CC BY
53
НЕЙРОБИОЛОГИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ АДДИКТИВНЫХ РАССТРОЙСТВ
УДК 612.821
Н.А. Береговой, Н.С. Сорокина, М.В. Старостина
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ МШИСТЫХ ВОЛОКОН
В ХОДЕ ФОРМИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ЗАВИСИМОСТИ ОТ МОРФИНА*
ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск
Адаптационные изменения эффективности синаптической передачи являются важным звеном в последовательности возникновения лекарственной зависимости. Длительная посттетаническая потенциация (ДПТП) служит наиболее широко используемой моделью синаптической пластичности. Изучение динамики изменений характеристик ДПТП мшистых волокон в ходе формирования зависимости от морфина показало сложный временной паттерн изменений амплитуды суммарного возбуждающего постсинапти-ческого потенциала после тетанизации. Обнаружена значительная выраженность фасилитации ДПТП после 8-10 дней потребления морфина. Хроническое воздействие морфина сопровождалось увеличением титра антител к нему; причем период быстрого нарастания титра совпадал со временем проявления фасилитации ДПТП. Таким образом, модификация синаптической пластичности мшистых волокон гиппокампа развивается значительно раньше формирования хронической опиатной зависимости у животных и можно предположить, что антитела к морфину также принимают участие в изменении синаптической эффективности мшистых волокон._________________________
Ключевые слова: морфин, антитела, гиппокамп, ДПТП
Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы адаптационных изменений нервных клеток и нейрональных сетей при хроническом воздействии опиатов подобны таковым при нормальной синаптической пластичности, лежащей в основе обучения [11]. Длительная посттетаническая потенциация, представляющая собой продолжительное увеличение эффективности синаптической передачи в ответ на кратковременную высокочастотную стимуляцию, является наиболее широко используемой моделью для изучения молекулярно-клеточных основ обучения. В то же время работ, посвященных модификации длительной посттета-нической потенциации (ДПТП) у животных с хронической зависимостью от морфина немного, а полученные данные противоречивы [7-10]. Эти противоречия могут быть связаны как с использованием различных протоколов хронизации, так и с особенностями биохимической адаптации различных типов нейронов и структур мозга, и со сложным временным характером адаптационных изменений в структуре и эффективности функционирования различных звеньев нейрональных сетей при развитии наркотической зависимости. Целью настоящей работы явилось изучение изменений параметров ДПТП в системе синаптических связей “мшистые волокна - пирамидные клетки области САЗ” гиппокампа на разных стадиях формирования хронической зависимости у крыс.
Методика. Эксперименты проводили на кры-сах-самцах линии Вистар (п=46; вес 140-160 г), полу-
ченных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в индивидуальных клетках при стандартном световом режиме (12 ч - день /12ч-ночь). Первая группа животных получала стандартный комбинированный рацион; вторую содержали на гранулированном корме для лабораторных животных (“Ин-формкорм”, Москва).
Для развития хронической опиатной зависимости у животных использовали протокол поступления морфина с питьевой водой, содержащей 2% сахарозы для маскировки горького вкуса. Концентрацию морфина в потребляемой жидкости изменяли следующим образом:
0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл - в течение 48 ч каждая и
0,4 мг/мл - в течение всего последующего периода [10]. Контрольная группа животных получала 2% раствор сахарозы. Формирование хронической зависимости регистрировали по развитию синдрома отмены в ответ на внутрибрюшинную инъекцию налоксона (1 мг/кг веса животного).
Для электрофизиологических экспериментов использовали животных на 2, 4, 8, 10, 14, 16, 18, 21, 25-30-й дни потребления морфина. Срезы гиппокампа толщиной 400 мкм помещали в термостатированную камеру (35-37оС) с проточной средой Ямамото (в мМ): №С1, 124; КСЬ, 4,9; КН2Р04, 1,2; ]^804, 1,3; СаС12, 2,5; Ж-НСОз, 25,6; Б-глюкоза, 10; pH, 7,5; аэрируемой карбогеном (95% О2 - 5% СО2 ), на 40 мин. Дальнейшую процедуру тестирования срезов и выработки ДПТП проводили, как описано ранее [2].
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант N 01-04-48964).
Кровь забитых животных собирали для определения титра антител к морфину. Титр антител определяли методом иммуноферментного дот-анализа, используя вторые антитела к иммуноглобулинам крысы, меченные пероксидазой хрена и 3,3’-диаминобензидином для выявления ферментной активности.
Результаты. Используемый в наших экспериментах протокол поступления морфина с питьевой водой позволяет избежать стрессирования животных и эффектов хэндлинга, а увеличение времени, необходимого для формирования зависимости, и постепенное нарастание дозы позволяют выделить несколько стадий развития зависимости и исследовать характерные для них адаптационные изменения.
