CC BY
59
ДИНАМИКА МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ЭРИТРОЦИТОВ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КОНСЕРВИРОВАННОЙ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ В РАЗЛИЧНЫЕ СРОКИ ХРАНЕНИЯ
В. В. Мороз1, А. М. Голубев1, Е. К. Козлова1, А. В. Афанасьев1, О. Е. Гудкова1, И. С. Новодержкина1, Ю. В. Марченков1,2, А. Н. Кузовлев1, Ю. В. Заржецкий1, А. И. Костин2, Д. П. Волков1, В. Н. Яковлев2,
1 НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского РАМН, Москва 2 Городская клиническая больница им. С. П. Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы
Time Course of Morphological Changes in Red Blood Cells and Stored Whole Blood Biochemical Parameters in Different Storage Periods
V. V. Moroz1, A. M. Golubev1, E. K. Kozlova1, A. V. Afanasyev1, O. E. Gudkova1, I. S. Novoderzhkina1, Yu. V. Marchenkov12, A. N. Kuzovlev1, Yu. V. Zarzhetsky1, A. I. Kostin2, D. P. Volkov1, V. N. Yakovlev2
1 V. A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow 2 S.P. Botkin City Clinical Hospital, Moscow Healthcare Department
Цель работы: изучение закономерностей биохимических изменений крови, динамики пойкилоцитоза и нарушений ультраструктуры мембран эритроцитов цельной крови, консервированной в ЦФДА-1 (CPDA-1), в процессе длительного хранения. Материал и методы. Исследовалась цельная кровь, полученная от 5 доноров в возрасте 25±3 лет разного пола, хранившаяся при +2...+4°С. На 1-е, 7-е, 14-е, 21-е и 30-е сутки хранения оценивали морфологический состав популяции эритроцитов в монослойных мазках крови — 1000 клеток на мазок при использовании микроскопа Olympus BX-500, компьютера и программы ImageScopeM. Поверхность мембран эритроцитов анализировали с помощью атомного силового микроскопа (АСМ): «IntegraPrima» NT — MDT. Биохимический состав крови исследовали с помощью анализатора: «i-stat 1® analyzer M: 300». Статистическую обработку производили с использованием программы STATISTICA 7. Результаты. Выявлено изменение биохимического состава цельной крови уже в первые сутки хранения. а именно: достоверно уменьшается гематокрит, содержание гемоглобина, ионов натрия и кальция, существенно увеличивается концентрация глюкозы (до 700 мг/дл). Морфологические изменения эритроцитов наблюдаются через 3-е суток. К 21 суткам число дискоцитов в крови составляет 31,3±3,27% (р<0,0001) относительно контроля (первых суток). Через 30 суток хранения обнаруживается более 80% измененных эритроцитов, среди которых преобладают эхиноциты (79,6±2,74%, p<0,0001). Исследования с использованием АСМ проиллюстрировали, что по мере хранения наноструктура мембран эритроцитов существенно изменяется: появляются локальные повреждения (выросты различных размеров), трансформируемые в крупные спикулы. Заключение. Проведенные исследования биохимических показателей крови, морфологических характеристик эритроцитов и их мембран свидетельствуют о развитии изменений, начиная с первых суток хранения крови. Полученные данные представляются существенными для разработки новых способов консервации крови и ее компонентов. Ключевые слова: кровь, эритроциты, ЦФДА-1.
Objective: to reveal the patterns of blood biochemical changes, a trend in poikylocytosis, and impairment in the ultrastructure of red blood cells of the whole blood stored in citrate-phosphate-dextrose-adenine-1 during long-term storage. Material and methods. The whole blood that had been obtained from 5 donors aged 25±3 years of different sexes and stored at +2 to +4^ was examined. On storage days 1, 7, 14, 21, and 30, the morphological composition of a red blood cell population was assessed in monolayer blood smears (1000 cells per smear), by using an Olympus BX-500 microscope, computer, and ImageScopeM program. The surface of the red blood cell membranes was analyzed using an IntegraPrima NT-MDT atomic force microscope (AFM). Blood biochemical composition was examined using an i-stat 1® analyzer M: 300. Statistical processing was made with a STATISTICA 7 program. Results. A change in the biochemical composition of the whole blood was revealed within just the first 24 hours of storage. Morphological changes were observed in the red blood cells 3 days later. At 21 days, discocytes were 31.3±3.27% as compared to the control (in the first 24 hours) (p<0.0001). After 30 days of storage, altered red blood cells amounted to more than 80%, among them echinocytes prevailed as compared to the control (79.6±2.74%; p<0.0001). The examinations using AFM illustrated that the nanostructure of the red blood cell membranes tangibly changed with storage, they showed local lesions (excrescences of different sizes) growing into large spicules. Conclusion. The performed studies of the biochemical parameters of the blood, the morphological characteristics of the red blood cells and their membranes suggest that their changes evolved in just the first 24 hours of blood storage. The findings are essential for the development of new methods for storing blood and its components. Key words: blood, red blood cells, citrate-phosphate-dextrose-adenine-1.
Адрес для корреспонденции (Correspondence to):
Голубев Аркадий Михайлович (Golubev A. M.) E-mail: [email protected]
В настоящее время при лечении больных используются донорская кровь и компоненты донорской крови, которые помогают восполнить утраченные при кро-вопотере форменные элементы и объем циркулирующей крови (ОЦК). Чаще пользуются различными эритро-цитсодержащими компонентами донорской крови и свежезамороженной плазмой. В рекомендациях ВОЗ от 2001 года переливание цельной крови рекомендовано в случаях острой кровопотери при отсутствии эритроцит-ной массы и других кровезаменителей [1]. Применение консервированной донорской крови отражено в последних обновлениях российского законодательства и постановлениях правительства: «донорская кровь — кровь, взятая от донора и предназначенная для клинического использования, производства компонентов крови, лекарственных средств и медицинских изделий, а также для использования в научно-исследовательских и образовательных целях» [2, 3].
Цельная кровь является непременным элементом в последних изданиях руководств по службе крови за рубежом (табл. 1) [4].
