CC BY
41
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-19-12-241-245
УДК 616-092.9:612.398.12:602:577.121.9
ДИНАМИКА ОСНОВНЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРЫС ПРИ ОСТРОМ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Демьяненко Е.В.
ГУ Луганский Государственный Медицинский Университет Имени Святителя Луки, г. Луганск, Украина
Аннотация. В статье рассмотрены вопросы влияния острого иммобилизационного стресса на основные биохимические показатели сыворотки крови и закономерности их восстановления после введения мезенхимальных стволовых клеток. Целью работы было показать эффективность применения мезенхимальных стволовых клеток для коррекции состояний, главным патогенетическим звеном которых является ишемия. Экспериментально было установлено, что острая иммобилизация приводит к выраженным изменениям параметров метаболизма, усилению процессов катаболизма, что проявляется повышением уровня ферментов, увеличением концентрации билирубина, мочевины и креатинина, снижением концентрации общего белка в сывотротке крови. Это связано с тем, что ишемические изменения в тканях сопровождаются активацией свободнорадикальных процессов и нарушением функционально-структурной целостности мембран. Было показано, что величины биохимических показателей крови зависят от длительности постиммобилизационного периода. Исследованием установлено, что в группе животных, получавших клеточную терапию, восстановление биохимических показателей сыворотки крови происходило в более короткие сроки по сравнению с животными контрольной группы, что может свидетельствовать об активации процессов репарации в тканях внутренних органов. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований использования мезенхимальных стволовых клеток для лечения различных патологических состояний.
Ключевые слова: биохимические показатели, ишемия, иммобилизационный стресс, мезенхимальные стволовые клетки.
Введение. Стресс - это совокупность общих, биохимических, физиологических и психических реакций организма в ответ на действие чрезвычайных раздражителей [1]. Известно, что ограничение двигательной активности является мощнейшим стрессирующим фактором: при остром иммобилизационном стрессе в органах животных нарушается микроциркуляция и развиваются явления ишемии, активируются свободно-радикальных процессы, что может способствовать развитию дистрофических и некротических изменений [1, 2, 3]. Идея клеточной трансплантации успешно реализуется для лечения различных ишеми-ческих состояний [4]. Использование терапии клетками с высоким пролиферативным потенциалом может помочь в восстановлении функции поврежденных органов [4, 5]. Однако вопрос о реактивных изменениях биохимических показателей метаболизма при остром стрессе после применения мезенхимальных стволовых клеток остается открытым.
Цель исследования. Изучить динамику общего билирубина, аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), креатинкиназы (КК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинина,
мочевины, общего белка, альбумина сыворотки крови при остром иммобилизационном стрессе после внутривенного введения мезенхимальных стволовых клеток (МСК).
Материалы и методы. Исследование проводили на 208 самцах нелинейных белых крыс массой 200 -250 грамм. Животных содержали на стандартных условиях вивария, согласно Страсбургской конвенции по защите прав лабораторных животных, используемых для научных целей (Страсбург, 1986г). Острый иммо-билизационный стресс моделировали помещением крыс на 24 часа в индивидуальные стеклянные иммо-билизационные камеры. Клетки костного мозга получали промыванием полости бедренных костей взрослых животных питательной средой после декапитации под легким эфирным наркозом. Полученные клетки помещали в питательную среду ИГЛА-МЕМ с L-глю-тамином, 10% телячьей эмбриональной сывороткой и антибиотиками. Культивировали 14 дней при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2 в HF151UV СО2-инку-баторе со сменой средой 1 раз в неделю. Культуру фе-нотипировали непрямым иммунофлюоресцентным методом с помощью специфических маркеров к МСК.
