CC BY
72
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 3
Вып. 4
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 612.44+612.821
Е. Л. Доведова, Н. Д. Ещенко
ДИСБАЛАНС НЕЙРОМЕДИАТОРНЫХ СИСТЕМ В СТРУКТУРАХ МОЗГА КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ НЕЙРОЛЕПТИКА И ВОЗМОЖНОСТЬ КОРРЕКЦИИ ПЕПТИДОМ ТАФЦИНОМ
Для изучения психо- и невропатологических нарушений в экспериментальной неврологии используется моделирование дисфункции дофаминергической системы при фармакологической индукции — длительное введение лекарственных препаратов животным, приводящее к развитию экспериментального паркинсонизма [1-3]. Известно, что введение нейролептиков вызывает изменение поведения, нарушение двигательной активности и в целом характеризуется как депрессивноподобное состояние. В значительной степени такие нарушения опосредованы воздействием этих препаратов на метаболизм дофамина, а именно — блокированием Д2-рецепторов и нарушением обратного захвата медиатора (в экспериментах с галоперидолом), или ингибированием работы везикулярного транспортера моноаминов VMAT-2, приводящим к замедлению включения медиатора в везикулы (в опытах с резерпином) [4, 5].
При анализе причин развития болезни Паркинсона и паркинсоноподобных двигательных расстройств наряду со сдвигами в метаболизме ДА исследователи особое внимание уделяют нарушению баланса и взаимосвязи основных нейромедиаторных систем в структурах мозга. В первую очередь речь идет о соотношении между дофа-минергической системой, с одной стороны, и серотонинергической и холинергической системами — с другой [6, 7]. В целом изменение эффективности нейропередачи in vivo вызывает появление специфических симптомов, таким образом, можно говорить о развитии синдрома дисфункции медиаторных систем.
При лечении двигательных нарушений в клинике используются различные лекарственные препараты, способствующие нормализации нейромедиаторных процессов, однако при их длительном использовании нередко проявляются побочные эффекты и привыкание, требующее повышения дозы лекарств. Для выхода из этих затруднений актуален поиск новых антипаркинсонических препаратов, применение которых позволило бы избежать подобных недостатков [8, 9]. В этом отношении большое
Доведова Елизавета Леонтьевна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория ультраструктуры и цитохимии мозга Научного центра неврологии РАМН; e-mail: [email protected]
Ещенко Наталья Дмитриевна — доктор биологических наук, профессор, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected] © Е. Л. Доведова, Н. Д. Ещенко, 2013
внимание уделяют природным биологически активным веществам, в том числе коротким пептидам — эндогенным соединениям, участвующим в регуляции многих физиологических функций. Действие таких регуляторных пептидов сводится к нейрохимическим пластическим перестройкам мозга на клеточном и субклеточном уровнях [10-13].
Особый интерес представляют пептиды, обладающие широким спектром регуляторных функций: от стресс-протективного и антидепрессивного до гипногенного и обезболивающего действий [14-16]. Одним из таких регуляторных пептидов является тетрапептид тафцин (Tyr-Lys-Pro-Arg) и его синтетические аналоги [17, 18].
Целью данной работы было изучение взаимоотношения дофамин- и серото-нинергической систем в условиях длительного воздействия нейролептика галоперидо-ла и выяснение роли тетрапептида тафцина на фоне развивающегося экспериментального паркинсонизма.
В задачу исследования входило определение активности моноаминоксидаз А и Б, уровня нейромедиаторов: дофамина и серотонина, а также конечных продуктов их метаболизма в хвостатом ядре и сенсомоторной зоне коры мозга крыс.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проводили на половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 200-250 г, разделенных на две группы по 10 животных в каждой. Экспериментальным животным 1-й группы ежедневно внутрибрюшинно вводили галоперидол («Гедеон Рихтер») в дозе 0,5 мг/кг массы тела в течение 30 дней. Животным 2-й группы на фоне последнего введения препарата галоперидола однократно вводили тетрапептид таф-цин (Serva) в дозе 0,5 мг/кг массы тела; время действия тафцина составляло один час. Контролем служили интактные животные (n = 10). В течение всего эксперимента животных содержали в условиях свободного доступа к воде и пище при 12-часовой смене освещенности. Обращение с животными соответствовало требованиям «Правил лабораторной практики в Российской федерации (GLP)», Москва, 2003.