За последние 10—12 лет имеются лишь единичные исследования консервированной донорской и ауто-крови при ее длительном хранении [5—7].
Гемотрансфузия цельной крови в 2010 году составила 0,07% от общего объема донорской крови, что составило 1:181 трансфузий цельной крови к трансфузии эритроцитной массы и другим компонентам [8]. Прямое переливание крови, или так называемое переливание свежей донорской крови (РШБ), часто используется в армии США и в армиях стран НАТО [9].
Хранение консервированной цельной донорской крови сопровождается морфофункциональными изменениями форменных элементов крови. Ключевая роль в формировании реологических параметров крови принадлежит эритроцитам, поскольку они составляют 98% от общего объема клеточной популяции [10, 11]. От состояния мембран эритроцитов и от возможности коррекции ее состояния, зависит уровень микроциркуляции в органах и тканях [12—13]. Значительные изменения, которые впоследствии прогрессируют, регистрируются на 14-е сутки хранения [15], нарушается функциональное состояние мембран клеток [16, 17].
При внедрении новых полимерных материалов и консервантов, должно проводиться расширенное изучение их влияния на приготовление и/или хранение эри-тросодержащих компонентов крови. Полезно рассмотрение следующих параметров:
• глюкоза, pH, гематокрит, гемолиз, АТФ, лак-тат, внеклеточный калий и 2,3-бифосфоглицерат [4].
Материал и методы
Исследовалась цельная кровь, полученная от пяти доноров в возрасте 25±3,5 лет, консервированная в ЦФДА-1 (CPDA-1). В 100 мл раствора ЦФДА-1 содержится: лимонной кислоты моногидрата 0,327 г, натрия цитрата дигидрата 2,63 г, натрия фосфата одноосновного моногидрата 0,222 г, декстрозы моногидрата 3,19 г и аденина 0,0275 г. [18]. Соотношение раствора гемоконсерванта ЦФДА-1 составляет 14 мл на 100 мл цельной крови. Допустимая длительность хранения крови и ее компонентов в данном консерванте составляет 35 дней [4].
Монослойные мазки крови, взятые на 1, 7, 14, 21 и 30 сутки хранения, были изготовленны с помощью «V-sampler, Vision Mycroscopy». Оценивалась морфология эритроцитов [19, 20]. Проводился подсчет по 12 полям зрения (не менее 1000 клеток на каждый мазок). При проведении микроскопии использовалась система анализа изображений, включающая в себя: микроскоп Olympus BX-500, компьютер Intel Pentium-2 и программу ImadgeScopeM. Кровь хранилась при температуре +2...+4°С. Перед изготовлением мазков пробы крови в течение часа согревали при комнатной температуре [21]. Биохимический состав крови исследовался с помощью портативного клинического анализатора «i-stat 1® Analyzer M: 300» со сменными картриджами. Статистическая обработка данных проводилась стандартными статистическими методами с использованием компьютерной программы STATISTICA 7.
Мембрана эритроцитов была исследована с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) «IntegraPrima» фирмы NT — MDT(РФ). Сканирование проводили в поле 100x100 мкм, размер фрагмента — 1500x1500 нм. Сканирование осуществляли в полуконтактном режиме (1024 точек сканирования, кантилевером NSG 01 с радиусом зонда 10 нм).
Результаты и обсуждение
В мазках крови, приготовленных через сутки после взятия крови, число дискоцитов составило 96,43±0,53%, эхиноцитов — 2,91±0,40%, элиптоцитов (овалоцитов) — 0,41±0,19%, сфероцитов — 0,01±0,22%, дакриоцитов -0,19±0,11% и пузырчатых эритроцитов — 0,05±0,04% (рис. 1). Полученные данные свидетельствуют о незначительно выраженном пойкилоцитозе в первые сутки хранения.
Через 7 сут. хранения цельной крови усиливается пойкилоцитоз, содержание эхиноцитов возрастает до 28,4±2,52% (р<0,0001), овалоцитов -0,8±0,31% (р<0,05) и сфероцитов — до 2,8±0,55% (р<0,0001) относительно 1-х суток. Число эритроцитов с признаками пойкило-
Таблица 1
Критерии качества для некоторых трансфузионных сред [4]
Параметр
Консервированная кровь
Эритроцитная масса
Эритроцитная масса с удаленным ЛТС
Гематокрит
Остаточные лейкоциты в дозе Гемоглобин
Гемолиз эритроцитов в конце хранения Объем
Минимум 45 г/доза <0,8% 450±50 мл объем без антикоагулянта
0,65—0,75
Минимум 45 г/доза <0,8% 280±50 мл
0,65—0,75 <1,2x109 Минимум 43 г/доза <0,8% 250±50 мл
Примечание. ЛТС — лейкотромбоцитарный слой.
Рис. 1. 1-е сутки хранения крови. Неокрашенный мазок цельной крови. Х1000.
1 — дискоцит; 2 — эхиноцит; 3 — элиптоцит (овалоцит).
Рис. 2. 7-е сутки хранения крови. Неокрашенный мазок цельной крови. Х1000.
1 — дискоцит; 2 — эхиноцит; 3 — дакриоцит.
цитоза составляет 32,6±5,22% (р<0,0001) относительно контроля (рис. 2).
По сравнению с первыми сутками, на 14-15 сут. хранения количество дискоцитов уменьшилось и составило 58,40±0,32% (р<0,0001), возросло число эхиноцитов — 34,1±1,07% (р<0,0001), сфероцитов - 5,2±1,02% (р<0,0001), дакриоцитов -0,4±0,15% (р<0,0001) и пузырчатых эритроцитов 0,1±0,02%, ^<0,0001 (рис. 3).
АСМ проиллюстрировала, что на 15 день хранения крови количество дискоцитов уменьшилось, клетки стали приобретать форму сфероци-тов, на поверхности их мембран начинают формироваться
Рис. 3. 14-е сутки хранения крови. Неокрашенный мазок цельной крови. Х1000.
1 — дискоцит; 2 — эхиноцит; 3 — дакриоцит.