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
Жизнеспособность клеток оценивали по тесту с трипа-новым синим. Животных разделили на группы: № 1 -интактная, № 2 - контрольная (животным провели иммобилизацию, но МСК не вводили), № 3 - экспериментальная (животным вводили МСК после иммобилизации). Животным группы № 3 через 1 час после иммобилизации в латеральную хвостовую вену вводили по 5 миллионов МСК, а животным группы № 2 - по 1мл стерильного физиологического раствора. Животных групп № 2 и № 3 декапитировали под эфирным наркозом на 1, 3, 7, 14, 21 и 30 сутки после введения МСК и физиологического раствора соответственно. Производили забор крови для получения сыворотки. Для оценки изменений метаболического звена гомеостаза определяли содержание общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, активности аланиновой и аспара-гиновой аминотрансфераз (АЛТ, АСТ), лактатдегидро-геназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК) в сыворотке крови животных с использованием биохимического анализатора «ADVIA-2000». Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «Statistica 10.0». Соответствие закону нормального распределения оценивали по значениям тестов Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса и W-критерия Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий показателей в группах сравнения оценивали по критерию Манна-Уитни. Достоверно значимыми считали отклонения при р<0,05.
Результаты. Исследованием установлено, что значения биохимических показателей сыворотки крови зависят от длительности постиммобилизационного периода и существенно изменяются после введения МСК (таблица 1).
Было показано, что уровень общего билирубина в группах № 2 и № 3 был максимальным на 7 сутки наблюдения и превышал показатели группы № 1 на 26,69% и 28,5% соответственно. В группе контроля цифры общего билирубина постепенно снижались и к 30 суткам достигли интактных значений. Показатели экспериментальной группы были ниже контрольных и уже к 14 суткам достигли интактных значений. Относительно значений аминотрансфераз в группах № 2 и № 3 уровни АЛТ и АСТ были максимальными на 3 сутки эксперимента. При этом значения АЛТ превышали интактные значения соответственно на 129,48% и 133,5%, АСТ - на 101,2% и 97,3%, что может указывать на развитие цитолитического синдрома в результате нарушения внутрипеченочной гемодинамики, приводящей к ишемии и активизации перекисного окисления липидов мембран гепатоцитов, на фоне им-
мобилизационного стресса [1, 2]. На 7 сутки наблюдения показатели аминотрансфераз в группах № 2 и № 3 оставались высокими, а затем снижались, достигая к 21 суткам интактных значений. При этом с 14 суток в группе № 1 отмечалось недостоверное снижение показателей АЛТ относительно группы контроля. Значения АСТ в группе № 3 были ниже показателей группы № 2 с максимальным различием на 14 сутки эксперимента (на 26,28%). Уровни КК и ЛДГ сыворотки крови в группах № 2 и № 3 резко увеличивались уже в 1 сутки постиммобилизационного периода по сравнению с показателями интактных животных, что косвенно может отражать нарушения энергетических процессов в тканях и свидетельствовать о повреждении мембран клеток активными формами кислорода при стрессе [1]. В течение первых 7 суток реадаптационного периода цифры КК и ЛДГ оставались высокими. В дальнейшем отмечалось снижение указанных показателей в группе контроля, однако интактных значений к 30 суткам они так и не достигли. Показатели КК в группе животных, леченных МСК, были ниже значений группы № 2 на все сутки постиммобилизационного периода с максимально выраженной разницей на 7 (на 17,13%) и 21 сутки (на 16,14%) эксперимента. Показатели ЛДГ в группе № 3 достигали значений интактных животных к 21 суткам эксперимента, при этом ее показатели с 7 суток были достоверно ниже контрольных. На 3 сутки исследования в группах № 2 и № 3 концентрации кре-атинина (на 