CC BY
59
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК: 612 . 8 + 612 . 82
Е. Л. Доведова1, Л. М. Герштейн1, Н. Д. Ещенко1
действие ноотропного препарата дигам на обмен нейромедиаторов в мозге крыс при дисфункции дофаминергической системы
1 ГУ Научный центр неврологии РАМН, Москва
1 Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии
В патогенезе многих психических и нервных заболеваний большую роль играют нарушения функций нейромедиаторных систем, поэтому весьма актуальна разработка лекарственных препаратов, способных нормализовать эти нарушения. Учитывая значение у-аминомасляной кислоты (ГАМК) как основного тормозного медиатора ЦНС, участвующего в регуляции функциональной активности многих структур головного мозга [11, 12], внимание исследователей привлекают соединения, синтезированные на основе этого нейротрансмиттера. Достаточно широкое применение в клинической практике уже нашли производные ГАМК — аминолон (гаммалон), пирацетам и др . Однако терапевтическая эффективность этих ноотропных препаратов невысока, что объясняется плохим проникновением их через гематоэнцефалический барьер
Преодолеть этот недостаток удалось путем создания для ГАМК транспортной системы с высокими липофильными свойствами. В Центре по химии лекарственных средств Всероссийского Научно-исследовательского химико-фармацевтического института (ЦХЛС-ВНИХФИ) синтезирована группа подобных препаратов, причем их структура обладает не только липофильностью, но и защищает аминогруппу фрагмента ГАМК от повреждающего действия аминооксидаз Особенностью этих соединений является их способность после прохождения гематоэнцефалического барьера расщепляться с высвобождением свободной ГАМК Наиболее активным из данной группы препаратов оказалось соединение, получившее название ДИГАМ [1].
В ходе фармакологических исследований установлено, что ДИГАМ обладает выраженными ноотропными свойствами, активируя когнитивные процессы и улучшая функциональное состояние ЦНС . По антиамнестическому действию и по способности облегчать межполушарную передачу в головном мозге животных ДИГАМ превосходит ГАМК и пирацетам . Более того, антигипоксический, антистрессорный и противосудо-рожный эффекты (на разных моделях судорожных реакций) оказались у ДИГАМа более выраженными, чем у ГАМК [1]
© Е . Л . Доведова, Л . М . Герштейн, Н . Д. Ещенко, 2008
Целью нашей работы была попытка выяснить, обладает ли препарат ДИГАМ ней-ропротекторным эффектом в условиях гипофункции дофаминергической медиаторной системы, которую вызывали хроническим введением галоперидола
Материалы и методы исследования. Исследования выполнены на белых крысах-самцах линии Вистар массой 200-210 г, которых содержали в стандартных условиях вивария . Все процедуры проводили с соблюдением правил гуманного обращения с животными. Животные были разделены на три группы по 10 особей: в 1-й группе, контрольной крысам, внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор; животным во 2-й группе ежедневно в течение 30 дней внутрибрюшинно вводили галоперидол (фирма «Гедеон Рихтер», Венгрия) по 0,5 мг/кг; животным 3-й группы на фоне хронического введения галоперидола, начиная с 20-го дня эксперимента, в течение 10 дней давали с пищей препарат ДИГАМ в дозе 250 мг/кг. Использовали препарат, синтезированный в Центре по химии лекарственных средств Всероссийского Научноисследовательского химико-фармацевтического института. ДИГАМ готовили на растворе Твин-80, разбавляя дистиллированной водой до необходимой концентрации непосредственно перед использованием
Биохимические и цитохимические исследования проводили после декапитации животных под легким эфирным наркозом. Из гомогенатов сенсомоторной зоны коры больших полушарий и хвостатого ядра с помощью дифференциального центрифугирования выделяли фракции митохондрий и синапто-сом [14]. Содержание дофамина (ДА), норадреналина (НА), серотонина (С) и конечного продукта его метаболизма 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) определяли флуорометрически [5] . Во фракциях митохондрий спектрофотометрически анализировали активность моноаминооксидаз, окисляющих моноамины: МАОа, используя серотонин в качестве субстрата [4], и МАОБ, используя паранитрофе-нилэтиламин как субстрат [13] . Во фракции синаптосом радиометрически и спектрофотометрически определили активность ферментов синтеза и распада ацетилхолина—холинацетилтрансферазы (ХАТ) [8] и ацетилхолинэстеразы (АХЭ) [10] . Активность всех исследуемых ферментов выражали в единицах удельной активности в расчете на 1 мг белка за 60 мин; количество субстратов — в пикограммах на 1 г ткани . Статистическую обработку результатов (п = 8-10) проводили по критерию Стьюдента . Различия считали значимыми при значениир < 0,05 .
