CC BY
84
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.98:578.833.1]-078.33
И.Н. Трусова1, А.М. Бутенко1, В.Ф. Ларичев1, М.Ю. Щелканов1, А.Р. Азарян2, А.П. Гришанова2, Е.И. Иващенко2, Т.Е. Аршба3, М.В. Говорухина4, Н.Ю. Асмолова4, И.С. Сиденко5, Н.Ф. Василенко6, Н.В. Русакова7, Л.В. Шишкина7, Б.Ц. Бушкиева8
динамика специфических igm- и igg-антител у вольных крымской геморрагической лихорадкой
1ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18; 2ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области», 414057, Астрахань, ул. Кирова, 89; 3ГУЗ «Областная инфекционная клиническая больница им. А.М. Ничоги», 414004, Астрахань, Началовское ш., 7; 4ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», 344019, Ростов-на-Дону, ул. 7-я Линия, 7; 5МБУЗ «Центральная районная больница Сальского района», 347630, Ростовская обл., г. Сальск, ул. Павлова, 2; 6ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15; 7ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Волгоградской области», 400049, Волгоград, ул. Ангарская, 13б; 8ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Калмыкия», 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Балакова, 8
Методами ИФА-IgM и ИФА-IgG было обследовано 338 сывороток крови, собранных у 254 больных КГЛ в 2003-2010 гг. в южных эндемичных регионах России. Изучена динамика IgM и IgG специфических антител в течение месяца от начала заболевания, в том числе у пациентов с разными клиническими формами КГЛ, разного возраста, у мужчин и женщин.
Ключевые слова: Крымская геморрагическая лихорадка, серологическая диагностика, методы ИФА-IgM и ИФА-IgG, динамика специфических антител
I. N. Trusova1, A. M. Butenko1, V. F. Larichev1, M. Yu. Shchelkanov1, A. R. Azaryan2, A. P. Grishanova2, E. I. Ivashchenko2, T. E. Arshba3, M. V. Govorukhina4, N. Yu. Asmolova4, I. S. Sidenko5, N. F. Vasilenko6, N. V. Rusakova7, L. V. Shishkina7, B. Ts. Bushkieva8 DYNAMICS OF SPECIFIC IGM AND IGG ANTIBODIES IN PATIENTS WITH CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER (CCHF)
1D. I. Ivanovsky Institute of Virology, 16, Gamalei st, Moscow, Russian Federation, 123098; 2Center of Hygiene and Epidemiology in the Astrakhan
region, 89, Kirova Str., Astrakhan, Russian Federation, 414057; 3A. M. Nichogi Regional Clinical Infections Hospital, 7, Nachalovskoe Shosse,
Astrakhan, Russian Federation, 414004 ; 4Center of Hygiene and Epidemiology in the Rostov region, 67, 7-ya Liniya Str, Rostov-on-Don, Russian
Federation, 344019; 5Central District Hospital in Salsk region, 2, Pavlova Str., Rostov region, Russian Federation, 347630; 6Stavropol Anti-Plague
Institute, 13-15, Sovetskaya, Str., Stavropol, Russian Federation, 355035; 7Center of Hygiene and Epidemiology in the Volgograd region, 13б, Angarskaya Str., Volgograd, Russian Federation, 400049; 8Center of Hygiene and Epidemiology in Kalmykia, 8, Balakaeva, Elista, Republic of
Kalmykia, Russian Federation, 358000
338 blood sera from 254 CCHF patients residing in the south endemical areas of the Russian Federation during 2003-2010 were examined with the use of ELISA-IgM (MAC-ELISA) and ELISA-IgG methods. The dynamics of specific antibodies for a month from the beginning of the disease including patients with different clinical forms of CCHF, cases of different ages, males and females has been investigated.
Key words: Crimean-Congo hemorrhagic fever, serological diagnosis, ELISA-IgM, ELISA-IgG, dynamics of the specific antibodies
Введение
Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - это природно-очаговая острая инфекция человека, протекающая с лихорадочной реакцией, общей интоксикацией и геморрагическим синдромом, выраженным в виде кожных кровоизлияний и разнообразных полостных кровотечений. Вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ)1 передается, главным образом, при укусе иксодовых клещей. Возбудитель относится к роду Nairavirus семейства
Bunyaviridae. Ареал этой инфекции охватывает многие эндемичные регионы Африки, Азии и Европы. В России заболеваемость КГЛ зарегистрирована в Астраханской, ростовской, Волгоградской областях, Ставропольском и Краснодарском краях, Калмыкии, Дагестане, Ингушетии и Карачаево-Черкесии.
Для специфической диагностики КГЛ в эндемичных регионах россии и зарубежных стран в настоящее время широко используются методы им-муноферментного анализа: ИФА-^М и ИФА-^О,
Целесообразность использования двух различных названий: нозологической формы заболевания (КГЛ) и вируса-возбудителя (ККГЛ) сформулирована в предыдущих публикациях [4, 6].
Для корреспонденции: Трусова Ирина Николаевна, мл. науч. сотр. ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», e-mail: irina-trusova@yandex.ru
а также ОТ-ПЦР. Однако сведения по применению ИФА-IgM, ИФА-IgG и ОТ-ПЦР, опубликованные в иностранных изданиях, весьма ограничены и основаны на анализе обследования незначительного числа сывороток больных [15, 19]. При большом объеме подобных исследований, выполняемых в диагностических лабораториях Астрахани, Волгограда, Ростова-на-Дону, Ставрополя и Элисты, полученные результаты в достаточной степени не проанализированы и не отражены в публикациях [1-3, 7, 8, 12]. Не представлены данные по динамике IgM и IgG у больных с различными формами КГЛ, в разных возрастных группах, у мужчин и женщин.