28,36% и 28,64%) и мочевины (на 54,34% и 40,1%) достоверно увеличились по сравнению с группой № 1. Увеличение этих показателей в сыворотке крови при иммобилизационном стрессе может свидетельствовать о нарушении азотовыделительной функции почек, что можно объяснить нарушением внутриорганной микроциркуляции, развитием цирку-ляторной гипоксии [2], активизацией свободно-радикальных процессов [1, 2]. Росту уровня креатинина способствует также усиление процессов катаболизма [3], а увеличение в крови мочевины может указывать на окислительное повреждение дезоксирибонуклеино-вой кислоты в органах крыс в результате активации свободно-радикальных процессов при стрессе [1, 2]. Интактые значения креатинина были достигнуты в группе № 2 к 30 суткам исследования, а в группе № 3 - к 14 суткам. Показатели мочевины к концу исследования превышали интактные значения в группе № 2 на 4,38%, а в группе № 3 достигали интактных цифр на 21 сутки эксперимента. При этом указанные показатели в группе № 3 были ниже контрольных на всем протяжении реадаптационного периода. Значения общего белка и альбумина сыворотки крови животных
Таблица 1
Динамика биохимических показателей сыворотки крови крыс при остром нммобнлпзацпонном стрессе на фоне введения МСК
Группы Билирубин общий (ummoll) AJIT (al) ACT (ul) Креатннкн-наза (нмоль/сл) Креатинин (ummol'l) Мочевина (mmol 1) Общий белок (g/1) Альбумин (g/1) лдг (и/1)
Интакт. 0=28) 1.105 Г0-805; 1.2 71 87.5 [77.25; 06.551 18S.95 [153.9; 22.751 300.92 [266.72:30.211 71.825 [62.245; 5.03 51 6.045 [5.14;6.9251 86.71 [80.805:88.945] 40.595 [39.075:42.081 2443 [1964.1:2634.31
Контрольная группа
1 сугкн (п= 15) 1.26 f 1.01; 1.321 167.7** [148.1;197.7l 310.3** [298;328.5] 858.6** [759.05:902.421 88.92** [76.35;97.16l 8.41** [8.21;9.311 65.03** [62.23:67.121 36.74** [35.71;37.94l 3759** [2859.6:3920.51
3 сутки (п=15) 1.37** [1.32:1.611 200.8** [187.3;245.2] 380.2** [312.3;396.4] 795.5** [720.3;866.211 92.21** [80.05;120.52] 9.33** fS.47;10.06] 67.45** [64.56;70.67] 38.09** [36.21;38.47l 3415.7** [3165:3862.71
7 сутки (п=15) 1.4** f 1.32; 1.53 ] 195.8** [183.7;231.7] 369.5** [294.08;374.8] 708.56** [592.93:816.59] 76.43* [72.43:82.86] 8.67** [7.33:9.63] 68.57** [61.53;73.15] 38.09** [36.74;39.04] 3200.1** [2632.9:3548.6]
14 сутки (п=15) 1.26 [0.95; 1.3] 112.9* [ 100; 121.5 ] 268.6* [211.3;276.8] 469.6** [423.17;578.53] 75.43 [69.73:81.02] 7.71 [6.47;8.41] 74.98** [71.98:79.03] 39.21* [37.14;39.54] 2919.9 [2196.1:3145.6]
21 сутки (п=15) 1.21 [0.93; 1.31] 89.9 [84.4;110.31 184.3 [177;197.6] 369** [348.3;412.52] 75.12 [66.94; 7 7.6] 6.44 [5.21:8.57] 79.33 [71.07:87.76] 39.02 [37.69;41.231 2873* [2108.7:3871.81
30 сутки (п=15) 1.1 f0.73; 1.351 87.5 [78.3;108.4] 178.4 [159.1:192.4] 323.65 [288.5;334.8] 71.23 [62.1:73.981 6.31 [5.51:6.73] 86.83 [80.51:88.771 40.2 [39.32:40.891 2653.6 [1887.9:2796]
Экспериментальная группа
1 сутки (п=15) 1.22 [0.85;1.331 166.1** [125.9:194.21 283.4** [236.8:347.3] 830.6** [720.3;910.371 84.15** [82.26;91.191 8.12** [7.4;9.121 64.87** [62.43;66.541 37.11** [36.46;37.921 3782.4** [3347.4;41631
3 сутки (п=15) 1.34* fl.28;1.681 204.32** [188.6;232.51 372.8** [315.35;407.6] 785.63** [702.365;876.74] 92.4** [83.75;99.8l 8.47** [7.77;9.641 66.46** [62.12;69.46l 38.44* [35.18;39.64l 3762.5** [2611.4:3959.31
7 сутки (п= 15) 1.42** fl.27;1.98l 197.1** [189.5;220.31 331.8** [299.2;382.8] 587.18**, # [499.02:641.11 73.03*. # [70.09:75.02] 7.26*, # [6.73;8.32l 70.58** [63.32:77.91 38.78** [36.46:39.21] 2742.9*, # [2489:3025.31
14 сутки (п=15) 1 # [0.89;1.14] 108.4* [88.2;119.71 198 # [188.4;213.8] 451.28** [398.2;509.1] 72.61 [71.14:82.51] 6.76 # [6.38;7.31] 82.16*, ## [80.09:84.01] 39.65 [37.87;4I.lll 2707.9* [2168.3:3372.11
21 сутки (п=15) 0.96 [0.82;1.26] 83.5 [79.5:96.6] 168.8 [145.9:208.7] 309.45 [264.56;336.85] 71.12 [61.6:74.9] 6.21 [4.87;7.43] 83.83 [82.13:86.9] 39.87 [38.61 ;41.22] 2383.7 # [1800.7:2705.5]