Цитохимические определения сухого веса веществ в нейронах ассоциативного слоя Ш и проекционно-эфферентного слоя V сенсомоторной зоны коры больших полушарий, а также в нейронах
Влияние препарата дИТАМ на цитохимические характеристики нейронов разных отделов мозга крыс
Условия опыта Показатели
Площадь, мкм2 Концентрация белка, пг/мкм3
Ядро Цитоплазма Ядро Цитоплазма
Хвостатое ядро
Контроль 42,38 ± 0,44 32,85 ± 0,49 0,38 ± 0,01 0,70 ± 0,01
Галоперидол 40,32 ± 0,36* 27,92 ± 0,23* 0,46 ± 0,01* 0,77 ± 0,01*
Г алоперидол+ДНГАМ 42,82 ± 0,31** 32,01 ± 0,24** 0,63 ± 0,01** 0,92 ± 0,01**
Слой Ш сенсомоторной зоны коры больших полушарий
Контроль 41,30 ± 0 . 53 50,89 ± 0,59 0,41 ± 0,01 0,72 ± 0,01
Галоперидол 45,26 ± 0,50* 48,97 ± 0,55* 0,45 ± 0,01* 0,79 ± 0,01*
Галоперидол+ДИГАМ 52,74 ± 0,54** 53,92 ± 0,58** 0,51 ± 0,01** 0,79 ± 0,01
Слой V сенсомоторной зоны коры больших полушарий
Контроль 165,66 ± 1,96 108,39 ± 1,34 0,48 ± 0,01 0,90 ± 0,01
Галоперидол 153,68 ± 1,29* 96,66 ± 1,21* 0,61 ± 0,01* 1,01 ± 0,02*
Галоперидол+ДИГАМ 154,21 ± 0,45 102,64± 1,25** 0,48 ± 0,01** 0,78 ± 0,01**
* Различие достоверно (р < 0,01) при сравнении с контролем;
* * Различие достоверно (р < 0,01) при сравнении с группой крыс, получавших галоперидол .
НА/ДА
250
200
хвостатого ядра проводили на интерферометре «Интерфако» при длине волны 535 нм на фиксированном в жидкости Карнуа материале, который после стандартной гистологической проводки заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм . Параллельно измеряли площади профильных полей нейронов (цитоплазмы и ядра) исследуемых структур мозга с помощью окулярмикрометра МОВ-1-15 . Обработку экспериментальных результатов проводили по программе «Протеин», разработанной * %
в лаборатории цитохимии НИИ мозга РАМН .
Расчеты количества и концентрации белка проводили по соответствующим формулам [2] .
В таблице приведены средние значения S ± т из результатов обработки 150 нейронов по каждому из показателей
Результаты исследований и их обсуждение. Длительное введение крысам нейролептика галоперидола приводило к развитию брадикинезии и других экс-трапирамидных расстройств, что сопровождалось заметными сдвигами в метаболизме исследованных нейромедиаторов Наиболее выраженными были нарушения в хвостатом ядре, где установлено резкое (на 62-65 %) снижение уровня дофамина и норадреналина . Активность фермента, окисляющего дофамин и отчасти норадре-налин—МАОБ, менялась незначительно: отмечена лишь тенденция к уменьшению активности фермента, в среднем на 18-20 % по отношению к контрольным значениям (рис . 1) . Существенное снижение содержания обоих нейромедиаторов при относительно небольшом замедлении моноаминооксидазной реакции указывает на то, что одной из причин ослабления катехоламинергической системы может быть торможение реакций синтеза катехоламинов . Как известно, наиболее медленный и регуляторный этап синтеза дофамина и норадреналина катализирует тирозингидроксилаза. Установлена возможность торможения этого фермента по принципу обратной связи в условиях блокирования дофаминовых рецепторов [6, 9]. Именно такая ситуация имеет место при введении галоперидола, который может блокировать до 70—80 %
D2-рецепторов [7] .