Таким образом, актуальность наших исследований определяется недостаточным качеством и объемом информации, имеющей прямое отношение к интерпретации данных серодиагностического обследования больных кГЛ.
Материалы и методы
Сыворотки крови. Сыворотки крови и сведения о больных КГЛ были получены в 2003-2010 гг. из вирусологических лабораторий ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области», Астрахань, фГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», Ростов-на-Дону, ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнад-зора, Ставрополь, фГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Волгоградской области», Волгоград; ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике калмыкия», Элиста. В этих лабораториях сыворотки больных (в разведениях от 1:100 до 1:800-1:3200) были обследованы методом ИФА-IgM, а некоторые - ИФА-IgG. Окончательное титрование сывороток (для определения конечного разведения антител в положительных пробах) было выполнено в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва.
В тест-системах ИФА-IgM и ИФА-IgG на антитела к вирусу ККГЛ были обследованы 338 сывороток крови, взятых у 254 больных КГЛ: 100 сывороток от 77 больных из Астраханской области (2003-2010), 7 сывороток от трех больных из Волгоградской области (2003), 170 сывороток от 124 больных из Ростовской области (2004-2010), 23 сыворотки от 22 больных из Ставропольского края (2009), 38 сывороток от 28 больных из Калмыкии (2005).
Метод ИФА-IgM. Определение специфических IgM антител к вирусу ККГЛ проводили методом MAC-ELISA [17]. В лунках полистеролового планшета сорбировали козьи антитела IgG (производство фирмы Sigma, США), против ц-цепи иммуноглобулина человека. Затем последовательно вносили обследуемые сыворотки, сахарозо-ацетоновый антиген вируса ККГЛ (или нормальный контрольный антиген из мозга неинфицированных новорожденных белых мышей) и мышиные моноклональные антитела против вируса ККГЛ (ГЕМА-12), меченные перокси-дазой хрена.
На каждом из этапов постановки ИФА-IgM реакционные компоненты инкубировались 1 ч при температуре 37° С, а затем смесь тщательно промывали
0,01 М фосфатно-буферным раствором рН 7,4 с добавлением 0,15 М №С1 и 0,05% твина-20.
Субстрат-индикаторной системой служил раствор тетраметилбензидина с 0,006% перекиси водорода Н202. Реакцию останавливали 2^раствором серной кислоты. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали гетерологичные или нормальные контрольные антигены, а также контрольные, позитивные на ^М антитела, сыворотки больных КГЛ. Реакцию считали положительной, если отношение экстинкции опытных и контрольных образцов составляло не менее 3,0 (при 0П450 не ниже 0,3 для опытных образцов и не выше 0,1 в контроле).
Метод ИФА-IgG. Определение специфических антител к вирусу ККГЛ проводили методом ИФА-^в [17] в 96-луночных полистироловых планшетов с сорбированными поликлональными мышиными антителами к вирусу ККГЛ в КББ. Остальные реагенты вносили в следующей последовательности: блокирующий раствор 1% бычьего сывороточного альбумина, специфичный вирусный антиген (или нормальный контрольный антиген), обследуемые сыворотки и мышиные антитела против иммуноглобулинов класса человека, меченные пероксидазой хрена (ГНЦ РФ "Институт иммунологии федерального медико-биологического агентства", г. Москва). Результаты реакции учитывали так же, как при постановке МАС-ЕЬ^А.
Статистические методы. Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным формулам [10, 11, 13]. Среднее геометрическое титров (Мх) и среднеквадратичное отклонение (ах) рассчитывали по формулам:
М =
1
1=1
°х = '
1(x-Mx )2
-1-=-1 -------
~п-Т~
где, x, x2, ..., xn - это п реализаций случайной величины X.
Поскольку титры специфических антител, выявляемых у больных КГЛ методом ИФА не подчиняются нормальному (гауссовому) распределению, для непараметрической оценки достоверности различий двух статистических выборок использовали метод Манна-Уитни. Уровень значимости (р) был принят равным < 0,05.
Математическая и статистическая обработка результатов проводилась при помощи программ Microsoft Officce Excel 2003 и Microsoft Officce Access 2003.
Результаты и обсуждение
Динамика специфических IgM. На IgM к вирусу ККГЛ были обследованы 338 сывороток крови 254 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ. Специфические IgM к вирусу ККГЛ были обнаружены в 297 (87,9%) пробах от 249 больных, взятых с 1-го по 30-й день заболевания. В периоды с 1-го по 5-,
x
Таблица 1
Суммарные данные обследования в ИФА-^М сывороток крови больных КГЛ с 1-го по 30-й день заболевания
Дни от начала заболевания Число обследованных сывороток Процент положительных проб Средние геометрические обратных титров
к^ ± о титр
1-5 40 40,0 13,1 ± 2,8 1:8700
6-7 44 81,8 13,1 ± 2,4 1:8600
8-9 65 96,9 13,5 ± 2,5 1:11 400
10-11 70 97,1 13,8 ± 2,1 1:14 600
12-13 35 91,4 14,4 ± 1,2 1:22 000
14-15 33 100,0 14,5 ± 2,2 1:22 700
16-17 19 94,7 13,1 ± 3,1 1:9000
18-20 14 92,9 14,0 ± 2,1 1:16 000
21-30 18 100,0 14,4 ± 2,6 1:21 000
Всего 338 87,9 13,8 ± 2,4 1:13 800
6-, 7-й и начиная с 10-го дня болезни частота выявления ^М-позитивных сывороток составляла соответственно 40,0; 81,8 и 97,1-100%. Средние геометрические титров при этом составляли от 1:8700 на 1-5-й день, достигали максимального значения 1:22 700 на 14-15-й день, достоверно превышая титры на 6-7-й и 8-9-й дни (р < 0,01 ир < 0,05). Высокие показатели ^М сохранялись в течение месяца от начала заболевания (табл. 1).