В день опыта крыс декапитировали под легким эфирным наркозом. Мозг извлекали на холоде и промывали в охлажденном растворе сахарозы (0,32 М). Ткань исследуемых образований мозга — сенсомоторной коры и хвостатого ядра — гомогенизировали в растворе сахарозы (0,32 М); в 10%-ном гомогенате флуориметрически определяли содержание дофамина (ДА), серотонина (5'-ОТ) и 5'-оксииндолуксусной кислоты (5'-ОИУК) в одной пробе по методу Б. Н. Когана и Н. В. Нечаева [19], а также гомовани-линовой кислоты (ГВК) по методу из работы [20]. Содержание биогенных аминов и их метаболитов выражали в пг/г ткани.
Из гомогената исследуемых структур мозга с помощью дифференциального центрифугирования (10 000 g, 15 мин) выделяли фракцию «грубых» митохондрий, которую использовали для спектрофотометрического определения активности ферментов. Активность моноаминоксидазы типа А (МАО А) определяли, используя серотонин как субстрат, по методу Н. Попова и соавторов [21] в нашей модификации [22]. Активность моноаминоксидазы типа Б (МАО Б) с n-нитрофенилэтиламином в качестве субстрата анализировали по методу из работы [23]. Активность ферментов выражали в условных единицах: ДЕ250 (для МАО А) или ДЕ450 (для МАО Б), рассчитанных на 1 мг белка митохондриальной фракции за 60 мин. Содержание белка в пробах определяли при длине волны 750 нм по общепринятому методу Лоури.
Полученные экспериментальные данные анализировали с помощью пакета статистических программ <^ТАТКТГСА 5.0». Различия между контрольной и опытными группами считали достоверными при р < 0,05.
Результаты исследований и их обсуждение
В наших экспериментах после введения препарата галоперидола в течение первых 15-20 мин крысы проявляли двигательное беспокойство, затем успокаивались и к 60-й мин замирали в определенной позе, характеризовавшейся скованностью и ригидностью мышц. После 30-суточного ежедневного введения препарата состояние животных ухудшалось, фаза возбуждения сокращалась, уменьшалась масса тела, наблюдался тремор головы и хвоста. Снижение общей двигательной активности, бради-кинезия свидетельствовали о наступлении выраженной формы экспериментального паркинсонизма.
Длительное введение животным галоперидола приводило к значительным изменениям активности обеих форм МАО в исследованных структурах мозга (табл. 1). Активность оксидазы, преимущественно окисляющей ДА (МАО Б), в этих условиях снижалась, причем более выраженным уменьшение активности фермента было в хвостатом ядре (на 37%), в то время как в коре мозга выявлена лишь тенденция к замедлению окисления ДА.
Несколько иной характер носили изменения активности МАО А, окисляющей 5'-ОТ (см. табл. 1). На фоне значительного (более чем в 1,5 раза) повышения активности МАО А в хвостатом ядре, в коре мозга при длительном действии нейролептика этот показатель, напротив, несколько уменьшался.
Таблица 1. Активность моноаминоксидаз в структурах мозга крыс при длительном введении галоперидола и краткосрочном воздействии тафцина (М± т, п = 10)
Активность ферментов, АЕ /мг белка за 60 мин Условия эксперимента
Контроль Галоперидол Галоперидол + тафцин
Сенсомоторная зона коры мозга
МАО Б, АЕ450 2,96 ± 0,19 2,36 ± 0,18 3,26 ± 0,30
МАО А, АЕ250 8,71 ± 0,58 6,14 ± 0,49* 4,78 ± 0,28*
Хвостатое ядро
МАО Б, АЕ450 2,17 ± 0,20 1,37 ± 0,13* 3,02 ± 0,40*'+
МАО А, АЕ250 7,37 ± 0,12 11,12 ± 0,19* 5,99 ± 0,15*-+
Примечание. * — статистически значимые отклонения (р < 0,05) от
контроля; +--статистически значимые отклонения (р < 0,05) группы «гало-
перидол + тафцин» от группы «галоперидол» (то же для табл. 2).
Однократное введение животным тафцина на фоне длительного действия гало-перидола позволило обнаружить нормализующий эффект тетрапептида (см. табл. 1), причем направленность изменений активности обеих форм МАО была противоположна тем, которые найдены в исследованных структурах мозга при действии только
нейролептика. Более выраженные изменения активности обнаружены в хвостатом ядре. Так, активность МАО Б в этой структуре возрастала в 2,2 раза (по сравнению с показателем группы «галоперидол»), а существенно увеличенная под влиянием нейролептика активность МАО А после инъекции тафцина снижалась в среднем на 48%. Таким образом, в этих экспериментах показано реципрокное изменение под влиянием галоперидола активности моноаминоксидаз, связанных с дофаминергической (МАО Б) или серотонинергической системой (МАО А), и отмечена противоположная направленность эффектов тетрепептида тафцина по сравнению с воздействием нейролептика.