Внутрибрюшинное введение налоксона вызывало поведенческие реакции, характерные для синдрома отмены - “встряхивание мокрой собаки”, дрожание конечностей, жевательные движения, диарею, - не ранее, чем на 25-й день потребления морфина, поэтому в дальнейшем крыс с этого срока и далее объединяли в одну группу как животных со сформированной хронической зависимостью от морфина.
Среднесуточное потребление морфина животными приведено в табл. Можно заметить различия между группами животных, содержавшихся на смешанном рационе и гранулированном корме, а также изменение потребления в зависимости от продолжительности времени спаивания. При этом более высокие значения у животных, получавших только гранулированный корм, обусловлены, вероятно, повышенным содержанием в нем солей, вызывающим увеличение потребности в жидкости. Однако тенденция к резкому повышению потребления содержащего морфин раствора на 8-10-й день была хорошо выражена в обеих группах (табл.).
Амплитуда и латентность суммарных возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) мшистых волокон в ответ натестирующие стимулы не отличались достоверно у контрольных и опытных животных и не изменялись на всех исследованных стадиях потребления морфина. Ранее нами было обнаружено, что у животных с хронической зависимостью регистрируются более высокие значения ВПСП после тетанизации мшистых волокон, чем в срезах контрольных животных, то есть происходит фасилитация ДПТП [6]. Эти данные хорошо согласуются с полученными [8, 10], использовавшими аналогичный протокол хронизации. Изучение динамики изменений параметров ДПТП в ходе развития зависимости показало, что на ранних этапах потребления морфина амплитуды суммарных ВПСП после тетанизации не отличаются в опытной и контрольной группах. Фасилитация ДПТП регистрируется с 8-го дня потребления морфина, затем выраженность фасилитации снижается с 14-15-го дня и вновь начинает нарастать с 21-го дня (рис.). Таким образом, модификация синаптической пластичности мшистых волокон гиппокампа имеет сложный характер и развивается значительно раньше формирования хронической опиатной зависимостиуживотного. Представляет интерес тот факт, что измене-
ния характеристик ДПТП были практически идентичны у животных, содержавшихся на смешанном и гранулированном корме, то есть не зависели напрямую от количества потребляемого морфина.
Опиоиды (морфин), взаимодействуя с опиатными рецепторами головного мозга, изменяют состояние ней-ротрансмиттерных систем и обладают опосредованным через центральные механизмы влиянием на иммунитет. Кроме того, они также оказывают иммуномодулирующий эффект и через опиатные рецепторы иммунокомпе-тентных клеток [3]. Выявлены значимое по сравнению с нормой снижение общей популяции Т-лимфоцитов СБ3+ фенотипа, снижение цитотоксических клеток-супрессоров СБ8+ фенотипа, повышение концентрации ]^М, 1^0 и циркулирующих иммунных комплексов [4]. Длительное введение морфина животным сопровождается образованием циркулирующих антител, с появлением которых связывают снижение анальгетического действия морфина и формирование толерантности [1].
Таблица
Среднее количество морфина, потребляемое крысой в сутки
Дни спаивания Среднее количество морфина (мг), потребляемое в сутки одной крысой (смешанный корм) Среднее количество морфина (мг), потребляемое в сутки одной крысой (стандарт. комбикорм)
1-2 2,0 3,51
3-4 1,8 6,5
7-8 9,8 11,71
9-10 8,88 10,03
14-16 6,55 11,39
17-18 5,88 14,51
19-21 8,06 15,47
Рис. Изменение относительной амплитуды ВПСП через 60 мин после тетанизации в ходе формирования хронической зависимости у крыс
В то же время в последние годы появилось большое число исследований, в которых рассматривается регуляторное действие антител [5].
При исследовании влияния антител к морфину на развитие ДПТП нами было обнаружено, что в срезах гиппокампа нормальных крыс антитела вызывали фаси-литацию ДПТП мшистых волокон, сопоставимую с таковой в срезах гиппокампа животных с хронической зависимостью от морфина. Это позволило предположить участие “иммунного” компонента в модификации синаптической пластичности при хроническом потреблении морфина [2], тем более что ранее нами было показано, что в сыворотке крови больных опийной наркоманией присутствуют нейроспецифические белки (антигены) и аутоантитела к ним [4], что свидетельствует о нарушении проницаемости гематоэнцефалического барьера. Поэтому мы проанализировали изменение титра антител к морфину в ходе формирования хронической зависимости от морфина. Титр антител до начала эксперимента был незначителен (1:2; n=12) и у контрольной группы сохранялся на том же уровне в течение всего периода спаивания. У крыс, потреблявших морфин, в первую неделю титр антител изменялся слабо (1:4; n=6), но к 10-му дню возрастал до 1:32, а на 25-30-й дни достигал значений 1:64-1:128. Таким образом, уровень антител к морфину возрастал в ходе формирования зависимости и период его быстрого увеличения совпадал со временем проявления фасилитации ДПТП, что также подтверждает высказанное ранее предположение об участии антител в модификации синаптической пластичности.