Для выявления особенностей динамики специфических антител у больных КГЛ с разной клинической формой болезни средние геометрические титров ^М рассчитывали по результатам титрования в ифА-^М 245 сывороток от 200 больных КГЛ. Клиническая форма заболевания определялась лечебными учреждениями по месту госпитализации больного.
На долю тяжелых случаев КГЛ с геморрагическим синдромом приходилось 19% больных, тяжелых случаев без геморрагического синдрома - 4,5%, среднетя-желых с геморрагическим синдромом - 25%, среднетя-желых без геморрагического синдрома - 36,5%, легких форм с геморрагическим синдромом - 1,5%, легких форм без геморрагического синдрома - 13,5%.
У больных с легким течением болезни с 1-7-го по 8-11-й день болезни происходило нарастание титров ^М антител от 1:7600 до 1:16 400, на 12-15-й день до 1:23 200, высокий уровень ^М сохранялся в период между 16-м и 30-м днями. У больных со среднетяже-лым течением заболевания титры ^М между 1-7-м и 8-11-м днями также возрастали в 2 раза с 1:7100 до 1:14 300, сохраняясь на этом уровне до 16-го дня и позднее. При тяжелом течении заболевания титры ^М антител по сравнению с 1-7-м днями болезни практически не возрастали на 8-11-й день (соответственно 1:5400 и 1:6700), на 12-15-й день заболевания увеличивались в 2 раза (с 1:6700 до 1:13 300), однако после 16-го дня снова снижались. Доля положительных в ИФА-^М сывороток крови больных с разным клиническим течением заболевания до 16-го дня различается несущественно (табл. 2).
При сравнении титров ^М у больных КГЛ во все анализируемые сроки обследования отмечается постоянная тенденция выявления более высоких титров антител при легком течении заболевания по сравнению со среднетяжелым и тяжелым, а также более высоких титров при среднетяжелой форме по сравнению с тяжелой. У больных с легкой формой КГЛ достоверно более высокие титры специфических ^М, чем при тяжелой форме (соответственно 1:15 300 и 1:7600) (р < 0,05). Кроме того, у пациентов со среднетяжелой формой КГЛ титры ^М в первые 7 дней болезни достоверно (р < 0,02) ниже, чем на 12-15-й день (соответственно 1:7100 и 1:16 400).
Таким образом, сравнение титров специфических ^М-антигел у больных КГЛ в 1-ю неделю заболевания, а также на 12-15 день может иметь значение для прогноза клинического течения заболевания. Двукратное возрастание титров ^М антител на 8-11 день по сравнению с первыми днями, вероятно, может свидетельствовать о возможном благоприятном завершении заболевания в виде легкой или среднетяжелой формы.
При изучении динамики специфических ^М-антител у больных КГЛ разных возрастных групп были обследованы в ИФА-^М 334 сывороток от 251 больного КГЛ, из них 17 (6,8%) больных были моложе 19 лет, 80 (31,9%) - в возрасте от 20 до 39 лет, 107
Таблица 2
Динамика титров специфических ^М-антител у больных КГЛ в зависимости от клинической формы заболевания и времени обследования
форма течения заболевания
Дни от начала заболевания тяжелая среднетяжелая легкая
число проб процент положительных проб к^ ± о титр число проб процент положительных проб 1о титр число проб процент положительных проб к^ ± о титр
1-7 22 68,1 12,4 ± 2,9 1:5400 39 48,7 12,8 ± 1,7 1:7100 13 61,5 12,9 ± 3,6 1:7600
8-11 21 95,2 12,7 ± 2,5 1:6700 63 98,4 13,8 ± 2,3 1:14 300 12 91,7 14,0 ± 2,1 1:16 400
12-15 13 92,3 13,7 ± 2,0 1:13 300 27 96,3 14,0 ± 2,1 1:16 400 6 100 14,5 ± 2,1 1:23 200
16-30 5 60,0 12,8 ± 4,4 1:7100 19 100 14,0 ± 2,4 1:16 400 5 100 14,8 ± 2,4 1:28 500
Всего... 61 82,0 12,9 ± 2,6 1:7600 148 84,4 13,7 ± 2,2 1:13 300 36 83,3 13,9 ± 2,6 1:15 300 19
Таблица 3
Динамика титров специфических IgM-антител у больных КГЛ в разных возрастных группах в зависимости от времени обследования
Возрастные группы
Дни от начала заболевания до 40 лет 40- 59 лет 60 лет и старше
число проб процент положительных проб к^ ± о титр число проб процент положительных проб ^ ± о титр число проб процент положительных проб к^ ± о титр
1-7 30 63,3 13,0 ± 2,0 1:8200 40 60,0 13,6 ± 2,3 1:12 400 15 66,7 12,7 ± 3,0 1:6700
8-11 55 96,4 14,4 ± 2,0 1:21 600 49 98,0 13,4 ± 2,5 1:10 800 27 96,3 13,0 ± 1,9 1:8200
12-15 24 96,0 14,5 ± 2,3 1:23 200 33 93,6 14,4 ± 1,8 1:21 600 9 100 14,3 ± 2,6 1:20 200
16-30 17 92,3 15,0 ± 1,9 1:32 800 23 94,4 14,0 ± 2,9 1:16 400 12 100 11,6 ± 2,9 1:3100
Всего... 126 88,3 13,9 ± 2,6 1:15 300 145 85,7 13,4 ± 2,6 1:10 800 63 90,5 12,6 ± 2,7 1:6200
(42,6%) - в возрасте от 40 до 59 лет и 47 (18,7%) - 60 и более лет. Вследствие малочисленности группы больных КГЛ младше 20 лет при статистическом анализе ее объединили с группой в возрасте от 20 до 39 лет.