Более полно охарактеризовать состояние исследуемых медиаторных систем позволяет сопоставление изменений активности моноаминоксидаз с количеством ней-ромедиаторов и продуктов их катаболизма (табл. 2).
Таблица 2. Влияние тафцина на содержание биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга при длительном введении галоперидола (М ± т, п = 10)
Содержание биогенных аминов и их метаболитов, пг/г ткани Условия эксперимента
Контроль Галоперидол Галоперидол + тафцин
Сенсомоторная зона коры мозга
ДА 717,6 ± 8,4 598,4 ± 13,4 645,8 ± 18,3
ГВК 7,8 ± 0,8 5,7 ± 0,9* 7,4 ± 0,8+
5'-ОТ 160,1 ± 12,6 138,5 ± 9,2 156,9 ± 8,1+
5'-ОИУК 118,1 ± 10,0 120,7 ± 9,1 118,4 ± 9,4
Хвостатое ядро
ДА 2260,4 ± 64,2 1310,6 ± 12,6* 2168,0 ± 51,6+
ГВК 6,9 ± 0,8 2,4 ± 0,9* 6,4 ± 0,7+
5'-ОТ 271,4 ± 15,2 274,5 ± 12,0 360,2 ± 9,8*-+
5'-ОИУК 350,5 ± 16,3 754,7 ± 8,4* 508,5 ± 12,3*'+
Введение галоперидола в течение 30 дней приводило к снижению уровня самого нейромедиатора — дофамина, и особенно продукта его катаболизма — ГВК, в исследованных образованиях мозга (см. табл. 2). Более выраженным было уменьшение количества ДА и ГВК в хвостатом ядре по сравнению с корой. Так, в хвостатом ядре экспериментальных животных содержание ДА составляло 57%, а ГВК — около 35% от контрольного уровня, в то время как изменение уровня нейромедиатора в коре имело лишь тенденцию к снижению, а статистически значимым (на 23%) было уменьшение количества ГВК.
Подавление как синтеза нейромедиатора, так и его окисления при длительном действии галоперидола согласуется с имеющимися в литературе сведениями об инги-бировании всех этапов метаболизма дофамина [24]. В сходных условиях эксперимента под влиянием галоперидола нами также было показано снижение активности тиро-зингидроксилазы на 39% в хвостатом ядре мозга крыс [25]. Наряду с замедлением метаболизма ДА гипофункция дофаминергической системы при длительном действии
галоперидола характеризуется блокадой до 70-75% Д2-рецепторов, торможением обратного захвата нейромедиатора, а также вторичной активацией катаболизма 5'-ОТ [26].
В результате краткосрочного воздействия тафцина на фоне длительного введения животным галоперидола показано (см. табл. 2) изменение исследованных показателей метаболизма ДА в сторону их нормализации, а именно — в сенсомоторной зоне коры содержание нейромедиатора несколько повышалось по сравнению с уровнем ДА у крыс, которым вводили галоперидол, составляя около 90% по сравнению с контролем. Количество ГВК в этой структуре изменялось под влиянием тафцина статистически значимо, увеличиваясь практически до контрольных значений. Более выраженной была нормализация показателей обмена ДА в хвостатом ядре, где содержание нейромедиатора возрастало в 1,65 раза, а уровень его метаболита — в 2,7 раза по сравнению с показателями у животных после длительного введения нейролептика, и данные значения приближались к цифрам у контрольных животных. Эти изменения согласуются с установленной активностью МАО Б в обоих образованиях мозга (см. табл. 1).
Некоторый нормализующий эффект однократного введения тафцина на фоне длительного действия галоперидола выявлен и в отношении метаболизма серотонина (см. табл. 2): в хвостатом ядре содержание 5'-ОИУК снижалось почти в 1,5 раза по сравнению с уровнем метаболита у крыс, которым вводили галоперидол, что сопровождалось уменьшением активности МАО А (см. табл. 1). Однако уровень самого нейро-медиатора в хвостатом ядре после введения тафцина возрастал примерно на 30%, что указывает на нарушение равновесия между процессами синтеза и окисления серото-нина. В сенсомоторной коре после введения тафцина количество серотонина и конечного продукта его метаболизма было в пределах контрольных значений.