выросты различных размеров. Эти выросты показаны на рис. 4.
В мазках крови на 21 сутки хранения наблюдается ярко выраженный эхиноцитоз (59,7±3,83%, р<0,0001). Сфероциты составили 6,6±0,59%, (р<0,0001) по сравнению с 1-ми сутками. Число дискоцитов в крови менее 50%: 31,3±3,27% (р<0,0001), общее число морфологически измененных эритроцитов составляет 68,8±3,27% (р<0,0001) по сравнению с контролем (табл. 2, рис. 5). На этом сроке хранения крови АСМ показывает, что изменения на поверхности мембран эритроцитов возрастают. Развитие этого процесса приводит к формированию эхиноцитов.
На 30 сутки хранения в крови большая часть эритроцитов представлена эхиноцитами (79,6±2,74%, р<0,0001) и сфероцитами 7,6±2,24%, (р<0,0001) по сравнению с контролем. Дискоциты составляют
Рис. 4. 15-е сутки хранения крови, АСМ: эхиноцит (а) и его фрагменты (б).
Стрелки указывают места локализации измененных фрагментов клетки. Примечание. Здесь и на рис. 6, 8: АСМ — атомно-силовая микроскопия.
Таблица 2
Морфологическая характеристика эритроцитов (пойкилоцитоз) на разных сроках хранения крови (M±m) Морфологические формы эритроцитов (и) Процент эритроцитов на разных сроках хранения, сутки
1-е 7-е 14-е 21-ё 30-е
Дискоциты (%) Эхиноциты (%) Овалоциты (элиптоциты) (%) Сфероциты (%) Дакриоциты (%) Пузырчатые (%) Стоматоциты (%) Дегмациты (надкусан.) (%) Дрепаноциты (серп.) в % Шистоциты (%)
Морфологически измененных клеток (всего), в %
96,4±0,53 2,9±0,40 0,4±0,19 0,01±0,22 0,2±0,11 0,05±0,04
3,6±0,53
67,5±2,33* 58,4±0,32* 31,3±3,27* 11,9±1,50*
28,4±2,52* 34,1±1,07* 59,8±3,83* 79,6±2,74*
0,8±0,31** 1,8±0,85# 1,6±0,41# 0,5±0,20**
2,8±0,55* 5,2±1,02* 6,6±0,59* 7,6±2,24*
0,6±0,24* 0,4±0,15* 0,7±0,20* 0,4±0,28*
0,01 0,06±0,02* — 0,01
0,01 — 0,01
0,03 0,02
0,01 — — 0,01
32,6±5,22* 41,6±0,32* 68,8±3,27* 88,1±1,50*
Примечание. * — р<0,0001 относительно 1-х суток; ** — р<0,05 относительно 1-х суток; # — р>0,05 относительно 1-х суток.
Рис. 5. 21-е сутки хранения крови. Неокрашенный мазок цельной крови. Х1000.
1 — дискоцит; 2 — эхиноцит; 3 — сфероцит.
Рис. 6. 21-е сутки хранения, АСМ: эхиноцит (а) и его увеличенный фрагмент (б).
Стрелка указывает локализацию фрагмента на клетке.
Рис. 7. 30-е сутки хранения, неокрашенный мазок цельной крови Х1000.
1 — дискоцит; 2 — эхиноцит; 3 — сфероцит.
11,9±1,50%, (р<0,0001), содержание измененных клеток 88,1±1,50%, (р<0,0001) по сравнению с показателями крови в 1 сутки хранения (рис. 7). К 30 дню хранения цельной крови большая часть эритроцитов представлена сфероэхиноцитами (рис. 7).
Бихимические показатели. pH крови при ее хранении снижается. На 7-е сутки наблюдения pH составил 6,7±0,05 (р<0,05), через 14 суток -6,6±0,05 (р<0,05) и на 21 сутки — 6,5±0,01 (р<0,05), соответственно. К 30 суткам рН равен 6,4±0,01 (р<0,05) (табл. 3).
В крови уже в первые сутки имело отрицательное значение -27,3±1,000 ммоль/л (р<0,05). И в дальнейшем снизилось до -30,0 (р<0,05).
Параметры качества при длительном хранении цельной крови
Таблица 3
Показатели, ед. измерения
Значение показателей на этапах хранения крови, сутки
физиологические 1-е константы крови (собств. данные) 7-10-е 12-14-е 19-21-е 30-33-е
рН 7,35—7,45 6,605—6,871* 6,602—6,833* 6,500—6,759* 6,500—6,577* 6,459—6,500
Be(кислотное основание ) ммоль/л 1—2,0 -27—(-30)* -25—(30)* -30* -30* -30*
Ht (гематокрит), % 36—48 18—27* 17—27* 12—22* 10—25* 10—21*
Hb (гемоглобин), г/дл 13—18 6,1—9,5* 5,8—8,5* 6,8—8,8* 4,1—7,8* 5,1—6,8*
Glu (глюкоза), мг/дл 65—164 672—700* 398—700* 323—700* 352—619* 392—483*
Na, ммоль/л 143—163 133—140* 107—140* 125—128* 124—130* 116—128*
K, ммоль/л 3,2—5,77 3,0—3,60** 4,7—6,3** 5,7—8,4** 7,2—9,0* 9,0*
Ca, ммоль/л 2,15—2,25 <0,25* <0,25* <0,25* <0,25* <0,25*
Примечание. * — р<0,05 относительно физиологических констант крови (собств. данные); ** — разница недостоверна.
Содержание глюкозы в первые сутки составило 21 суткам -126,7±1,76 ммоль/л (р<0,05). В конце пери-
690,7±9,33 мг/дл (р<0,05), что в 5 раз больше верхней ода наблюдения концентрация ионов натрия составила
физиологической границы (65—164 мг/дл). В течение 122,0±1,98 ммоль/л (р<0,05).