Титры специфических ^М у больных КГЛ в возрастной группе 60 лет и старше оказались существенно ниже, чем в других возрастных группах. Максимальные титры ^М отмечены у больных в возрасте до 40 лет на 12-15-й день (1:23 200) и на 16-30-й день заболевания (1:32 800). С увеличением возраста пациента титры специфических ^М снижаются: 1:15 300, 1:10 800 и 1:6200 соответственно для групп до 40 лет, 40-59 лет и старше 60 лет. Доля положительных в ИФА-^М сывороток крови больных разных возрастов различается несущественно (табл. 3).
По критерию Манна-Уитни наиболее достоверная разница во все сроки заболевания наблюдается при обследовании групп пациентов до 40 лет и 60 лет и старше (р < 0,009). Достоверность различий в титрах специфических ^М между разными возрастными группами пациентов имеет место и при рассмотрении отдельных периодов болезни.
Таким образом, метод ИФА-^М обладает диагностической эффективностью при обследовании больных любых возрастных групп, однако факт выявления более низких титров специфических ^М-антител у пожилых больных может рассматриваться как негативный прогностический признак.
Для изучения динамики специфических ^М-антител у мужчин и женщин было обследовано 338
сывороток крови от 254 больных КГЛ, среди которых было 165 (65,0%) мужчин и 89 (35,0%) женщин Установлено, что динамика специфических ^М-антител у мужчин и женщин, больных КГЛ, практически не различается. С первых дней заболевания в обеих группах наблюдается постепенное возрастание титров ^М до 16-го дня. Доля положительных находок специфических ^М в разные периоды обследования в течение месяца от начала болезни также совпадает (табл. 4).
Достоверные различия в титрах ^М-антител у мужчин и женщин наблюдались при их обследовании на 1-7-й (р < 0,001) и 8-11-й день заболевания (р < 0,04). Достоверно различались титры ^М у женщин между 1-7, и 12-15-м днями заболевания (р < 0,02), а также между 8-11 и 12-15-м днями (р < 0,002). У мужчин достоверные отличия в титрах ^М выявлены между 1-7-м и 12-15-м днями заболевания, а также между 1-7-м и 16-30-м днями. Эти данные совпадают с общей, суммарной динамикой ^М-антител, выявляемых в сыворотках крови всех обследованных больных КГЛ.
Динамика специфических IgG. На к вирусу ККГЛ были обследованы 332 сыворотки крови 254 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ. Специфические к вирусу ККГЛ в целом по пяти регионам были обнаружены в 172 (52,1%) пробах, взятых с 1-го по 30-й день заболевания. Специфические в периоды 1-7-го, 12-15-го и 16-18-го дней обнаруживали соответственно в 24,4; 47,7; 68,7 и 83,6-
Таблица 4
Динамика титров специфических IgM-антител у мужчин и женщин, больных КГЛ, в зависимости от времени обследования
Пол больных
Дни от начала мужчины женщины
заболевания число проб процент положительных проб к^ ± о титр число проб процент положительных проб к^ ± о титр
1-7 43 44,2 12,6 ± 2,7 1:6200 42 68,3 13,4 ± 2,4 1:10 800
8-11 89 97,8 13,8 ± 2,4 1:14 300 45 95,5 13,3 ± 2,0 1:10 100
12-15 41 92,7 14,1 ± 2,3 1:17 600 27 100 14,8 ± 1,7 1:28 500
16-30 39 97,3 14,1 ± 2,5 1:17 600 12 100 13,4 ± 2,6 1:10 800
Всего ... 212 85,7 13,8 ± 2,5 1:14 300 126 87,9 13,7 ± 2,2 1:13 300
20
Таблица 5
Результаты обследования в ИФА-IgG сывороток крови больных КГЛ с 1-го по 30-й день заболевания
День заболе- Число обследованных Процент положитель- Средние геометрические обратных титров
вания сывороток ных проб log ± о титры
1-7-й 82 24,4 8,2 ± 1,8 1:290
8-11-й 132 47,7 8,6 ± 2,1 1:390
12-15-й 69 68,7 9,4 ± 1,9 1:680
16-18-й 23 83,6 10,1 ± 2,7 1:1100
19-30-й 26 92,3 9,9 ± 2,1 1:960
Всего... 332 52,1 9,1 ± 2,2 1:550
92,3% случаев. Средние геометрические титров ^О в сроки на 1-7; 8-11; 12-15 и 16-30-й дни составляли 1:290; 1:680 и 1:1100. Средний показатель титров 1:960 сохраняется до конца месяца, достоверно на более высоком уровне (р < 0,01 и р < 0,005), чем на 1-7-й и 8-11-й дни (табл. 5).
Для выявления особенностей динамики специфических ^О-антител у больных КГЛ в зависимости от клинической формы болезни в ИФА-^О было обследовано 270 сывороток крови от 200 больных КГЛ.
Титры специфических ^О у больных с разными клиническими формами не имели существенных различий. При тяжелой, среднетяжелой и легкой формах заболевания наблюдали возрастание титров от 7,9 ± 1,9 (1:240), 7,4 ± 0,5 (1:170) и 9,0 ± 1,5 (1:510) на 1-7-й день до 10,4 ± 4,1 (1:1400),
10.3 ± 2,9 (1:1300) и 9,8 ± 1,1 (1:89)0) на 1630-й дни соответственно. Титры антител у больных со среднетяжелой формой заболевания на 12-15-й и 16-30-й дни статистически достоверно выше, чем на 1-7-й день (р < 0,004, р < 0,01).
