CC BY
16УДК: 618.145:616-007.61:616-08:616-092
©Коллектив авторов, 2015
ДИНАМИКА УРОВНЕЙ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДОВ И МАРКЕРОВ АССОЦИИРОВАННОГО ВОСПАЛЕНИЯ НА ЭТАПАХ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ
ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ
Л. Л. Алиев, А. В. Кубышкин, Е. П. Коваленко, С. В. Литвинова
Кафедра общей и клинической патофизиологии
Медицинская академия имени С. И. Георгиевского
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина, 5/7, г. Симферополь, 295006, Республика Крым, Российская Федерация
E-mail: all.sheff81@gmail.com
РЕЗЮМЕ
Исследованы изменения уровней эстрогенов и прогестерона в сыворотке крови и маточных смывах при различных формах гиперплазий эндометрия (ГЭ). Установлено, что наиболее значительные колебания уровня гормонов возникают на этапе формирования простой ГЭ, и менее выражены при более тяжелых формах гиперплазий. Изучена динамика экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45+ и провоспалительных цитокинов ИЛ-Ш, ИЛ-6, ФНО-а в качестве маркеров ассоциированного воспаления на этапах прогрессирования ГЭ. Установлено, что прогрессирование гиперплазии эндометрия сопровождается развитием воспалительного процесса, степень выраженности которого возрастает по мере прогрессирования ГЭ. Так, минимальный уровень экспрессии CD45+ в тканях эндометрия и провоспалительных цитокинов (ИЛ-Ш, ИЛ-6, ФНО-а) в маточных смывах отмечен при простой гиперплазии эндометрия, а максимальное значение - при комплексной гиперплазии с атипией. Полученные результаты позволяют предположить ключевую роль гиперэстрогении в возникновении ГЭ, в то время как ее прогрессирование связано с развитием ассоциированного воспаления.
CHANGES OF SEX STEROIDS LEVELS AND MARKERS OF ASSOCIATED INFLAMMATION ON STAGES OF PROGRESSION OF ENDOMETRIAL HYPERPLASIA
L. L. Aliev, A. V. Kubyshkin, E. P. Kovalenko, S. V. Litvinova
SUMMARY
Steroid hormones levels in blood serum and uterine washings of the patients with different forms of endometrial hyperplasia (EH) were measured. It was revealed, that level of estradiol in blood serum and especially in uterine washings was elevated dramatically in simple EH as compared to control, but there was no significant difference between estradiol levels in different forms of EH. The next stage of investigation included estimation of local nonspecific inflammatory markers, such as CD 45+ (common leukocyte antigen), levels of cytokines IL-ip, IL-6 and TNF-a. This study showed, that levels of nonspecific inflammatory markers increase with EH progression. We suggest, that initial role in formation of simple endometrial hyperplasia belongs to systemic and especially local hyperestrogenia. But the same time progression of endometrial hyperplasia depends on appearance of inflammatory component.
Ключевые слова: гиперплазия эндометрия, ассоциированное воспаление, эстрогены, прогестерон, протеолиз, цитокины.