всего периода хранения крови содержание глюкозы Содержание ионов калия в первые сутки состави-
снижалось: через 7 суток — 565,6±59,74 мг/дл (р<0,05), ло 3,4±0,19 ммоль/л (р<0,05). В течение всего периода
после 14 суток — 527,0±63,60 мг/дл (р<0,05), 21 сутки наблюдения его уровень продолжал возрастать. К 7
— 495,4±46,54 мг/дл (р<0,05) и к 30-м суткам содержание глюкозы составило 446,7±27,82 мг/дл (р<0,05).
Количество ионов натрия в первые сутки составило 135,7±2,19 ммоль/л, р<0,05 и в течение 30 суток неуклонно снижалось. После 7 суток хранения крови со-
суткам содержание К+ достигло 5,7±0,284 ммоль/л (р<0,05), на 14 сутки — 6,9±0,55 ммоль/л (р<0,05). После 21 суток хранения цельной крови его содержание было равно 8,3±0,34 ммоль/л (р<0,05), а к 30 суткам >9,00 ммоль/л (р<0,05), соответственно. Повышение
держание ионов натрия составило 127,6±5,91 ммоль/л содержания уровня калия в цельной крови свидетельст-(р<0,05), на 14 сутки — 126,3±0,88 ммоль/л (р<0,05), к вует о том, что калий покидает поврежденные клетки и
поступает в плазму, где регистрируется его повышенное содержание. Этот процесс свиде-тельствовует о нарушении функционирования нитрий-калиевого насоса и приводит к деполяризации мембраны эритроцитов.
Снизилось содержание общего белка. Через сутки хранения крови содержание общего белка составило 5,9±0,36 г/дл, на 14 сутки — 4,9±0,27 г/дл, на 30 сутки — 3,9±0,37 г/дл.
Подходы к защите эритроцитов. Используемые при заготовке крови растворы антикоагулянтов были разработаны для предотвра-щення ее свертывания и хранения эритроцитов в течение
Рис. 8. 30-е сутки хранения цельной крови. АСМ: сфероэхиноцит (а), его фрагмент (б). тт
^ ¿г г 1-1- 1-1- V/ определенного периода. На-
Стрелка указывает локализацию фрагмента на клетке.
ряду с первоначальным назначением данных растворов — для хранения цельной крови, они также используются и для крови, из которой готовят компоненты. Все растворы содержат цитрат натрия, лимонную кислоту и глюкозу, некоторые из них могут также содержать аденин, гуанозин и фосфат. Цитрат связывает кальций, предотвращая свертывание крови. Глюкоза необходима эритроцитам для поддержания их жизнеспособности в процессе хранения. Каждая молекула глюкозы дает две молекулы аденозинтрифосфата (АТФ), путем фосфорилирования аденозиндифосфа-та (АДФ). Высокоэнергетичные молекулы АТФ используются для поддержания энергоемких функций эритроцитов, таких как эластичность мембран и ряд мембрано-транспортных функций. В ходе потребляю-ших энергию действий АТФ вновь превращается в АДФ. Лимонная кислота добавляется к антикоагулянту для обеспечения требуемой концентрации ионов водорода, которая должна быть высока в начале хранения при +4°С. Без добавления лимонной кислоты кровь при температуре хранения стала бы чрезмерно щелочной. Во время хранения происходит увеличение кислотности, что уменьшает процесс гликолиза. Содержание аденозиновых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) во время хранения уменьшается. При добавлении аденина — главного компонента аденозиновых нуклеотидов — эритроциты могут синтезировать новые АМФ, АДФ и АТФ и компенсировать (или уменьшать) их потерю. При приготовлении концентратов эритроцитов вместе с плазмой удаляется значительная часть глюкозы и аденина. Если их потерю не компенсировать другими способами (например, добавлением избытка аденина и глюкозы к антикоагулянту или с помощью отдельной добавки к среде «взвесь/консервант»), достаточная жизнеспособность эритроцитов может поддерживаться только при условии, если они не сверх концентрированы. Нормальный эритроцитный концентрат с ЦФД-аденином должен иметь среднюю величину гематокрита (Hct) не выше 0,70. Это обеспечивает вязкость достаточно низкую для переливания и не требует предварительного разведения концентрата (Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation N.R (95) 15, 16th edition. // Council of Europe, 2010).
Согласно классификации Bessis M. (1974) O'Conner В. Н. (1984). [19, 20], выделяют следующие варианты изменений эритроцитов: анизоцитоз (состояние, при котором наблюдаются различия в диаметре эритроцитов), анизохромия (изменение окраски эритроцита), наличие включений в эритроцитах (тельца Жолли-Хауэлла, Сидеросомы, кольца Кебота) и пойки-лоцитоз (изменение формы эритроцитов). Пойкилоци-тоз характеризуется появлением различных форм эритроцитов: эхиноцитов, сфероцитов, овалоцитов (эллиптоцитов), дакриоцитов, шизоцитов (шистоци-тов), акантоцитов, дрепаноцитов, дегмацитов, стомато-цитов, пузырчатых клеток.
В крови здорового человека в незначительном количестве постоянно присутствуют эритроциты с теми или иными признаками пойкилоцитоза, которые впоследствии разрушаются, их заменяют нормоциты, вырабатывающиеся в организме при эритропоэзе.
Количество морфологически измененных эритроцитов (стоматоциты, эхиноциты, шизоциты) увеличивается при физической нагрузке, в условиях гипоксе-мии [21]. Морфологические изменения эритроцитов с нарушением структуры мембраны эритроцитов обусловлены гипоксией, кровопотерей при травмах и операционных вмешательствах [12, 15].
Эхиноциты образуются при воздействии (in vivo и in vitro) токсических веществ (в том числе и бактериальных), радиации, а также в донорской крови при длительном хранении [23]. Различают эхиноциты I, II, III классов и сфероэхиноциты I и II класса трансформации. При «старении» эритроцит последовательно проходит этапы преобразования в эхиноцит III класса трансформации, теряет способность изменять и восстанавливать свою форму, превращается в сфероэхиноцит (I, II класс) и разрушается [24]. Эхиноциты увеличивают скорость и частоту образования агрегатов. Эти агрегаты имеют более прочную структуру, чем агрегаты, образованные из дискоцитов [25]. Наличие агрегатов в капиллярах приводит к ухудшению оксигенации тканей, приводит к нарушению гемоциркуляции органов и тканей [26].