Во всех трех группах с тяжелой, среднетяжелой и легкой формами КГЛ наблюдалось возрастание доли положительных находок ^О-антител среди сывороток крови, взятых в периоды 12-15-го и 16-30-го дней заболевания: 61,5 и 80% при тяжелой форме,
70.4 и 77,8% при среднетяжелой и 80 и 100% при легкой (табл. 6).
При выполнении раздела работы, посвященной изучению динамики IgG-антител в разных возрастных группах, в ИФА-IgG были обследованы 334 сыворотки от 251 больного КГЛ, из них 17 (6,8%) больных моложе 19 лет, 80 (31,9%) больных в возрасте от 20 до 39 лет, 107 (42,6%) больных в возрасте от 40 до
59 лет и 47 (18,7%) больных старше 60 лет.
У больных всех возрастных групп показатели титров антител возрастали на 16-30-й день заболевания по отношению к 1-7-му дню. Высокая достоверность различий в титрах наблюдалась в группах до 40 лет (титры антител на 16-30-й день выше, чем на 1-7-й; p < 0,02), 40-59 лет (титры на 12-15 и 16-30-й дни выше, чем на 8-11-й день; p < 0,01 иp < 0,02 соответственно), 60 лет и старше (титры на 12-15-й день выше, чем на 1-7-й день; p < 0,05). Достоверность различий отмечали при сравнении титров IgG в разные периоды болезни в разных возрастных группах.
Доля положительных сывороток крови больных в возрасте до 40 лет составляла 60% уже на 8-11-й день, тогда как в группе 40-59 лет в этот период доля серопозитивных сывороток была 35,4 % , а в группе
60 лет и старше - 44,4% (табл. 7).
Таким образом, отличия в титрах IgG-антител в разных возрастных группах не связаны с возрастом, однако частота обнаружения IgG-антител у больных в возрасте до 40 лет существенно выше, чем в других группах.
Для выявления особенностей динамики специфических IgG-антител у мужчин и женщин, больных КГЛ, в ИФА-IgG обследовали 325 сывороток от 254 больных КГЛ: 165 (65%) мужчин и 89 (35%) женщин.
Данные динамики титров специфических IgG у женщин и мужчин, больных КГЛ, оказались сходными. Наблюдалось возрастание титров антител с 1-7-й по 16-30-й день заболевания: у женщин от 8,1 ± 1,4 log2 (1:270) до 10,9 ± 2,3 log2 (1:1300), у мужчин от 9,4 ± 2,4 log2 (1:680) до 9,7 ± 2,3 log2 (1:830). Доля серопозитивных сывороток возрастает на 12-15-й день заболевания до 70,7% у мужчин и 65,4% у женщин, а после 16-го дня у мужчин до 86,5%, у женщин до 83,3% (табл. 8).
Достоверные различия в титрах по критерию Манна-Уитни наблюдали при рассмотрении отдель-
Таблица 6
Динамика титров специфических IgG-антител у больных КГЛ в зависимости от клинической формы заболевания и времени обследования
Форма течения заболевания
День от тяжелая среднетяжелая легкая
начала заболевания число проб процент положительных проб log ± о титр число проб процент положительных проб log ± о титр число проб процент положительных проб log ± о титр
1-7-й 25 20,0 7,9 ± 1,9 1:240 42 18,0 7,4 ± 0,5 1:170 14 23,1 9,0 ± 1,5 1:510
8-11-й 23 30,0 8,0 ± 1,5 1:260 68 48,3 8,6 ± 2,2 1:390 13 58,3 8,8 ± 1,8 1:450
12-15-й 15 61,5 9,6 ± 3,0 1:780 27 70,4 9,6 ± 2,0 1:780 8 80,0 8,6 ± 0,8 1:390
16-30-й 6 80,0 10,4±4,1 1:1400 23 77,8 10,3 ± 2,9 1:1300 6 100 9,8 ± 1,1 1:890
Всего... 69 38,0 9,0 ± 3,4 1:510 160 48,0 9,1 ± 2,3 1:550 41 54,0 9,1 ± 1,4 1:550 21
Таблица 7
Динамика титров специфических IgG-антител у больных КГЛ в разных возрастных группах в зависимости от времени обследования
Возрастные группы
День от до 40 лет 40-59 лет 60 лет и старше
начала заболевания число проб процент положительных проб к^ ± о титр число проб процент положительных проб ^ ± о титр число проб процент положительных проб ^ ± о титр
1-7-й 29 27,6 7,9 ± 1,3 1:240 40 22,5 8,9 ± 3,0 1:480 14 28,6 8,1 ± 2,8 1:270
8-11-й 55 60,0 8,9 ± 2,0 1:480 48 35,4 8,3 ± 2,6 1:310 27 44,4 9,4 ± 1,2 1:680
12-15-й 25 68,0 8,9 ± 1,3 1:480 33 66,7 10,0 ± 2,4 1:1000 8 87,5 10,0±1,2 1:1000
16-30-й 25 96,0 9,6 ± 1,9 1:780 18 72,2 10,0 ± 2,6 1:1000 12 83,3 9,4 ± 2,2 1:680
Всего... 134 61,0 9,0 ± 1,9 1:510 139 44,0 9,4 ± 2,7 1:680 61 54,0 9,1 ± 1,9 1:550
ных периодов болезни как у женщин, так и мужчин. У женщин титры на 12-15-й и 16-30-й дни достоверно выше титров антител, выявляемых на 1-7-й день (р < 0,003) и 8-11-й день (р < 0,04, р < 0,02). У мужчин титры на 16-30-й день достоверно выше титров антител, выявляемых на 8-11-й день (р < 0,01). Достоверность различий в титрах также имела место между мужчинами и женщинами в разные периоды болезни.