Аналогичный характер сдвигов в катехоламинергической системе
МАО.
Сер.
5-ОИУК 5'-ОИУК/сер.
В
ХАТ АХЭ
Рис. 1. Влияние ДИГАМА на фоне хронического введения галоперидола на состояние медиаторных систем в хвостатом ядре (в % по отношению к контрольным значениям, принятым за 100 %)
ДА — дофамин, НА — норадреналин, С — серотонин, 5-ОИУК — 5-оксииндолуксусная кислота; МАО — моно-аминооксидаза; ХАТ — холинацетилтрансфераза; АХЭ — ацетилхолинэстераза * — достоверные различия (р < 0,05) . Белые столбики — галоперидол; черные столбики — гало-перидол + ДИГАМ .
ХАТ
АХЭ
обнаружен в сенсомотроной зоне коры больших полушарий экспериментальных животных; однако степень выраженности изменений была меньше, чем в хвостатом ядре (рис . 2) . Так, при статистически достоверном уменьшении количества дофамина (на 28 %) уровень норадреналина практически оставался неизменным . Активность МАОБ также была близкой к контрольным значениям
Изменения состояния серотонинергиче-ской системы, как и катехоламинергической, при длительном введении животным галопе-ридола были выражены более резко в хвостатом ядре по сравнению с сенсомоторной зоной коры мозга (см . рис . 1, 2) . В хвостатом ядре установлено снижение уровня серотонина (в среднем на 40 %), сопровождавшееся накоплением продукта его метаболизма 5-ОИУК на фоне повышения в 1,5 раза активности МАОА, что приводило к значительному (почти в 2 раза по сравнению с контролем) возрастанию отношения 5-ОИУК/серотонин .
Эти результаты указывают на то, что уровень нейромедиатора в данном случае определяется, скорее, усилением его окисления в моноаминооксидазной реакции, чем замедлением биосинтеза, как это имело место в катехоламинергической системе в коре больших полушарий после введения галоперидола обнаружена лишь тенденция к снижению уровня серотонина и небольшому увеличению количества 5-ОИУК при практически неизменной активности МАОА (см рис 2) таким образом, серотонинерги-ческая система сенсомоторной зоны коры оказалась менее чувствительной к хроническому введению галоперидола, чем такая же медиаторная система хвостатого ядра Подобное различие в чувствительности двух исследованных структур мозга к действию этого нейролептика отмечено выше и для катехоламинергической медиаторной системы
Моделирование лекарственного паркинсонизма с помощью галоперидола вызывает, как было показано нами ранее [3], резкое снижение двигательной, эмоциональной и исследовательской активности экспериментальных животных. Другими словами, эффект нейролептика, направленный в первую очередь на блокирование Dj-рецепторов и подавление активности дофаминергической системы в нигростриатных структурах мозга,
5'-ОИУК 5’-ОИУК/сер.
Рис. 2. Влияние ДИГАМА на фоне xронического введения галоперидола на состояние медиатор-ньк систем в сенсомоторной зоне коры больший полушарий (в % по отношению к контрольным значениям, принятым за 100 %) Oбозначения, как на рис . 1.
опосредованно затрагивает и ацетилxолинергическую медиаторную систему, что на поведенческом уровне реализуется в виде патологическиx экстрапирамидныгс расстройств . Длительное введение галоперидола приводило к усилению синтеза ацетигаолина под действием ХАТ и замедлению расщепления медиатора в АХЭ реакции как в xвостатом ядре, так и в сенсомоторной зоне коры большиx полушарий (см . рис . 1, 2) .
Известно, что морфометрические показатели, такие, как размеры ядер и цитоплазмы нейронов, содержание и концентрация в mx структурированныx белков, наряду с показателями метаболизма нейромедиаторов, служат тестом, адекватно отражающим функциональное состояние ЦНС . Oтмеченные биоxимические изменения в исследованные структураx мозга крыс, длительно получавшиx галоперидол, в целом согласуются с результатами морфометрического анализа (см . таблицу) . Хроническое введение нейролептика приводило к некоторому уменьшению размеров ядер и цитоплазмы нейронов xвостатого ядра, что сопровождалось возрастанием концентрации структурированного белка в mx на 11 и 21 % соответственно . Размеры ядер нейронов III ассоциативного слоя сенсомоторной коры практически не менялись в отличие от размеров ядер и цитоплазмы нейронов V слоя, которые в этиx условияx уменьшались . Накопление структурированного белка зафиксировано в цитоплазме нейронов III слоя (на 10 %) и в цитоплазме (на 12 %) и ядраx (на 27 %) нейронов V слоя сенсомоторной коры мозга .