При осуществлении трансфузии крови, которая содержит значительное количество измененных эритроцитов, не наблюдается положительного эффекта и развиваются различные осложнения. Расчеты Schmid-Schonbien H. (1982) показали, что жесткие, ригидные эритроциты — сфероциты неспособны проникать через капилляры и не участвуют в газообмене [27]. Эксперименты на животных с острой умеренной нормоволемической гемодилюцией свидетельствовали об уменьшении плотности функционирующих капилляров и снижении уровня тканевого кислорода (pO2) в группе, где проводилась трансфузия «жестких» эритроцитов [28].
Выявлено, что обменное переливание цельной крови положительно сказывается на состоянии больных серповидной анемией. В частности, непосредственно после переливания крови у больных происходит улучшение микроциркуляции крови в коньюктиве глаз, в то время как у больных серповидной клеточной анемией, не прошедших гемо-трансфузионную терапию, наблюдаются серьезные нарушения микроциркуляции [29]. Переливание свежей эритроцитной массы (консервированной в ЦФДА-1), повышает выживаемость крыс с острым инфарктом миокарда, вызванным перевязкой левой нисходящей коронарной артерии [30].
В то же время трансфузия цельной крови и ее компонентов длительно хранившихся, содержащих значительное число морфологически измененных эритроцитов, способствует возникновению микроциркуляци-
онных нарушений, уменьшению кровоснабжения органов и тканей и усилению гипоксии тканей.
Изменение биохимических показателей обусловлено в определенной степени консервантом. Снижение уровня содержания глюкозы вызывает снижение уровня АТФ в клетке, которая синтезируется в клетке из глюкозы путем гликолиза, что приводит к нарушению метаболизма, нарушаются механизмы транспорта ионов через клеточные мембраны [31], повреждается натрий-калиевый насос. Однако роль АТФ в процессе изменения структуры мембраны клетки до конца не изучена. Исследования Wong P. (2011) доказывают, что изменения структуры клеточной мембраны эритроцита начинаются при нарушении соотношений между белками Band 3 (о) и Band 3 (I) и минимальном влиянии на процесс морфологических изменений снижения концентрации АТФ в клетке [32]. При длительном хранении консервированной цельной крови происходит изменение соотношения Na/K в клетке и межклеточном веществе. Однако при температуре +2...+4°С, при которой хранят кровь, уменьшается выход ионов К и поступление ионов Na в клетку [33].
Снижение уровня кальция может свидетельствовать о его проникновении из плазмы в клетки. Однако полученные данные требуют дополнительной проверки. Следствием нарушения ионного обмена, а именно, усиления поступления ионов натрия и кальция в клетку и увеличения внеклеточной концентрации ионов калия является стойкая продолжительная деполяризация мембраны клетки, в результате чего запускаются механизмы, ведущие к гибели клетки [34].
Наиболее вероятными причинами снижения гемоглобина и количества эритроцитов в нашем исследовании могло быть образование большого количества микросгустков и частичный гемолиз эритроцитов.
Такое снижение Рн закономерно при хранении цельной крови и возможно усиливается параллельно протекающим метаболизмом и разрушением тромбоцитов в трансфузионной среде.
Литература
1. The clinical use of blood: handbook. Geneva: World Health Organization, Blood transfusion safety; 2001: 219.
2. Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии. Постановление Правительства РФ №29 от 26 января 2010 г.
3. О донорстве крови и ее компонентов. Федеральный закон Российской Федерации №125-ФЗ от 20 июля 2012 г.
4. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation N.R (95) 15. 16th edition. Council of Europe, 2010.
5. Краснокутский Ю. А, Копченко Т. Г. Аутогемотрансфузия как альтернатива донорской крови в плановой хирургии. Мед. вестн. Северного Кавказа. 2007; 8 (4): 14—17.
6. Лаптев В. В, Селиванов Е. А. Значение микроагрегатов донорской крови и ее компонентов в развитии посттрансфузионных осложнений и возможные способы их профилактики. Вестн. службы крови России. 2010; 1: 47—54.
7. Фирсов Н. Н, Сирко И. В., Приезжев А. В. Современные проблемы агрегатометрии цельной крови. Тромбоз, гемостаз, реология. 2000; 2 (2): 9—11.
8. Селиванов Е. А, Бессмельцев С. С., Дуткевич И. Г., Данилова И. Г., Лаврова В. А, Чечеткин А. В, Красняков В. К, Щелкунова Л. В, Дег-терева И. Н., Григорьян М. Ш. Современные проблемы донорства в Российской Федерации. Вестн. службы крови России. 2011; 1: 5—14.
Заключение
• При хранении цельной крови в среде ЦФДА-1 при температуре +4° С в течении 30 дней происходят прогрессирующие изменения, которые проявляются увеличением числа морфологически измененных эритроцитов и изменением биохимического состава крови.
• В первые сутки хранения цельной консервированной крови морфологические изменения незначительны.
• Начиная с седьмых суток увеличивается число морфологически измененных эритроцитов, в первую очередь — эхиноцитов. К 14-м суткам возрастает число сфероцитов. Атомно-силовая микроскопия подтверждает усиление сфероцитоза на 21 сутки. В крови большая часть эритроцитов (около 70%) преобразуется в эхиноциты и сфероциты, на долю прочих морфологически измененных эритроцитов приходится около 3% клеток. На фоне прогрессирования морфологических изменений изменяется биохимический состав — нарушается баланс натрия и калия, снижается содержание глюкозы, увеличивается содержания ионов калия в цельной крови.
• Через 30 суток хранения цельной консервированной крови в мазках более 80% измененных эритроцитов — эхиноциты. Обнаруживается большое число (7,6±2,24%) сфероцитов. АСМ выявляет изменения мембран эритроцитов цельной крови на 30 сутки хранения цельной крови. В цельной крови значительно уменьшается содержание глюкозы, содержание ионов натрия; снижается гематокрит и резко возрастает содержание ионов калия.