Введение. Гиперплазия эндометрия (ГЭ) представляет собой аномальную неинвазивную пролиферацию эндометрия, способную в долгосрочной перспективе привести к развитию злокачественного опухолевого процесса. Гиперплазия эндометрия имеет 2 основные формы: простую, комплексную без атипии и с атипией. Во многом, от гистологического типа гиперпластического процесса зависит клинический прогноз. Так, согласно литературным данным простая гиперплазия часто спонтанно регрессирует и редко перерождается в злокачественный процесс [1,2], в то время как комплексная гиперплазия с атипией с большей вероятностью малиг-низируется[3, 4, 5]. В этом контексте вопросы о
причинах развития и механизмах прогрессии ГЭ представляют непосредственный клинический интерес. Считается, что ключевым фактором в развитии гиперпластических процессов в эндометрии является гиперэстрогения: абсолютная (чрезмерный гонадный и внегонадный синтез эстрогенов) или относительная за счет дефицита прогестерона. Эстрогены стимулируют пролиферацию железистого эпителия, в то время как прогестерон противодействует действию эстрогенов. Баланс между уровнями эстрогенов и прогестерона во время менструального цикла должен точно контролироваться, так как сдвиг в любом направлении (повышение уровня эстрогенов или падение антагонистической активно-
сти прогестерона) вызывает гиперпластическую пролиферацию [6]. Однако регуляция пролифе-ративной активности клеток эндометрия контролируется не только стероидными гормонами, но и зависит от комплекса факторов, который включает взаимодействие между различными типами клеток: цитокинами, молекулами клеточной адгезии, а также факторами роста, которые принимают участие в сигнализации, необходимой для обеспечения межклеточной кооперации [7]. Многие из этих факторов продуцируются в эндометрии в условиях воспаления [8]. Согласно литературным данным, хронический воспалительный процесс может привести к нарушению регуляции клеточного деления с повышением митотической активности, а также увеличивает риск возникновения мутаций, что ведет к возникновению неопластических процессов [8, 9]. В соответствии с изложенным, представляет интерес вопрос о роли воспалительного компонента в возникновении и про-грессировании гиперпластического процесса.
В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучить динамику изменений уровней эстрогенов и прогестерона в сыворотке крови и маточных смывах, а также маркеров воспаления при различных формах гиперплазии эндометрия.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследовано 107 женщин репродуктивного возраста с различными видами гиперплазии эндометрия. В соответствии с классификацией ВОЗ женщины были разделены на 3 группы. В первую группу вошла 41 женщина с простой ГЭ без атипии, во вторую 36 женщин с комплексной ГЭ без атипии и в третью группу 12 женщин с комплексной атипической гиперплазией эндометрия. Средний возраст обследованных женщин составлял 38,8±1,0 лет. В качестве контрольной группы были отобраны 18 здоровых фертильных женщин, сопоставимых по возрасту, не имевших в анамнезе и в настоящем заболеваний эндометрия и давших согласие на включение в исследование.
Гистологические исследования биопта-тов эндометрия, полученных при проведении гистероскопии, проводилось по стандартной методике с последующей окраской срезов гематоксилином и эозином.
Внутриматочный смыв в объеме 2 - 3 мл получали непосредственно перед проведением гистероскопии путем введения в полость матки 3 - 4 мл подогретого физиологического раствора через педиатрический одноразовый катетер Фо-лея. Смыв замораживали и хранили до проведения исследования при температуре -15 ^ -18 0 С.
Для определения концентрации эстрадиола в сыворотке крови и маточных смывах использовали твердофазную систему ОВОС («DRG Diagnostics», Германия). Для измерения концентрации прогестерона и пролактина в сыворотке крови и маточных смывах использовали твердофазную систему ОВОС «Алкор Био» (Россия)
Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартизированной методике с использованием серийных парафиновых срезов толщиной 5 мкм с моноклональными антителами к рецепторам общего лейкоцитарного антигена CD45+ (Clone 2B11 + PD7/26) [10]. Использовалась система визуализации EnVision™ FLEX +, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus), Code K8024. Морфометрическое исследование включало подсчет клеток с помощью программы Software DP-SOFT. Использовались позитивные и негативные контроли соответственно стандартным протоколам. Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием методов вариационной статистики с вычислением средних величин (M) и оценкой вероятности расхождений (m). В качестве критерия оценки достоверности наблюдаемых изменений использовали t-критерий Стьюдента. За достоверную принималась разность средних значений при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе исследования было проведено определение уровней половых гормонов в сыворотке крови и маточных смывах. Было выявлено, что при простой ГЭ уровень эстрадиола в сыворотке крови был значительно повышен только во время первой фазы менструального цикла. При комплексной гиперплазии уровень эстрадиола был повышен в обеих фазах, но статистически достоверные различия между простой и комплексной ГЭ в первой фазе отсутствовали. При комплексной атипичной ГЭ уровень эстрадиола был повышен по сравнению с контрольной группой в обеих фазах. При этом не наблюдалось существенных различий между комплексной ГЭ и комплексной ГЭ с атипией.
