bacterial evolution . Microbiol . Rev . 1987; 51(2): 221-71.

14 . Вишняков И . Е . , Борхсениус С . Н . Белки теплового шока ми-коплазм и кодирующие их гены . Микробиология 2013; 82(6): 64359 . (перевод: Vishnyakov I . E ., Borchsenius S . N . Mycoplasma heat shock proteins and their genes . Microbiology (Mikrobiologija) 2013; 82(6): 653-67

15 . Shi T ., Reeves R . H ., Gilichinsky D .A . et al . Characterization of viable bacteria from Siberian permafrost by 16S rDNA sequencing . Microbiol . Ecol . 1997; 33(3): 169-79 .

16 . Краев Г . Н ., Шульце Э .Д ., Ривкина Е . М . Криогенез как фактор распределения метана в горизонтах мёрзлых пород . ДАН 2013; 451(6): 684-7 .

17 Martin M Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads . EMBnet J . 2011; 17(1): 10-2 .

18 . Aronesty E . Comparison of sequencing utility programs . The Open Bioinformatics J . 2013; 7: 1-8 .

19 . Meyer F ., Paarmann D ., D'Souza M . et al . The metagenomics RAST server — a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes . BMC Bioinformatics 2008; 9: 386 .

20 . Wilke A ., Harrison T ., Wilkening J . et al . The M5nr: a novel non-redundant database containing protein sequences and annotations from multiple sources and associated tools . BMC Bioinformatics 2012; 13: 141.

21. Krivushin K ., Kondrashov F ., Shmakova L . et al . Two metagenomes from Late Pleistocene Northeast Siberian permafrost . Genome Ann . 2015; 3(1): e01380-14 .

22 . UniProt Consortium . UniProt: a hub for protein information . Nucl . Acids Res . 2014; 43(Database issue): D204-12 .

23 . Ondov B . D ., Bergman N . H ., Phillippy A. M . Interactive metagenomic visualization in a web browser. BMC Bioinformatics 2011; 12: 385 .

24 . Medjo B ., Atanaskovic-Markovic M ., Radic S . et al . Mycoplasma pneumoniae as a causative agent of community-acquired pneumonia in children: clinical features and laboratory diagnosis Ital J . Pediatr . 2014; 40: 104.

25 . March J . B . , Harrison J . C ., Borich S . M . Humoral immune responses following experimental infection of goats with Mycoplasma capricolum subsp . capripneumoniae . Vet. Microbiol . 2002; 84(1-2): 29-45 .

26 . Kumar A., Rahal A. , Chakraborty S . et al . Mycoplasma agalactiae, an etiological agent of contagious agalactia in small ruminants: a review . Vet . Med . Int . 2014; 2014: 286752 .

27 . Koening C . L ., Mu H . H ., Van Schelt A . et al . Hepcidin is elevated in mice injected with Mycoplasma arthritidis . J . Inflamm . tLond . ) 2009 . 6: 33

28 . Thiaucourt F ., Bolske G . Contagious caprine pleuropneumonia and other pulmonary mycoplasmoses of sheep and goats Rev Sci Tech . 1996; 15(4): 1397-414.

29 Jacoby R O , Lindsey J R Health care for research animals is essential and affordable . FASEB J . 1997; 11(8): 609-14 .

30 . Kirchhoff H ., Rosengarten R . Isolation of a motile mycoplasma from fish . J . Gen . Microbiol . 1984; 130(9): 2439-45 .

31. Wijesurendra D . S . , Kanci A ., Tivendale K .A . et al . Development of a Mycoplasma gallisepticum infection model in turkeys Avian Pathol 2015; 44(1): 35-42 .

32 . Kursa O ., Wozniakowski G ., Tomczyk G . et al . Rapid detection of Mycoplasma synoviae by loop-mediated isothermal amplification Arch . Microbiol . 2015; 197(2): 319-25 .

33 . Murtha A. P . , Edwards J . M . The role of Mycoplasma and Ureaplasma in adverse pregnancy outcomes . Obstet . Gynecol . Clin . North Am . 2014; 41(4): 615-27 .

34 Whitcomb R , Tully J , Rose D et al Wall-less prokaryotes from fall flowers in central United States and Maryland Curr Microbiol 1982; 7: 285-90

35 Carpane P , Melcher U , Wayadande A et al An analysis of the genomic variability of the phytopathogenic mollicute Spiroplasma kunkelii . Phytopathology 2013; 103(2): 129-34 .

36 Duret S , Batailler B , Dubrana M P et al Invasion of insect cells by Spiroplasma citri involves spiralin relocalization and lectin/ glycoconjugate-type interactions . Cell . Microbiol . 2014; 16(7): 1119-32 .

37 Kirkpatrick B C Mycoplasma-like organisms: plant and invertebrate pathogens . In: Balows A ., Truper H . G ., Dworkin M . et al ., editors . The Prokaryotes . 2nd ed . New York: Springer-Verlag; 1992 . p.4050-67 .

38 Maniloff J Phylogeny and evolution In: Rasin S , Herrmann R , editors Molecular biology and pathogenisity of mycoplasmas New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers; 2002 . p . 31-44 .

39 Brown D R , Bradbury J M The contentious taxonomy of Mollicutes In: Browning G F , Citti C , editors Mollicutes: Molecular Biology and Pathogenesis Norfolk, UK: Horizon Scientific Press; 2014 . p . 1-14 .

40 Marenda M Genomic mosaics In: Browning G F , Citti C , editors Mollicutes: Molecular Biology and Pathogenesis Norfolk, UK: Horizon Scientific Press; 2014 . p . 15-54 .

Поступила: 15.10.2015

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.