Выявленные изменения диктуют необходимость дальнейших исследований по усовершенствованию способов консервации эритроцитсодержащих компонентов крови для сохранения структуры и функциональных свойств эритроцитов.
9. Spinella P. C, Strandenes G., Rein E. B., SeghatchianJ, Hervig T. Symposium on fresh whole blood for severe hemorrhagic shock: from in-hospital to far forward resuscitations. Transfus. Apher. Sci. 2012; 46 (1): И3—И7.
10. Зинчук В. В. Кислородосвязвтающие свойства крови: фундаментальные и прикладные успехи. Вестник Тверского государственного университета. Серия: Биология и экология. 2010; 17 (16): 7—15.
11. Мороз В. В., Голубев А. М., Афанасьев А. В, Кузовлев А. Н., Сергуно-ва В. А, Гудкова О. Е., Черныш А. М. Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях (обзор). Общая реаниматология. 2012; 8 (1): 53—61.
12. Мороз В. В., Кирсанова А. К., Новодержкина И. С, Александрин В. В, Назарова Г. А. Мембранопротекторное действие перфторана на эритроциты при острой кровопотере. Общая реаниматология. 2011; 7 (1): 5—10.
13. Герасимов Л. В., Карпун Н. А., Пирожкова О. С. Избранные вопросы патогенеза и интенсивного лечения тяжелой сочетанной травмы. Общая реаниматология. 2012; 8 (4): 111 — 117.
14. Герасимов Л. В., Саморуков В. Ю., Мороз В. В., Иванова Г. П. Применение эритропоэтина у больных с травмой и кровопотерей. Общая реаниматология. 2012; 8 (5): 11 — 18.
15. Berezina T. L., Zaets S. B., Morgan C., Spillert C. R., Kamiyama M., Spolarics Z., Deitch E. A, Machiedo G. W. Influence of storage on red blood cell rheological properties. J. Surg. Res. 2002; 102 (1): 6—12.
16. Мороз В. В., Черныш А. М, Козлова Е. К., Сергунова В. А, Гудкова О. Е., Федорова М. С, Кирсанова А. К., Новодержкина И. С. Нарушение на-
ноструктуры мембран эритроцитов при острой кровопотере и их коррекция перфторуглеродной эмульсией. Общая реаниматология. 2011; 7 (2): 5-9.
17. Мороз В. В., Голубев А. М., Черныш А. М., Козлова Е. К., Васильев В. Ю., Гудкова О. Е., Сергунова В. А., Федорова М. С. Изменения структуры поверхности мембран эритроцитов при длительном хранении донорской крови. Общая реаниматология. 2012; 8 (1): 5—12.
18. Коденев А. Т., Ващенко Г. А., Капустов В. И., Жибурт Е. Б. Качество эритроцитов, криоконсервированных при умеренно низких температурах. Вестн. службы крови России. 2010; 1: 23—27.
19. Bessis M. Atlas of red blood cell Shapes. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag; 1974: 21 — 101.
20. O'Coner В. Н. A color atlas and instruction manual of peripheral blood cell morphology. Baltimor, USA; 1984: 316.
21. Рагимов А. А., Соловьева И. Н. Экстракорпоральные методы в транс-фузиологии. Клин. меедицина. 2005; 83 (4): 4—8.
22. Connes P., Boucher :J. H. Echinocytosis in athletes with exercise-induced hypoxemia. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2010; 44 (2): 107—114.
23. Кидалов В. Н, Сясин Н. И., Хадарцев А. А. К вопросу о физиологической значимости изменений формы, ультраструктуры и флуоресценции эритроцтовпереферической крови, трансформирующихся в эхиноциты. Вестн. новых мед. технологий. 2005; 12 (2): 6—9.
24. Козинец Г. И., Шишканова З. Г., Сарычева Т. Г. Клетки крови и костного мозга: атлас. М.: Медицинское информационное агентство; 2004: 203.
25. Berling C., Lacombe C., Lelrnvre J. C., Allary M., Saint-BlancardJ. The RBC morphological dependence of the RBC disaggregability. Biorheology. 1988; 25 (5): 791—798.
26. Meiselman H. J. In vivo circulatory correlates of altered RBC aggregation. Biorheology. 2002; 39 (5): 636.
27. Schmid-Schonbien H. Blood rheology and oxygen transport to tissues. Adv. Physiol. Sci. 1982; 25: 279—289.
28. Cabrales P. Effects of erythrocyte flexibility on microvascular perfusion and oxygenation during acute anemia. Am. J. Physiol. Heart Cire. Physiol. 2007; 293 (2): H1206—H1215.
29. Cheung A. T, Miller J. W., Miguelino M. G., To W. J., Li J., Lin X., Chen P. C., Samarron S. L., Wun T., Zwerdling T., Green R. Exchange transfusion therapy and its effects on real-time microcirculation in pediatric sickle cell anemia patients: an intravital microscopy study. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2012; 34 (3): 169—174.
30. Hu H., Xenocostas A., Chin-Yee N., Lu X., Chin-Yee I., Feng Q. Transfusion of fresh but not old stored blood reduces infarct size and improves cardiac function after acute myocardial infarction in anemic rats. Crit. Care Med. 2012; 40 (3): 740—746.
31. Викулов А. Д., Осетров И. А., Мельников А. А. Активность Na, К-АТ-Фазы эритроцитов у физически активных лиц. Физиология человека. 2001; 27 (3): 129—132.
32. Wong P. The basis of echinocytosis of the erythrocyte by glucose depletion. CellBiochem. Funct. 2011; 29 (8): 708—711.
33. Bennett-Guerrero E., Veldman T. H., Doctor A., Telen M. J., Ortel T. L., Reid T. S, Mulherin M. A., Zhu H., Buck R. D., Califf R. M., McMahon T.J. Evolution of adverse changes in stored RBCs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104 (43): 17063—17068.
34. Атауллаханов Ф. И., Витвицкий В. М., Княткин А. Б. Регуляция объема эритроцитов человека. Роль калиевых каналов, активируемых кальцием. Биофизика. 1998; 38 (5): 809—822.