30 сутки (п=15) 0.93 fO.85; 1.021 80.7 [74.7:89.4] 176.4 ri64.4;182.3] 299.99 [258.71:355.521 70.62 [65.12;74.51] 6.08 [5.03;6.56] 86.96 Г84.б2;89.311 40.2 [38.92:42.131 2160.2 [1735.8:2674.11
Примечание: данные представлены в виде количества наблюдений е группе (п), медианы и интерквартилъного размаха * -р<0,05; ** -р<0,001 - относительно интактной группы; # - р<0,05; «#-р<0,001 - относитеино группы контроля
контрольной и экспериментальной групп на 1 сутки эксперимента снизились соответственно на 25% и 9,49% и 25,18% и 8,5% по сравнению с интактными показателями и были минимальными за весь период исследования. До 7 суток наблюдения показатели общего белка и альбумина в контрольной группе оставалась низкими, в последующие сутки достоверно повышались и к 30-м суткам практически достигали интактных значений. В группе № 3 с 3 суток эксперимента отмечалось плавное нарастание уровней общего белка и альбумина крови, которые достигали нативных значений на 21 - 30 сутки наблюдения. Показатели в опытной группе с 7 суток были выше значений группы контроля. Так как концентрация общего белка крови снижалась на фоне практически не измененных показателей альбуминов, можно предположить, что белок-синтезирующая функция гепатоцитов при иммобилизации практически не нарушилась, а изменение количества общего белка, вероятно, связано с активизацией катаболизма и нарушением функции почек [2, 3].
Полученные в ходе исследования данные подтверждают негативные эффекты иммобилизации [2, 3]. Острая иммобилизация приводит к выраженным изменения параметров метаболизма, характеризующихся гиперферментемией, повышением уровня общего билирубина крови при снижении концентрации общего белка, усилением процессов катаболизма, о чем свидетельствует увеличение концентрации мочевины и кре-атинина в крови. Исследование показало, что применение МСК способствовало более быстрому восстановлению функционального состояния тканей животных опытной группы по сравнению с группой контроля, что свидетельствует об активации репаративных процессов под действием МСК. Это объясняется пара-кринным влиянием секретируемых МСК цитокинов с противовоспалительным и антиапоптотическим действием, подавлением продукции активных форм кислорода, уменьшением генерации оксида азота [4, 5]. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований использования клеточной терапии для лечения состояний, главным патогенетическим звеном которых является ишемия.
Выводы:
1. Острая иммобилизация приводит к ухудшению функционального состояния организма, проявляющееся гиперферментемией, повышением уровня общего билирубина при снижении концентрации общего белка, увеличение концентрации мочевины и креати-нина в сывотротке крови. Показатели констант крови зависят от длительности постиммобилизационного периода. быстрее восстанавливается после введения МСК.
2. Применение мезенхимальных стволовых клеток способствовало более быстрому восстановлению биохимических показателей крови, а, следовательно, и функционального состояния тканей животных опытной группы по сравнению с группой контроля.
3. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований использования клеточной терапии для лечения состояний, главным патогенетическим звеном которых является ишемия.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Кузьменко Е.В. Современные представления о проявлениях механизмов психоэмоционального стресса // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, Серия «Биология, химия». - 2013. - Том 26 (65), № 2. - С. 95 - 106.
[2] Бугаева В.Ф., Киричук, А.Н. Иванов И.О. Влияние электромагнитного излучения терагерцового диапазона частотой молекулярного спектра оксида азота 150+0,75 ггц на морфофункциональные нарушения микроциркуляции у белых крыс в состоянии острого и длительного стресса // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2009. - Том 5, № 4. - С. 511 - 516.