Введение экспериментальным животным препарата ДИГАМ на фоне 30-дневного действия галоперидола оказывало в целом положительное действие как на двигательную активность (восстанавливалась траектория перемещения животные в открытом поле) [3], так и на состояние медиаторные систем в мозге . В xвостатом ядре обнаружена нормализация активности МА^ и возрастание уровня исследованные катеxоламинов до значений, превышающиx контрольные на 54 % (дофамин) и 38 % (норадреналин) (см . рис . 1) . В сен-сомоторной зоне коры после введения ДИГАМа также отмечена тенденция к повышению содержания дофамина и норадреналина, причем активность МА^ практически не отличалась от контроля (см . рис . 2) . Эти результаты указывают на то, что под влиянием препарата ДИГАМ на фоне xронического действия галоперидола усиливается синтез катеxоламинов .
Введение препарата ДИГАМ способствовало также нормализации состояния се-ротонинергической и ацетилxолинергической систем как в xвостатом ядре, так и в сенсомоторной зоне коры большиx полушарий. Все исследуемые показатели были близки к контрольным значениям (см рис 1, 2)
Анализ морфометрическиx xарактеристик показал, что применение препарата ДИГАМ при длительном действии галоперидола приводило к увеличению размеров ядер и цитоплазмы нейронов xвостатого ядра и значительному повышению концентрации структурированного белка — на 19 % в цитоплазме и на 37 % в ядраx по сравнению с показателями в этиx структураx мозга животные при введении одного галоперидола (см . таблицу) . В то же время обращает на себя внимание различная реакция нейронов III и V слоев сенсомоторной зоны коры на введение ДИГАМа. В нейронаx III слоя, которые относятся главным образом к ассоциативному типу, установлено увеличение размеров ядер и цитоплазмы с одновременным накоплением белка Это позволяет предположить, что в нейронаx III слоя коры, как и в нейронаx xвостатого ядра в условияx действия ДИГАМа преобладают процессы синтеза белка над процессами катаболизма . Напротив, в нейронаx V слоя сенсомоторной зоны коры, относящижя к эфферентно-проекционному типу, при мало изменяющижя размераx ядер и цитоплазмы было обнаружено снижение концентрации структурированныx белков — до 77 % в цитоплазме и до 79 % в ядраx (по сравнению с данными, полученными при длительном введении галоперидола) Эти результаты
указывают на то, что под влиянием ДИГАМа в нейронаx слоя V процессы катаболизма белков протекают интенсивнее, чем процессы синтеза
^к известно, функции базальные ганглиев в обеспечении организации произвольные движений контролируются корой мозга через возбуждающие (глутаматергические) и ингибирующие (ГAMK-ергические) проекции. Установлено, что до 95 % нейронов стриатума относятся к вставочным ГAMK-ергическим нейронам [15] . В связи с этим можно предположить, что одним из меxанизмов, лежащиx в основе нормализующего эффекта ДИГАМа при экспериментальном паркинсонизме, является восстановление равновесия между глутаматом и TAMK как медиаторами, контролирующими функционирование ни-гростриатумной системы . Такое предположение подтверждается тем, что, как показано в фармакологическиx исследованияx, ДИГАМ после проxождения через гематоэнцефа-лический барьер способен расщепляться с высвобождением TAMK [1] .
Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что препарат ДИГАМ представляет собой перспективное ноотропное средство, позитивный эффект которого проявляется при экстрапирамидные расстройстваx, вызванные xрониче-ским введением галоперидола . ^ррегирующее действие препарата ДИГАМ выражается в нормализации состояния ряда нейромедиаторные систем (катеxоламинергической, се-ротонинергической и ацетилxолинергической), в изменении морфоxимическиx xаракте-ристик нейронов xвостатого ядра и сенсомоторной коры мозга, а также в восстановлении двигательной и исследовательской активности животные .