References
1. The clinical use of blood: handbook. Geneva: World Health Organization, Blood transfusion safety; 2001: 219.
2. Ob utverzhdenii tekhnicheskogo reglamenta o trebovaniyakh bezopas-nosti krovi, ee produktov, krovezameshchayushchikh rastvorov i tekhnicheskikh sredstv, ispolzuemykh v transfuzionno-infuzionnoi ter-apii. Postanovlenie Pravitelstva RF №29 ot 26 yanvarya 2010 g. [On approval of the technical specification for the safety of blood, its products, blood substituting solutions and technical facilities used in transfusion-infusion therapy. RF Government Resolution No. 29 dated 26 January 2010]. [In Russ.]
3. O donorstve krovi i ee komponentov. Federalnyi zakon Rossiiskoi Federatsii №125-FZ от 20 iyulya 2012 g. [On donation of blood and its components. Russian Federal Law No. 125-FZ dated 20 July 2012]. [In Russ.]
4. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation N. R(95)15. 16thed. Council of Europe; 2010.
5. Krasnokutsky Yu. A., Kopchenko T. G. Autogemotransfuziya kak alternativa donorskoi krovi v planovoi khirurgii. [Autohemotransfusion as an alternative to donor blood in elective surgery]. Meditsinsky Vestnik Severnogo Kavkaza. 2007; 8 (4): 14—17. [In Russ.]
6. Laptev V. V., Selivanov E. A. Znachenie mikroagregatov donorskoi krovi i ee komponentov v razvitii posttransfuzionnykh oslozhnenii i voz-
mozhnye sposoby ikh profilaktiki. [Significance of the microaggregates of donor blood and its components in the development of posttransfusion complications and possible ways of its prevention]. Vestnik Sluzhby Krovi Rossii. 2010; 1: 47-54. [In Russ.]
7. Firsov N. N., Sirko I. V., Priezzhev A. V. Sovremennye problemy agregatometrii tselnoi krovi. [Current problems in the aggre-gatometry of whole blood]. Tromboz, gemostaz, reologiya. 2000; 2 (2): 9-11. [In Russ.]
8. SeKvanov E. A., Bessmeltsev S. S., Dutkevich I. G., Danilova I. G., Lavrova V. A., Chechetkin A. V., Krasnyakov V. K., Shchelkunova L. V., Degtereva I. N., Grigoryan M. Sh. Sovremennye problemy donorstva v Rossiiskoi Federatsii. [Current problems of blood donation in the Russian Federation]. Vestnik Sluzhby Krovi Rossii. 2011; 1: 5—14. [In Russ.]
9. Spinetta P. C., Strandenes G., Rein E. B., Seghatchian J., Hervig T. Symposium on fresh whole blood for severe hemorrhagic shock: from in-hospital to far forward resuscitations. Transfus. Apher. Sci. 2012; 46 (1): 113—117.
10. Zinchuk V. V. Kislorodosvyazyvayushchie svoistva krovi: fundamental-nye i prikladnye uspekhi. Vestnik Tverskogo Gosudarstvennogo univer-siteta. Seriya: Biologiya i ekologiya. [Oxygen-binding properties of blood: basic and applied successes. Bulletin of Tver State University. Biology and Ecology Series]. 2010; 17 (16): 7—15. [In Russ.]
11. Moroz V. V., Golubev A. M., Afanasyev A. V., Kuzovlev A. N., Sergunova V. A., Gudkova O. E., Chernysh A. M. Stroenie i funktsiya eritrotsita v norme i pri kriticheskikh sostoyaniyakh (obzor). [The structure and function of a red blood cell in health and critical conditions (a review)]. Obshchaya Reanimatologiya. 2012; 8 (1): 53—61. [In Russ.]
12. Moroz V. V., Kirsanova A. K., Novoderzhkina I. S., Aleksandrin V. V., Nazarova G. A. Membranoprotektornoe deistvie perftorana na eritrot-sity pri ostroi krovopotere. [Membrane-protecting effects of perfluo-rane on red blood cells in acute blood loss]. Obshchaya Reanimatologiya. 2011; 7 (1): 5—10. [In Russ.]
13. Gerasimov L. V., Karpun N. A., Pirozhkova O. S. Izbrannye voprosy patogeneza i intensivnogo lecheniya tyazheloi sochetannoi travmy. [Selected issues of the pathogenesis and intensive treatment of severe contaminant injury]. Obshchaya Reanimatologiya. 2012; 8 (4): 111—117. [In Russ.]
14. Gerasimov L. V., Samorukov V. Yu., Moroz V. V., Ivanova G. P. Primenenie eritropoetina u bolnykh s travmoi i krovopoterei. [Use of erythropoietin in patients with injury and blood loss]. Obshchaya Reanimatologiya. 2012; 8 (5): 11—18. [In Russ.]
15. Berezina T. L., Zaets S. B., Morgan C., Spillert C. R., Kamiyama M., Spolarics Z., Deitch E. A., Machiedo G. W. Influence of storage on red blood cell rheological properties.J. Surg. Res. 2002; 102 (1): 6—12.
16. Moroz V. V., Chernysh A. M., Kozlova E. K., Sergunova V. A., Gudkova O. E., Fedorova M. S., Kirsanova A. K., Novoderzhkina I. S. Narushenie nanos-truktury membran eritrotsitov pri ostroi krovopotere i ikh korrektsiya perftoruglerodnoi emulsiei. [Impairments in the nanostructure of red blood cell membranes in acute blood loss and their correction with per-fluorocarbon emulsion]. Obshchaya Reanimatologiya. 2011; 7 (2): 5—9. [In Russ.]
17. Moroz V. V., Golubev A. M., Chernysh A. M., Kozlova E. K., Vasilyev V. Yu., Gudkova O. E., Sergunova V. A., Fedorova M. S. Izmeneniya struktury poverkhnosti membran eritrotsitov pri dlitelnom khranenii donorskoi krovi. [Structural changes in the surface of red blood cell membranes during long-term donor blood storage]. Obshchaya Reanimatologiya. 2012; 8 (1): 5—12. [In Russ.]