Результаты анализа динамики специфических у мужчин и женщин подтверждают сведения, полученные в ходе анализа суммарных данных антител у всех обследованных больных.
Результаты серологического обследования случаев КГЛ с летальным исходом. Среди 254 больных КГЛ, обследованных при выполнении настоящей работы, было отмечено 5 летальных случаев. В ИФА-^М и ИФА-^в нами обследовано 6 проб сывороток крови пяти погибших. У 4 больных заболевание протекало в тяжелой форме с геморрагическим синдромом и у 1 - в тяжелой форме без геморрагического синдрома. 2 умерших были в возрасте от 40 до 59 лет, 2 - старше 60 лет и 1 больной - в возрасте 37 лет. Смертельные исходы наблюдались на 7-12-й день заболевания. Титры ^М-антител у больных с летальным исходом составили: на 6-й день заболевания 1:12 800, на 7-й день - 1:6400, 1:12 800 и 1:51 200, на 8-й день - 1:6400. Одна проба сыворотки, взятая на 5-й день заболевания, оказалась отрицательной. В ИФА-^в положительный ответ (1:200) наблюдали только в одной сыворотке, взятой на 7-й день болезни.
Результаты обследования в ИФА сывороток крови умерших совпадают с суммарными данными по динамике ^М- и ^в-антител у всех обследованных больных КГЛ: средние геометрические титров ^М на 6-7-й день - 13,1 ± 2,4 (1:8600), на 8-9-й день
- 13,5 ± 2,5 (1:11 400); титры ^ на 1-7-й день -8,2 ± 1,8 (1:290) (см. табл. 1, 5).
По данным Е ВиМ и соавт. [16] специфические ^М и обнаруживаются с 5-го дня болезни, а начиная с 9-го дня присутствуют у всех выживших больных. В Южной Африке у лиц, переболевших КГЛ, ^М-антитела выявляются на 4, 6, 7, 8 и 9-й дни болезни соответственно в 10, 65, 83, 94 и 100% случаев [14, 20]. Их титры достигали максимального уровня на 2-3-й неделе болезни и обычно исчезали через 4 мес;
сохранялись при некотором снижении титров в течение нескольких лет [14, 18, 20, 22]. У больных, умерших на 4-9-й день заболевания, антитела обнаруживались крайне редко [19, 21].
По сведениям Л.С.Карань и соавт. [7], полученным в результате обследования значительного числа сывороток больных КГЛ, чувствительность ОТ-ПЦР относительно ИФА составила 95%, а специфичность
- 98%. При этом на 1-8-й день заболевания правильная диагностика КГЛ по выявлению РНК вируса КГЛ была возможной у 95% больных, по выявлению специфических ^М - у 43%. Для обнаружения се-роконверсии требовалось обследование парных сывороток не ранее чем на 3-й неделе заболевания.
Предшествующие исследования, посвященные изучению динамики специфических ^М и у больных
Таблица 8
Динамика титров специфических IgG-антител у мужчин и женщин, больных КГЛ, в зависимости от времени обследования
Пол больных
День от начала за- мужчины женщины
болевания число проб процент положительных проб к^ ± о титр число проб процент положительных проб ^ ± о титр
1-7-й 40 15,0 9,4 ± 2,4 1:680 40 30,0 8,1 ± 1,4 1:270
8-11-й 89 47,2 8,5 ± 2,1 1:360 40 52,5 8,9 ± 2,2 1:480
12-15-й 41 70,7 8,9 ± 1,7 1:480 26 65,4 10,3 ± 2,1 1:1300
16-30-й 37 86,5 9,7 ± 2,3 1:830 12 83,3 10,9 ± 2,3 1:1300
Всего... 207 52,7 9,0 ± 2,3 1:510 118 50,8 9,5 ± 2,2 1:720
КГЛ с разными клиническими формами и в разных возрастных группах подробно рассмотрены в работе А.М. Бутенко [5]. Эти исследования были проведены с использованием РСК и РДПА. Результаты, приведенные в работе, показывают, что независимо от формы болезни у больных КГЛ наблюдается сходная картина динамики КС-антител. Вместе с тем в среднем у больных с легкой и средней формами КГЛ титры КС-антител существенно ниже, чем у больных с тяжелой формой болезни, что выявляется при сравнении средних геометрических титров в период между 30-м и 100-м днем после начала заболевания. Динамика КС-антител у больных в возрасте 21-40, 41-60 и 60 лет и старше практически не различается. Аналогичные данные получены при обследовании сывороток крови в РДПА. У больных с тяжелой формой болезни титры преципити-рующих антител выше (2,7 ^2), чем в тот же период у больных со средней (1,6 ^2) и легкой (1,6 ^2) формами КГЛ. Динамика преципитирующих антител у больных КГЛ в возрасте до 40 лет и у больных старше 40 лет практически одинакова.
Наша работа основана на материалах обследования методами ИФА-^М и ИФА-^О 338 сывороток крови 254 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ, полученных из Ростовской, Астраханской, Волгоградской областей, Калмыкии и Ставропольского края за 2003-2010 гг. По результатам обследования методами ИФА представительного числа сывороток крови больных КГЛ с применением статистической обработки данных впервые проведен анализ динамики обнаружения и титров специфических ^М-и ^О-антител в разные периоды заболевания, при разных клинических формах, в разных возрастных группах, у мужчин и женщин.
В периоды с 1-го по 5, 6, 7-й и начиная с 10-го дня болезни частота выявления ^М-позитивных сывороток составляет соответственно 40,0; 81,8 и 97,1-100%. Средние геометрические титров при этом возрастают от 1:8700 на 1-5-й день, достигают максимального значения 1:22 700 на 14-15-й день, достоверно отличаясь (р < 0,01 и р < 0,05) от титров на 6-7-й и 8-9-й день. Высокие показатели титров ^М сохраняются в течении месяца от начала заболевания (срок наблюдения).