Уровни прогестерона в сыворотке крови женщин с простой и комплексной ГЭ не изменились по сравнению с контролем первой фазы менструального цикла и были снижены во второй фазе.
Изменения уровней половых гормонов в маточных смывах были более выраженными, чем в сыворотке крови. Так, уровень эстрогенов при простой ГЭ был в три раза выше, чем в контроле первой фазы и в 5 раз выше контрольного уровня во второй фазе (р<0,001). При комплексной ГЭ статистически достоверная разница между уровнями первой и второй фаз отсутствовала.
Таблица 1
Содержание гормонов в маточных смывах у женщин с различными видами гиперплазии эндометрия
Группы Фаза цикла и Маточные смывы
Эстрадиол пг/мг Прогестерон нМоль/г
Контроль(п=18) I 12 6,38±0,81 0,42±0,08
II 6 8,23±1,18 0,71±0,11
Простая ГЭ Без атипии (п=41) I 26 *19,87±4,32 *0,81±0,15
II 15 **43,69±12,67 **2,24±0,65
Комплексная ГЭ Без атипии (п=36) I 21 * 25,72±5,09 *1,26±0,34
II 15 **27,82±4,23 1,56±0,46
Комплексная атипическая ГЭ !+!! 12 *,**20,7±4,99 0,58±0,21
Примечание. Звездочками показана достоверность различий (р < 0,05); * - по отношению к контролю I фазы менструального цикла, ** - по отношению к контролю II фазы менструального цикла.
При этом, уровни эстрадиола при комплексной ГЭ и комплексной атипичной ГЭ были в 3,5 - 4 раза выше контрольных значений. При простой гиперплазии уровень прогестерона в первой фазе была в два раза выше контроля, но изменения при комплексной и комплексной атипичной ГЭ не отличались от аналогичного показателя при простой ГЭ.
Таким образом, анализ изменений локальных уровней стероидных гормонов в маточных смывах показал, что наиболее существенные изменения внутриматочных уровней гормонов отмечаются на этапе возникновения простой ГЭ (табл. 1).
При прогрессировании простой гиперплазии в комплексную ГЭ и комплексную ГЭ с атипией локальный гормональный статус существенно не менялся. Полученные результаты позволяют предположить, что локальный и системный гормональный дисбаланс играет инициирующую роль на этапе формирования
простой ГЭ, в то время как прогрессирование процесса (формирование комплексной и комплексной атипической ГЭ) обусловлено другими механизмами. В настоящее время особое внимание исследователей сосредоточено на роли воспалительных изменений, которые могут сопровождать формирование и трансформацию гиперплазии. В связи с этим на втором этапе нашего исследования была изучена динамика неспецифических маркеров воспаления в процессе развития и опухолевой трансформации ГЭ.
Результаты гистологического исследования эндометрия свидетельствуют о наличии хронического воспалительного процесса в эндометрии у 67% пациенток. Морфологическая картина которого проявлялась наличием пери-васкулярных воспалительных инфильтратов в базальном и функциональном слоях эндометрия, состоявших, в основном, из лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток (рис.1).
Рис. 1. Воспалительные изменения в ткани эндометрия. А - макрофагально-лимфоцитар-ная инфильтрация при простой ГЭ. Ув. Х 100; В - периваскулярные и перигландулярные воспалительные инфильтраты в базальном и функциональном слоях эндометрия при комплексной ГЭ. Ув. Х 100; С - макрофагально-лимфоцитарный инфильтрат при комплексной ГЭ.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии общего лейкоцитарного антигена СБ45+ показало степень выраженности воспалительного компонента при различных формах ГЭ. Было обнаружено, что количество клеток СБ45+, увеличивалось в процессе перехода от простой к комплексной и комплексной атипической гиперплазии эндометрия. Если в нормальном эндометрии определялось только 4,2 ± 1,2% клеток СБ45+, то при простой гиперплазии экс-
прессия СБ45 + уже составляла 19,9 ± 0,9% (р <0,001), а при комплексной ГЭ уровень СБ45+ достигала 31,2 ± 2,1% (р <0,001). Максимальный уровень СБ45+ 57,8 ± 2,4% (р <0,001) наблюдался при инициации эндометриоидной карциномы.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали четкую взаимосвязь между прогрессией гиперпластического процесса эндометрия и выраженностью ассоциированного воспаления (рис.2).