18. Kodenev A. Y., Vashchenko G. A., Kapustov V. I., Zhiburt E. B. Kachestvoeritrotsitov, kriokonservirovannykh pri umerenno nizkikh temperaturakh. [Quality of red blood cells cryopreserved at moderately low temperatures]. Vestnik Sluzhby Krovi Rossii. 2010; 1: 23—27. [In Russ.]
19. Bessis M. Atlas of red blood cell Shapes. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag; 1974: 21 — 101.
20. O'Coner B. H. A color atlas and instruction manual of peripheral blood cell morphology. Baltimor, USA; 1984: 316.
21. Ragimov A. A., Solovyeva I. N. Ekstrakorporalnye metody v transfuzi-ologii. [Extracorporeal methods in transfusiology]. Klinicheskaya Meditsina. 2005; 83 (4): 4—8. [In Russ.]
22. Connes P., BoucherJ. H. Echinocytosis in athletes with exercise-induced hypoxemia. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2010; 44 (2): 107—114.
23. Kidalov V. N., Syasin N. I., Khadartsev A. A. K voprosu o fiziologicheskoi znachimosti izmenenii formy, ultrastruktury i fluorestsentsii eritrotsi-tov perifericheskoi krovi, transformiruyushchikhsya v ekhinotsity. [On the physiological significance of changes in the shape, ultrastructure, and fluorescence of peripheral red blood cells transforming into echinocytes]. Vestnik Novykh Meditsinskikh Tekhnologii. 2005; 12 (2): 6—9. [In Russ.]
24. Kozinets G. I., Shishkanova Z. G., Sarycheva T. G. Kletki krovi i kostno-go mozga: atlas. [The cells of blood and bone marrow: An atlas]. Moscow: Medical Information Agency; 2004: 203. [In Russ.]
25. Berling C, Lacombe C., Lelmvre J. C., Allary M., Saint-BlancardJ. The RBC morphological dependence of the RBC disaggregability. Biorheology. 1988; 25 (5): 791-798.
26. Meiselman H. J. In vivo circulatory correlates of altered RBC aggregation. Biorheology. 2002; 39 (5): 636.
27. Schmid-Schonbien H. Blood rheology and oxygen transport to tissues. Adv. Physiol. Sci. 1982; 25: 279-289.
28. Cabrales P. Effects of erythrocyte flexibility on microvascular perfusion and oxygenation during acute anemia. Am. J. Physiol. Heart Cire. Physiol. 2007; 293 (2): H1206-H1215.
29. Cheung A. T, Miller,J. W., Miguelino M. G., To W. J., Li J., Lin X., Chen P. C., Samarron S. L, Wun T., Zwerdling T., Green R. Exchange transfusion therapy and its effects on real-time microcirculation in pediatric sickle cell anemia patients: an intravital microscopy study. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2012; 34 (3): 169-174.
30. Hu H, Xenocostas A., Chin-Yee N., Lu X., Chin-Yee I., Feng Q. Transfusion of fresh but not old stored blood reduces infarct size and
improves cardiac function after acute myocardial infarction in anemic rats. Crit. Care Med. 2012; 40 (3): 740—746.
31. Vikulov A. D., Osetrov I. A., Melnikov A. A. Aktivnost Na, К-АТFazy eritrotsitov u fizicheski aktivnykh lits. [Activity of red blood cell Na, К-ATPase in physically active persons]. Fiziologiya Cheloveka. 2001; 27 (3): 129—132. [In Russ.]
32. Wong P. The basis of echinocytosis of the erythrocyte by glucose depletion. Cell Biochem. Funct. 2011; 29 (8): 708—711.
33. Bennett-Guerrero E., Veldman T. H., Doctor A., Telen M. J., Oriel T. L., Reid T. S., Mulherin M. A., Zhu H., Buck R. D., Califf R. M., McMahon T. J. Evolution of adverse changes in stored RBCs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104 (43): 17063—17068.
34. Ataullakhanov F. I., Vitvitsky V. M., Knyatkin A. B. Regulyatsiya obyema eritrotsitov cheloveka. Rol kalievykh kanalov, aktiviruemykh kaltsiem. [Role of potassium channels activated by calcium]. Biofizika. 1998; 38 (5): 809—822. [In Russ.]
Поступила 25.05.12
КАЛЕНДАРЬ НАУЧНЫХ КОНГРЕССОВ, КОНФЕРЕНЦИЙ,
СИМПОЗИУМОВ, ШКОЛ, СЕМИНАРОВ В 2013 гг.
1—3 февраля, Vienna, Austria
5 международный симпозиум по женскому здоровью 15—19 апреля, Москва, Россия
в рамках Гемостаза (5th International Symposium on XX Российский национальный конгресс
Women's Health Issues in Thrombosis and Haemostasis) «Человек и лекарство»
www.medlife.ru
3—7 февраля, Сидней, Австралия
3-й мировой конгресс региональной анестезии 11—14 апреля, Regensburg, Germany
и лечения боли ESCVS (International Congress of European Society
for Cardiovascular Surgery) International Congress
14—17 марта, Las Vegas, USA
Общество анестезиологов педиатрии 18—19 апреля, Vienna, Austria
4th Annual Symposium Network for Advancement
19—22 марта, Brussel, Belgium of Transfusion Alternatives (NATA)
33st International Symposium on Intensive Care www.nataonline.com
and Emergency Medicine (ISICEM)
www.intensive.org 23—27 апреля, Bangkok, Thailand
IV World Anesthesia Convention 2013 — NWAC 2013
март, Москва, Россия
IX Международная Пироговская Студенческая 2—3 мая, Ghent, Belgium
Научная Медицинская Конференция Первый европейский конгресс по реанимации
www.pirogovka.rsmu.ru и экстренной медицины в педиатрии
(The First European Pediatric
март, Голицыно, Московская область, Россия Resuscitation & Emergency Medicine Congress)
Ежегодная сессия Московского научного общества www.prem2013.be
анестезиологов-реаниматологов (МНОАР)
E-mail: [email protected]