Специфические ^О в периоды 1-7, 12-15 и 1618-й дни обнаруживаются соответственно в 24,4; 47,7; 68,7 и 83,6-92,3% случаев. Средние геометрические титров ^О в сроки 1-7; 8-11; 12-15 и 16-30-й дни составляют 1:290; 1:680 и 1:1100. Средний показатель титров 1:960 сохраняется до конца месяца, достоверно на более высоком уровне (р < 0,01 и р < 0,005), чем на 1-7-й и 8-11-й дни.
Высокая достоверность отличий в титрах ^М-антител (в целом для всех сроков обследования) наблюдается между группами пациентов с легкой (1:15 300) и тяжелой формами КГЛ (1:7600) (р < 0,05), а также между группами со среднетяжелой формой в первые 7 дней болезни (1:7100) и на 12-15-й день (1:16 400) (р < 0,02). Наличие у больных максимально высоких титров специфических ^М-антител в первые 7 дней заболевания (а также на 12-15-й день) может рассматриваться
как положительный прогностический признак, свидетельствующий о тенденции завершения заболевания в легкой или среднетяжелой форме.
Титры IgM-антител у больных КГЛ в возрастной группе до 40 лет значительно выше, чем в группе 60 лет и старше (соответственно 1:15 300 и 1:6200) (p < 0,009), что коррелирует с данными о наиболее частом проявлении тяжелой формы КГЛ у пожилых пациентов.
Разница в титрах и динамике появления специфических IgG-антител в группах больных с разными клиническими формами КГЛ и в разных возрастных группах не существенна. Динамика IgM- и IgG-антител у больных мужчин и женщин также не имеет значительных различий.
При обследовании в ИФА-IgM 6 проб сывороток крови умерших больных КГЛ, взятых на 5-8-й день заболевания, наблюдали положительный ответ антител в 5 пробах в титрах от 1:6400 до 1:51 200. Эти результаты расходятся с данными A. Shepherd и со-авт. [17], которые при обследовании в ИФА-IgM и ИФА-IgG 15 больных, умерших от КГЛ, обнаружили специфические антитела только в двух случаях.
Таким образом, по результатам обследования методами ИФА представительного числа сывороток крови больных КГЛ с применением статистической обработки данных впервые проведен анализ динамики обнаружения и титров специфических IgM-и IgG-антител в разные периоды заболевания, при разных клинических формах, в разных возрастных группах, у мужчин и женщин. На основании полученных данных подтверждается и рекомендуется научно-обоснованная схема серологической диагностики КГЛ с обязательным применением ИФА-IgM, а также ИФА-IgG. Метод ИФА-IgG рекомендуется как подтверждающий, но необязательный тест.
Сведения об авторах:
Бутенко Александр Михайлович, доктор биол. наук, проф., зав. лаб. биологии и индикации арбовирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского», e-mail: arboelisa@ mail.ru; Ларичев Виктор Филиппович, канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. биологии и индикации арбовирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского», e-mail: vlarichev@ mail.ru; Щелканов Михаил Юрьевич, доктор биол. наук, канд. физико-математических наук, зав. лаб. экологии вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского»; Азарян Алла Рудольфовна, зав.вирусологической лаб. ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области»; Гриша-нова Анна Петровна, врач-вирусолог вирусологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области»; Иващенко Екатерина Ивановна, врач-вирусолог вирусологической лаб. ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области»; Аршба Татьяна Ефимовна, зам.глав.врача ГУЗ «Областная инфекционная клиническая больница им. А.М.Ничоги»; Говорухина Марина Викторовна, зав. вирусологической лаб. ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», e-mail: master@donses.ru; Асмолова Н.Ю., врач-вирусолог вирусологической лаб. ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области»; Сиденко И.С., врач МБУЗ «Центральная районная больница Сальского района»; Василенко Надежда Филипповна, ведущий научный сотрудник ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнад-
зора, e-mail: snipchi@mail.stv.ru, Русакова Надежда Васильевна, зав. вирусологической лаб. ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Волгоградской области», e-mail: virus@ fguz-volgograd.ru; Шишкина Людмила Викторовна, врач-вирусолог вирусологической лаб. ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Волгоградской области», e-mail: virus@ fguz-volgograd.ru; Бушкиева Белла Цереновна, зав.вирусо-логической лаб. фБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Калмыкия» , e-mail: bushkieva@mail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Азарян А.Р., Гришанова А.П., Бутенко А.М. и др. Серологическая диагностика арбовирусных инфекций в Астраханской области. В кн.: Материалы расширенного пленума Проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конф. «Арбо-вирусы и арбовирусные инфекции». Астрахань, 17-20 окт. 2006 г. М., 2007: 115-20.
2. Айдинов Г.В., Мороз Н.В., Баташева И.И. Клинико-эпидемиологическая характеристика крымской геморрагической лихорадки в Ростовской области. В кн.: Материалы расширенного пленума Проблемной комиссии «Арбовирусы» и Научно-практической конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции». Астрахань, 17-20 окт. 2006 г. М., 2007: 198-204.
3. Айдинов Г.Т., Швагер М.М., Говорухина М.В. и др. Лабораторная диагностика прородно-очаговых вирусных инфекций в Ростовской области. В кн.: Материалы расширенного пленума Проблемной комиссии «Арбовирусы» и Научно-практической конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции». Астрахань, 17-20 окт. 2006 г. М., 2007: 122-4.
4. Бутенко А.М. Крымская-конго геморрагическая лихорадка. В кн.: Покровский В. И., Онищенко Г. Г., Черкасский Б. Л.. Эволюция инфекционных болезней в России в ХХ веке. М.: Медицина; 2003: 365-76.