%
60 50 40 30 20 10
Контроль Про стая Г Э
Компл ексная
ГЭ
Комплексная ГЭ с атипией
Рис. 2. Уровень экспрессии рецепторов С1345 (%) в эндометрии с различными вариантами гипер-плазий. Примечание. Звездочками показана достоверность различий (р < 0,05); * - по отношению
к контролю.
Среди параметрических критериев, отражающих степень выраженности воспалительных изменений в эндометрии, особая роль принадлежит цитокинам. Известно, что при гиперплазии и раке эндометрия в сыворотке крови, наблюдается повышение продукции провос-палительных цитокинов, но это не позволяет в достаточном объеме оценить степень выраженности воспаления, которое развивается на локальном уровне. Исследования провоспали-тельных цитокинов в маточных в смывах продемонстрировали четкую зависимость между ло-
кальным уровнем цитокинов и выраженностью гиперпластического процесса эндометрия. Так уровень ИЛ-1 при простой гиперплазии более чем в 3 раза, при комплексной - в 20 раз превышал контрольные значения. При атипической гиперплазии уровень ИЛ-1 был в 2 раза выше, чем у женщин с комплексной ГЭ без ати-пии (табл. 3). Сходная картина наблюдалась и в динамике изменений уровня ИЛ-6. При простой ГЭ значения ИЛ-6 были в 5 раз выше контроля, при комплексной - в 10 раз выше, а при комплексной гиперплазии с атипией - в 15 раз.
Таблица 3
Содержание цитокинов в маточных смывах у женщин с различными видами гиперплазии эндометрия
Группы п ИЛ-1Р пг/мг ИЛ-6 пг/мг ФНО-а пг/мг
Контроль 18 3,56±0,93 4,36±1,19 5,04±1,68
Простая ГЭ 41 * 12,8±3,32 22,55±3,96 9,96±1,52
Комплексная ГЭ 36 *,** 80,3±8,9 *,** 44,32±9,77 * 12,41±1,85
Комплексная ГЭ с атипией 24 *,** 174,7±15,1 *,** 67,81±16,39 *,** 15,59±2,66
Примечание. Звездочками показана достоверность различий (р < 0,05); * - по отношению к контролю, ** - по отношению к группе с простой ГЭ.
2015, т. 5, №4 (20)
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
Изменения ФНО-а были менее значительными. У больных с простой ГЭ уровень ФНО-а был повышен в два раза, с комплексной ГЭ - в 2,5 раза, а с комплексной атипической ГЭ - в 3 раза по сравнению с контрольными значениями.
Проведенные исследования локальных уровней стероидных гормонов и провоспали-тельных цитокинов в маточных смывах при развитии гиперплазии эндометрия показали, что роль гиперэстрогении наблюдается только в формировании простой ГЭ. Переход в комплексную и комплексную атипическую ГЭ сопровождается повышением уровней маркеров воспаления, при незначительных колебаниях стероидных гормонов. Согласно литературным данным, в некоторых случаях хроническое воспаление играет роль основной причины возникновения и развития гиперпластических заболеваний и последующего канцерогенеза [11].
Например, хроническое воспаление ободочной и прямой кишки с последующим канцерогенезом происходит путем ступенчатой прогрессии. Процесс начинается с проли-феративного воспаления, которое приводит к гиперплазии с прогрессирующим течением, а затем аденомы и аденокарциномы [12]
Повторное повреждение и регенерация тканей на фоне продукции свободных радикалов макрофагами и нейтрофилами, неизменно сопровождающие хронический воспалительный процесс, повышают риск возникновения мутаций, обусловливающих появление атипичных клеток [13, 14, 15]. Таким образом, полученные результаты не противоречат существующим представлениям о механизмах развития гиперпластических процессов в целом, но актуализируют вопрос о роли ассоциированного воспаления в развитии патологии, в патогенезе которой воспалительный компонент в качестве одного из ключевых традиционно не рассматривается.