[3] Греков Е.А., Кирпатовский В.И., Голованов С.А., Дрожжева В.В., Казаченко А.В. Оценка влияния метаболического синдрома, андрогенного дефицита и стресса на развитие хронической болезни почек и печени у самцов белых крыс // Экспериментальная и клиническая урология. - 2012. - № 4. - С. 8 - 13.
[4] Гринь В.К. Применение аутологичных мезенхималь-ных стволовых клеток в кардиологии и травматологии // Журнал НАМН Украины. - 2011. - Т. 17, № 1. - С. 67-75.
[5] Кирпатовский В.И. Возможности клеточной терапии в восстановлении нарушенной функции органов мочеполовой системы // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. - 2016. - № 1 (56). - С. 60 - 67.
DYNAMICS OF THE BASIC BIOCHEMICAL INDICATORS OF THE RAT BLOOD SERUM IN AN ACUTE IMMOBILIZATIONAL STRESS AFTER THE USE
OF MESENCHIMAL STEM CELLS
Demyanenko E.V.
Lugan State Medical University Named After Sunshine Luke, Lugansk, Ukraine
Annotation. The article deals with the problems of acute immobilization stress on the main biochemical parameters of blood serum and the patterns of their recovery after the introduction of mesenchymal stem cells. The aim of the work was to demonstrate the effectiveness of the use of mesenchymal stem cells for the correction of conditions, the main pathogenetic link of which is ischemia.
It has been experimentally established that acute immobilization leads to pronounced changes in the parameters of metabolism, enhancement of catabolism. This manifests itself by increasing the level of enzymes, increasing the concentration of bilirubin, urea and creatinine, reducing the concentration of total protein in the blood serum. This is due to the fact that ischemic changes in tissues activate free-radical processes, which causes a violation of the functional and structural integrity of the membranes. It was shown that the values of biochemical parameters of blood depend on the duration of the postimmobilization period. The study found that in the group of animals that received cellular therapy, the recovery of biochemical parameters of blood serum occurred in a shorter time than in the animals of the control group. This may indicate the activation of repair processes in the tissues of internal organs. The obtained results testify to the prospects of further studies of the use of mesenchymal stem cells for the treatment of various pathological conditions. Key words: biochemical indicators, ischemia, immobilization stress, mesenchymal stem cells.
REFERENCES
[1] Kuz'menko E.V. Sovremennye predstavlenija o projavleni-jah mehanizmov psihojemocional'nogo stressa // Uchenye zapiski Tavricheskogo nacional'nogo universiteta im. V.I. Vernadskogo, Serija «Biologija, himija». - 2013. - Tom 26 (65), № 2. - p. 95 - 106.
[2] Bugaeva V.F. Kirichuk, A.N. Ivanov I.O. Vlijanie jelektro-magnitnogo izluchenija teragercovogo diapazona chastotoj molekuljarnogo spektra oksida azota 150+0,75 ggc na mor-fofunkcional'nye narushenija mikrocirkuljacii u belyh krys v sostojanii ostrogo i dlitel'nogo stressa // Saratovskij nauchno-medicinskij zhurnal. - 2009. - Tom 5, № 4. - p. 511 - 516.
[3] Grekov E.A., Kirpatovskij V.I., Golovanov S.A., Drozh-zheva V.V., Kazachenko A.V. Ocenka vlijanija metaboli-cheskogo sindroma, androgennogo deficita i stressa na razvitie hronicheskoj bolezni pochek i pecheni u samcov belyh krys // Jeksperimental'naja i klinicheskaja urologija. - 2012. - № 4. - p. 8 - 13.
[4] Grin' V. K. Primenenie autologichnyh mezenhimal'nyh stvolovyh kletok v kardiologii i travmatologii // Zhurnal NAMN Ukrainy. - 2011. - T. 17, № 1. - p. 67-75.
[5] Kirpatovskij V.I. Vozmozhnosti kletochnoj terapii v voss-tanovlenii narushennoj funkcii organov mochepolovoj sis-temy // Voprosy rekonstruktivnoj i plasticheskoj hirurgii. -2016. - № 1 (56). - p. 60 - 67.