5. Бутенко A.M. Материалы по изучению этиологии, лабораторной диагностики и иммунологии крымской геморрагической лихорадки; вопросы экологии вируса-возбудителя: Дис. ... д-ра биол. наук. М.;1971.
6. Бутенко А.М., Лещинская Е.В., Львов Д.К. Крымская геморрагическая лихорадка. Вестник РАЕН, 2002; 2: 41-9.
7. Карань Л.С., Платонов А.Е., Смирнова С.Е. и др. Генетические исследования при КГЛ: от диагностики до молекулярной эпидемиологии. В кн.: Материалы расширенного пленума Проблемной комиссии «Арбовирусы» и Научно-практической конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции». Астрахань, 17-20 окт. 2006 г. М.; 2007: 57-61.
8. Леоненко Н.В., Судьина Л.В. Современное состояние природного очага крымской геморрагической лихорадки в Ростовской области. В кн.: Материалы расширенного пленума Проблемной комиссии «Арбовирусы» и Научно-практической конф. «Арбо-
вирусы и арбовирусные инфекции». Астрахань, 17-20 окт. 2006 г. М.; 2007: 128-32.
9. Лобанов А.Н., Савченко С.Т., Смелянский В.П. и др. Крымская геморрагическая лихорадка в Волгоградской области. В кн.: Материалы расширенного пленума Проблемной комиссии «Ар-бовирусы» и Научно-практической конф. «Арбовирусы и арбо-вирусные инфекции». Астрахань, 17-20 окт. 2006 г. М.; 2007: 132-6.
10. Прохоров Ю.В., Розанов Ю.А. Теория вероятностей (основные понятия, предельные теоремы, случайные процессы). М.: Наука; 1973.
11. Тутубалин В.Н. Теория вероятностей и случайных процессов. М.: Издательство МГУ; 1992.
12. Черенова Л.П., Чалов В.В., Галимзянов Х.М. и др. Современные особенности клиники крымской геморрагической лихорадки. В кн.: Материалы расширенного пленума Проблемной комиссии «Арбовирусы» и Научно-практической конф. «Арбо-вирусы и арбовирусные инфекции». Астрахань, 17-20 окт. 2006 г. М.; 2007: 190-4.
13. ШиряевА.Н. Вероятность. М.: Наука; 1989.
13. Burt F.J., Leman PA., Abbott J.C., Swanepoel R. Serodiagnosis of Crimean Congo hemorrhagic fever. Epidemiol. and Infect. 1994; 113(3): 551-62.
14. Burd F.J., Paweska J.T., Swanepoel R. Crimean-Congo hemorrhagic fever. In: Ergonul O., Whitehouse Ch., eds. Crimean-Congo hemorrhagic fever. Springer; 2007: 131-41.
15. Burt F.J., Swanepoel R., Braack L.E. Enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of antibody to Crimean-Congo haemor-rhagic fever virus in the sera of livestock and wild vertebrates. Epidemiol. and Infect. 1993; 111(3): 547-57.
16. Meegan J.M., LeDuc J.W. Enzyme immunoassay. In: Ho Wang Lee, Dalrymple J.M., eds. Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome. Seoul; 1989: 83-7.
17. Schawarz T.F., NsanzeH., Longson et al. Polymerase chain reaction for diagnosis and identification of distinct variants of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in the United Arab Emirates. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1996; 55: 190-6.
18. Shepherd AJ., SwanepoelR., Leman PA. Antibody response in Crimean-Congo hemorrhagic fever. Rev. Infect. Dis. 1989; II(Suppl. 4): 801-6.
19. Swanepoel R. Crimean-Congo haemorrhagic fever. In: Coetzer J.A.W., Thomson G.R., Tustin R.C., eds. Infectious diseases of livestock. Oxford: Oxford University Press; 1994; 1: 723-9.
20. Tarantola A., Nabeth P., Tattevin P., Michelet C., Zeller H. Incident Management Group (2006). Lookback exercise with imported Crimean-Congo hemorrhagic fever, Senegal and France. Emerg. Infect. Dis. ; 12: 1424-6.
21. Zeller H. Laboratory diagnosis of Crimean-Congo Hemorrhagic fever. In: Ergonul O., Whitehouse Ch., eds. Crimean-Congo Hemorrhagic fever. Springer; 2007: 233-43.
Поступила 22.03.13
© О.В. КОРОЧКИНА, А.М. РЮМИН, 2013 уДК 616.36-002.2-022-08
О.В. Корочкина, А.М. Рюмин
оптимизация тактики ведения вольных хроническим гепатитом C
ГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия, 603022, Нижний Новгород, ул. Барминская, 8а
Изучено прогностическое значение характеристики больных (пол, возраст, доза инфекта, наличие привычных интоксикаций) и вируса (репликативная активность, генотип, вирусная нагрузка, врусная кинетика) при естественном течении ХГС и вероятности достижения устойчивого вирусологического ответа (УВО) в результате противовирусной терапии (ПВТ). Было проанализировано естественное течение ХГС у 100 больных и эффективность ПВТу 68 больных ХГС. Установлены факторы, определяющие неблагоприятное течение ХГС (мужской пол, возраст в момент инфицирования старше 30 лет, инфицирование при гимотрансфузиях или употреблении наркотиков, наличие привычных интоксикаций, генотип вируса 3а, а также наличие a/HCVns3 и a/HCVns5). Выявлены факторы, определяющие высокую вероятность достижения УВО. Рекомендуется проведение ПВТ независимо от прогноза естественного течения ХГС.
Ключевые слова: гепатит С, факторы прогрессирования, тактика ведения