ВЫВОДЫ
1. Формирование гиперплазии эндометрия сопровождается развитием системной и локальной гиперэстрогении на фоне снижения уровня прогестерона, что является ключевым фактором инициации гиперпластического процесса при развитии простой ГЭ. При этом на дальнейших этапах перехода гиперплазии в комплексную и комплексную атипическую формы существенных изменений локальных и системных уровней половых стероидов не наблюдается.
2. Изменения экспрессии СБ45+ в тканях эндометрия и уровень провоспалительных цитокинов (ИЛ-16, ИЛ-6, ФНО-а) в маточных смывах при формировании простой ГЭ минимальны. В то же время гистологическая про-
грессия ГЭ сопровождается выраженным повышением уровней CD45+ и провоспалительных цитокинов, достигая максимальных значений при комплексной гиперплазии с атипией, что свидетельствует о значительной роли воспалительного компонента на этапах прогрессии ГЭ.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках научной темы госзадания по проекту № 3884.
ЛИТЕРАТУРА
1. Figueroa-Casas PR, Ettinger B, Delgado E, Javkin
A, Vieder C. Reversal by medical treatment of endometrial hyperplasia caused by estrogen replacement therapy. Menopause. 2001;8:420-3.
2. Kurman RJ, Kaminski PF, Norris HJ. The behavior of endometrial hyperplasia. A long-term study of "untreated" hyperplasia in 170.
3. Hammond R, Johnson J. Endometrial hyperplasia. Current Obstetrics and Gynaecology. 2004;40:99-103.
4. Boyd J: Molecular genetics of human endometrial carcinoma. Khan SA Stancel GM eds. Protooncogenes and Growth Factors in Steroid Hormone Induced Growth and Differentiation. 1994:pp 193-205 CRC Press, Boca Raton
5. Endometrial cancer / Amant F. et al. // Lancet.-2005.-V. 366.-P. 491-505.
6. Гормональный статус женщин с гиперпластическими процессами эндометрия / Шарапова О.В. и соавт.// Пробл. репрод.- 2006. - Т. 12., №3. - с.31-36.
7. Vadym M Goncharenko, Vasyl A Beniuk, Olga V Kalenska et al. Predictive diagnosis of endometrial hyperplasia and personalized therapeutic strategy in women of fertile age // EPMA J. - 2013. - 4 (1): 24.
8. Ахметова Е.С. Диагностическое значение ци-токинов в аспирате из полости матки при заболеваниях эндометрия / Е.С. Ахметова, Т.Е. Белокриницкая, Ю.А. Витковский // Дальневосточный медицинский журнал. -2008. - №1. - c. 72-74.
9. Адамян Л.В. Воспалительный процесс в этиологии и патогенезе рака эндометрия / Адамян Л.В., Глякин Д.С., Самойлова А.В., Гунин А.Г. // Проблемы репродукции.- 2007.-№1.-с.21-25.
10. Dabbs D. J. Diagnostic immunohistochemistry / Dabbs D. J.// London: Churchill Livingstone, 2006. - 828 p.
11. Modugno F, Ness RB, Chen C, Weiss NS. Inflammation and endometrial cancer: a hypothesis. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 2005;14(12):2840-7.
12. Festen EAM, Szperl AM, Weersma RK, Wijmenga C, Wapenaar MC. Inflammatory bowel disease and celiac disease: Overlaps in the pathology and genetics, and their potential drug targets. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 2009;9:199-218.
13. Preston-Martin S, Pike MC, Ross RK, Jones PA, Henderson BE. Increased cell division as a cause of human cancer. Cancer Research. 1990;50(23):7415.
14. Maeda H, Akaike T. Nitric oxide and oxygen radicals in infection, inflammation, and cancer. Biochemistry (Mosc). 1998 Jul; 63(7):854-65.
15. Yamanishi Y, Boyle DL, Rosengren S, Green mutations in rheumatoid arthritis synovium. Proc DR, Zvaifler NJ, Firestein GS Regional analysis of p53 Natl Acad Sci U S A. 2002 Jul 23; 99(15):10025-30.