Summary
Dovedova E. L., Gershtein L. M., Eschenko N. D. The effects of nootropic drug DIGAM on rat brain neurotransmitter metabolism under disfunction of dopaminergic system
Using microchemical methods we demonstrated that a synthetic GABA derivative DIGAM (250 mg/kg during 10 days) could normalize the functions of dopaminergic, serotoninergic, and cholinergic systems in caudate nucleus and sensomotor cortex of Wistar rats with haloperidol-induced (0,5 mg/kg during 30 days) bradykinesia . Measured by a quantitative interpherometric method, a specific response of functionally different sensomotor cortex (layers III and V) neurons and neurons of caudate nucleus in such characteristics as the sizes of cytoplasm and nuclei, and protein concentration was found in these animals
Key words: rat brain structures (caudate nucleus, sensomotor cortex); haloperidol; metabolism of dophamine, serotonine, acethylcholine; GABA derivate DIGAM
литература
1. Андреева Н. И., Асинина В. А., Паршин В. А., Машковский М. Д. Фармакологические свойства дигама — нового потенциального ноотропного средства // Хим-фарм . журн . 1998 . № 9 . С . 5-11.
2. Бродский В. Я. Трофика клетки. М. , 1966.
3. Герштейн Л. М., Доведова Е. Л., Попова Н. С., Андреева Н. И. Экспериментальное исследование нейроxимического меxанизма действия нового гамкергического средства — дигама // Хим-фарм. журн.2000.№ 4 . С . 3-5 .
4. Горкин В. З., Веревкина И. В., Гриднева Л. И., Петров И. А. Методы исследования активности и специфического торможения моноаминоксидаз митоxондрий // Современные методы в бижимии . М. , 1968 . Т. 2 . С . 155-177.
5. Коган Б. М., Нечаев Н. В. Чувствительный и быстрый метод одновременного определения дофамина, норадреналина, серотонина и 5-оксиндолуксусной кислоты в одной пробе // Лаб . дело . 1979. № 5 . С.301-303
6. Раевский К. С , Сотникова Т. Д., Гайнетдинов Р. Р. Дофаминергические системы мозга: рецепторная гетерогенность, функциональная роль, фармакологическая регуляция // Успеxи физиол . наук . 1996 . Т. 27, № 4 . С . 3-29 .
7. Farde L., Nordstrom A., Wiesel F.-A. Positron emission tomographic analysis of central D-1 and D-2-dopamine receptor occupancy in patients treated with classical neuroleptics and clozapine - relation to extrapyramidal side effects // Arch . Gen . Psychiatry . 1992 . Vol . 49 . P. 538-544 .
8. Fonnum F. Radiochemical microassays for the determination of choline acetyltransferase and acetyl-cholesterase activities // Biochem. J. 1969. Vol. 115, N 6 . P. 465-472 .
9. Goldstein M. Long- and short-term regulation of tyrosine hydroxylase // Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress / Ed. by F. E . Bloom and D . J. Kupfer, NewYork, 1995 . P. 189-196.
10. Hestrin J. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivates with hydroxylamine and its analytical application // J. Biol. Chem . 1949. Vol . 180 . P. 249-255 .
11. GABA in the Nervous System: The View at 50 Years / Ed. by D . L . Martin . , R . W. Olsen . Philadelphia, 2000
12. Olsen R. W. GABA // Psychopharmacology: The Fifth Generation of Progress / Ed . by K . L . Davis, D . J. Kupfer. NewYork, 2001. P. 159-168.
13. Popov N., Rosler V., Thiemann C. Eine empfindiche Methode zur Bestimmung der Monoaminoxydase-Activitat im Gewebe durch Aldehydsemikarbazon-Messung // Acta Biol . Med . Germ . 1971. Bd . 26 . S . 239; Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress / Ed . by D . J . Kupfer. New York, 1995 . P. 189-196 .
14. Robertis de E. Cholinergic and non-cholinergic nerve endings in rat brain // J. Neurochem. 1962 . Vol 9 P 23 -25
15. Wichmann T., DeLong M. R. Neurotransmitters and disorders of the basal ganglia // Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects . London; New York, 2006 . P. 761-778 .