На основании полученных результатов можно сделать заключение, что длительное введение препарата, вызывающего нарушение метаболизма дофамина (галоперидол) сопровождается выраженным дисбалансом исследованных медиаторных систем — дофамин- и серотонинергической. Это может лежать в основе экстрапирамидных нарушений — расстройств двигательной активности и психической деятельности [6, 27]. Судя по электрофизиологическим и поведенческим показателям, состояние животных изменяется от депрессивно-подобного при коротких экспозициях до явления бради-кинезии при хроническом применении галоперидола [28].
Полученные нами материалы о нормализующем эффекте тафцина на активность ферментов и содержание нейромедиаторов в условиях длительного воздействия гало-перидола позволяют предположить, что регулирующее действие этого пептидного препарата на метаболизм биогенных аминов, в первую очередь ДА, по-видимому, опосредовано его влиянием на синаптическую передачу, что может привести к перестройкам медиаторных систем мозга, а на поведенческом уровне проявиться в широком спектре антипсихотических эффектов. Ранее нами и другими исследователями показано, что введение крысам тафцина приводит к изменению ЭЭГ активности и уменьшению бра-дикинезии [29, 30].
Известно, что модулирующее действие пептидов более ярко проявляется в тех системах, где патологические процессы выражены в наибольшей степени [11, 14], что нашло подтверждение и в наших экспериментах: действие галоперидола первично направлено на нигростриатную систему, и именно в хвостатом ядре, по нашим данным, влияние тафцина более выражено по сравнению с сенсомотрной зоной коры мозга.
В целом полученные нами результаты можно рассматривать как предпосылки к испытанию коротких пептидов в качестве лекарственных средств при патологических состояниях, сопровождающихся развитием острого синдрома гипофункции до-фаминергической системы.
Литература
1. Монаков М. Ю., Доведова Е. Л. Сравнительный анализ биогенных аминов при моделировании гипо- и гиперфункции моноаминергической медиаторной системы // Нейрохимия. 1998. Т. 15, № 3. С. 286-292.
2. Dauer W., Przedborski S. Parkinson' s disease: mechanisms and models // Neuron. 2003. Vol. 39. P. 889909.
3. De Lau M. M., Bretler M. M. Epidemiology of Parkinson' s disease // The Lancet Neurology. 2006. Vol. 5, N 6. P. 525-535.
4. Storch A., Ott S., Hwang Y. I. The dopamine transporter: involvement in selective dopaminergic neurodegeneration // Neurotoxic factors in Parkinson' s disease and related disorders / ed. by A. Storch, M. Collins. New York: Kluwer Acad. Publ., 2000. P. 17-40.
5. Козловский В. Л., Прахье И. В. Стойкие нарушения поведения у мышей, вызванные поочередными введениями фенамина и галоперидола // Нейронауки. 2006. № 2. С. 13-17.
6. Нодель М. Р., Яхно Н. Н. Нервно-психические нарушения при болезни Паркинсона // Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. 2009. № 2. С. 3-7.
7. Parent M., Parent A. Substantia nigra and Parkinson' s disease: a brief history of their long and intimate relationship // Can. J. Neurol. Sci. 2010. Vol. 37, N 3. P. 313-319.
8. Иллариошкин С. Н. Молекулярные основы болезни Паркинсона // Матер. I Национального конгресса «Болезнь Паркинсона и расстройства движений». М., 2008. С. 8-17.
9. Paris I., Lozano J., Perez-Pastene C. Molecular and neurochemical mechanisms in Parkinson' s disease pathogenesis // Neurotoxicity Research. 2009. Vol. 16, N 3. P. 271-279.
10. Ашмарин И. П. Перспективы практического применения некоторых фундаментальных исследований малых регуляторных пептидов // Вопр. мед. химии. 1984. № 3. С. 2-7.
11. Вальдман А. В., Козловская М. М., Ашмарин И. П. Модулирующее действие коротких пептидов на моноаминергические процессы мозга как основа их психотропного эффекта // Вопр. мед. химии. 1984. Т. 30, № 3. С. 36-43.
12. Экспериментальное развитие концепции О. С. Адрианова о соотношении функциональных и нейрохимических процессов: регуляторные пептиды при дисфункции медиаторных систем / Адрианов О. С., Попова Н. С., Доведова Е. Л., Герштейн Л. М., Качалова Л. А. // Усп. физиол. наук. 2000. Т. 31, № 1. С. 71-80.
13. Siemion I. Z., Kluczyk Z. Z. The peptide molecular links between the central nervous and the immune systems // Amino Acids. 2005. Vol. 29, N 3. P. 161-176.