Заключение. Показано, что изменение параметров ДПТП мшистых волокон гиппокампа при развитии хронической зависимости от морфина имеет сложный характер. Выраженная фасилитация ДПТП, характерная для хронически зависимых животных, регистрируется уже после 8-10 дней потребления морфина. Рост титра антител к морфину совпадает с периодом проявления фасилитации ДПТП. Таким образом, можно предположить, что модификация синаптической пластичности мшистых волокон гиппокампа развивается значительно раньше формирования хронической опиатной зависимости у животных, а появляющиеся антитела к морфину играют определенную роль в модификации синаптической пластичности.
TIME-COURSE OF HIPPOCAMPAL MOSSY FIBER LONG-TERM POTENTIATION DURING CHRONIC MORPHINE TREATMENT
N.A. Beregovoy, N.S. Sorokina, M.V. Starostina
Long-term potentiation (LTP) is a widely used model of synaptic plasticity, and synaptic adaptations are thought to be an important component of the consequence of drug abuse. It was shown that the dynamics of the changes of mossy fiber LTP parameters during the development of chronic morphine addiction
had a complex character and developed by stages. Significant administration was accompanied by an increase in the titer of antibodies to morphine; moreover the period of significant increase in antibody level coincided to the appearance of LTP facilitation. Thus modification of synaptic plasticity in hippocampal mossy fibers was developed prior to the formation of chronic opiate addiction in animals, and it can be supposed that antibodies to morphine were involved in the changes of synaptic efficiency.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антитела к морфину в механизмах морфинной резистентности, морфинной толерантности и действия антагониста / Л.В. Калюжный, С.В. Литвинова, А.Л. Калюжный и др. // Экспер. клин. фармакол. 1998. Т. 61. №
1. С. 21-24.
2. Влияние антител к морфину на синаптическую пластичность гиппокампа / Н.А. Береговой, Т.М. Панкова, Н.С. Сорокина, М.В. Старостина // Бюл. экспер. биол. мед. 2003. Т. 135. №2. С. 114-116.
3. Зозуля А.А. Опиоиды и иммунитет / А.А. Зозуля, C.A. Пшеничкин // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Иммунология. 1990. С. 48-120.
4. Мозгоспецифические белки в сыворотке крови больных опийной наркоманией / Т.П. Ветлугина, М.В. Старостина, Н.С. Сорокина и др. // Сибирский вестник психиатр. и наркол. 2002. № 1(23). С. 110-111.
5. Полетаев А.Б. Регуляторная метасистема. Иммуноней-роэндокринная регуляция гомеостаза / А.Б. Полетаев, Г.С. Громова, И.Е. Ковалев. М., 2002. 168 с.
6. Сверхмалые дозы антител к морфину: влияние на выработку длительной посттетанической потенциации в переживающих срезах гиппокампа крыс с хронической зависимостью от морфина / Н.А. Береговой, Н.С. Сорокина, М.В. Старостина и др. // Бюл. экспер. биол. мед.
2002. Прил. № 4. С. 29-32.
7. Chronic morphine treatment alters endogenous opioid control of hippocampal mossy fiber synaptic transmission / J.M. Harrison, R.G. Allen, M.J. Pellegrino et al. // J. Neurophysiol. 2002. Vol. 87(5). P. 2464-2470.
8. Dependence on morphine leads to a prominent sharing among the different mechanisms of long-term potentiation in the CA1 region of rat hippocampus / F. Salmanzadeh, Y. Fathollahi, S. Semnanian, M. Shafizadeh // Brain Res.
2003. Vol. 963. Р. 93-100.
9. Hippocampal long-term potentiation is reduced by chronic opiate treatment and can be restored by re-exposure to opiates / Lu Pu, Guo-Bin Bao, Nan-Jie Xu et al. // J. Neurosc. 2002. Vol. 22(5). P. 1914-1921.
10. Involvement of NMDA receptors and voltage-dependent calcium channels on augmentation of long-term potentiation in hippocampal CA1 area of morphine dependent rats / A. Pourmotabbed, F. Motamedi, Y. Fathollahi et al. // Brain res. Rep. 1998. Vol. 804. P. 25-134.
11. Williams J.T. Cellular and synaptic adaptation mediating opioid dependence / J.T. Williams, M.J. Christie, О. Man-zoni//Physiol. Rev. 2001. Vol. 81. № 1. Р. 299-343.