14. Koroleva S. V., Ashmarin I. P. Functional continuum of regulatory peptides (RPs): Vector model of RP-effects representation // J. Theor. Biol. 2002. Vol. 216. P. 257-271.
15. Структурно-функциональная организация нейронов коры большого мозга у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу при воздействии пептида, вызывающего дельта-сон / Боголепов Н. Н., Попова Э. Н., Коплик Е. В., Кривицкая Г. Н., Судаков К. В. // Морфология. 2003. Т. 123, № 2. С. 10-15.
16. Лысенко А. В., Арутюнян А. В., Козина Л. С. Пептидная регуляция адаптации организма к стрессорным воздействиям. СПб.: ВМедА, 2005. 207 с.
17. Влияние тафцина на некоторые стороны обмена в двигательной системе мозга животных / Герштейн Л. М., Доведова Е. Л., Камышева А. С., Сергутина А. В., Чеботарева Т. Л. // Вопр. мед. химии. 1990. Т. 36, № 4. С. 15-17.
18. Изучение эффектов гектапептида Селанка на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс Вистар / Клодт П. М., Кудрин В. С., Наркевич В. Б., Козловская М. М., Майский А. И., Раевский К. С. // Психофармакология и биол. наркология. 2005. Т. 5, № 3. С. 1012-1015.
19. Коган Б. Н., Нечаев Н. В. Чувствительный и быстрый метод одновременного определения ДА, НА, 5'-НТ, 5'-индолуксусной кислоты в одной пробе // Лабораторное дело. 1979. № 5. С. 301-303.
20. Anden N. E., Roos B. E., Verdinius B. On the occurrence of homovanillic acid in brain and cerebrospinal fluid and it's determination by a fluorometric method // Life science. 1963. Vol. 2. P. 448-458.
21. Popov N., Rosler V., Thiemann V., Mathies H. Eine empfindeiche Methode zur Bestimmung der mono-aminoxydase Aktivitat // Acta Biol. Med. Germ. 1971. Bd 26. S. 239-245.
22. Доведова Е. Л., Хрусталев Д. А. Сравнительная характеристика ферментативных систем обмена нейромедиаторов в мозге крыс Вистар и Август при различных сроках воздействия амфетамина in vivo // Нейрохимия. 2007. Т. 24, № 2. С. 150-155.
23. Методы исследования активности и специфического торможения моноаминоксидаз митохондрий / Горкин В. З., Веревкина А. В., Гриднева Л. И., Жердева Л. В., Леонтьева Г. А., Криченпова Р. С., Комисарова Н. В., Кляшторин А. Б., Романова Л. А., Северина И. С. // Современные методы в биохимии. М., 1968. Т. 2. С. 155-177.
24. Chertkow Y., Weinreb O., Youdium M. B., Silver H. Dopamine and serotonin metabolism in response to chronic administration of fluvoxamine and haloperidol combined treatment // J. Neural Transm. 2007. Vol. 114, N 11. P. 1443-1454.
25. Доведова Е. Л., Воронков Д. Н. Сравнительная характеристика ферментных систем метаболизма биогенных аминов в различные сроки введения галоперидола и резерпина как отражение морфо-химической пластичности мозга // Матер. конф. «Современные направления исследований функциональной и межполушарной асимметрии и пластичности мозга». М.: Научный мир, 2010. С. 364-367.
26. Dalley J. W., Roiser J. P. Dopamine, serotonin and impulsivity // J. Neurosci. 2012. Vol. 32, N 17. P. 5843-5852.
27. Семенова Т. П. Роль взаимодействия серотонин- и норадреналинергической систем в регуляции поведения // Журн. высш. нерв. деят. 1997. Т. 47, № 2. С. 358-363.
28. Попова Н. С., Качалова Л. М. Функциональное взаимодействие структур мозга: принципы, варианты, моделирование. М., 2001. 180 с.
29. Доведова Е. Л., Качалова Л. М., Орлова Е. И. Метаболизм и биоэлектрическая активность отдельных структур мозга при действии тетрапептида тафцина // Журн. невропатологии и психиатрии. 1986. Т. 86, № 7. С. 1025-1028.
30. Весков Р., Попова Н. С., Адрианов О. С. Различное влияние тетрапептида тафцина на биоэлектрическую активность структур мозга при различных функциональных состояниях ЦНС // Бюл. экс-пер. биол. и мед. 1995. Т. 119, № 4. С. 365-368.
Статья поступила в редакцию 13 июня 2013 г.
