CC BY
58
УДК: 611.81/812:591.8
Т.М. Панкова, Н.С. Сорокина, М.В. Старостина
ВЫЯВЛЕНИЕ САЙТОВ СВЯЗЫВАНИЯ АНТИТЕЛ К МОРФИНУ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС*
ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск
C помощью иммуногистохимических методов показано, что в различных отделах головного мозга крыс присутствуют места специфического связывания антител к морфину. Содержание их наиболее высоко в структурах, образующих “центр формирования наркотического пристрастия” - area tegmentum ventralis, area hypothalamica lateralis, cortex enthorinalis, - а также в гранулярном слое зубчатой фасции, пирамидном слое области СА1 гиппокампа и зернистом слое мозжечка.___________________________________
Ключевые слова: морфин, антитела, иммуногистохимия
Антитела к антигенам нервной ткани и широкому спектру нейротропных соединений могут существенным образом изменять функциональные характеристики ЦНС, играя определенную роль в патогенезе неврологических и психических заболеваний [3]. Развитие хронической опиоидной зависимости сопровождается не только нарастанием титра сывороточных антител к наркотику [1], но и нарушением проницаемости гемато-энцефалического барьера, что обнаруживается по появлению в крови нейроспецифических антигенов и аутоантител к ним [4]. Ранее нами было показано, что антитела к морфину способны вызывать изменения синаптической пластичности гиппокампа, качественно и количественно подобные регистрируемым в гиппокампе животных с хронической зависимостью от морфина [2]. Это позволило высказать предположение об участии “иммунного” компонента в модификации функциональных характеристик нейрональных сетей при формировании опиатной зависимости, способствующих быстрому формированию аддиктивного поведения. В то же время вопрос о наличии конкретных мест связывания антител к морфину в головном мозге оставался открытым. В представленной работе выявление сайтов связывания антител к морфину в головном мозге крыс проводили с помощью иммуногистохимических методов.
Методика. В работе использовали аффинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела к морфину, полученные в Институте физиологически активных соединений РАН и Институте цитологии и генетики СО РАН. Антитела принадлежали к ^в-типу, были специфичны по отношению к морфину (100% связывания), частично реагировали с героином (30%) и кодеином (7%) и не давали перекрестных реакций с барбитуратами и амфетамином. В качестве контроля использовали неиммунный кролика.
Выявление мест связывания антител проводили на серийных фронтальных и горизонтальных парафиновых срезах головного мозга крыс, фиксированного раствором Карнуа. После депарафинирования срезов эндогенную пероксидазу ингибировали инкубацией с 0,1% азидом натрия - 0,3% перекисью водорода. Срезы промывали буферным раствором (50 мМ Трис-НС1, 200 мМ №С1, рН 7,4), блокировали неспецифическое связыва-
ние 10% эмбриональной телячьей сывороткой и инкубировали в течение ночи с антителами к морфину или контрольным иммуноглобулином в концентрации 5 мкг/мл. В качестве вторых антител использовали антитела барана к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (инкубация -2ч при 37оС). Активность пероксидазы выявляли с помощью 0,03% перекиси водорода - 0, 05% 3,3’-диаминобензидина, используя для интенсификации реакции 0,1% хлорид никеля.
Локализацию мест связывания антител к морфину в головном мозге крыс определяли с помощью нейроана-томического атласа [8].
Результаты. Проведенное исследование показало, что сайты связывания антител к морфину представлены в различных отделах головного мозга крыс. При этом паттерны иммуногистохимического окрашивания были практически идентичны при использовании препаратов антител, полученных из ИФАС РАН и из ИЦиГ СО РАН.
Наибольшая интенсивность иммунопероксидазной реакции выявлена в отдельных структурах конечного мозга (обонятельных луковицах, nucl. caudatus et puta-men, septum, гиппокампе, энторинальной коре), мозжечке, тегментуме (area tegmentalis ventralis, nucl. tegmentum ventralis), околоводопроводном сером веществе (pa-raaqueductal grey) (рис. 1, 2). Менее интенсивно окрашены латеральные ядра гипоталамуса, амигдала и неокор-текс (префронтальная область).
В контрольных срезах, где в качестве первичных антител использовали неиммунный иммуноглобулин кролика, специфическая реакция отсутствовала (рис. 1б, 2б).
В мозжечке специфическое окрашивание выявлено только в зернистом слое, в то время как ганглиозный слой, где расположены тела клеток Пуркинье, молекулярный слой и глубокие слои, содержащие волокна и ядра мозжечка, иммунонегативны (рис. 2а).
В гиппокампе наиболее сильная пероксидазная реакция наблюдается в гранулярном слое зубчатой фасции и области СА1 пирамидного слоя Аммонова рога; менее интенсивно окрашены области СА3, СА4 и практически отсутствует окрашивание в области СА2, зоне мшистых волокон и коллатералей Шаффера (рис. 2в).
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант N 01-04-48964).
Рис. 1. Выявление мест связывания антител к морфину на парафиновых срезах мозга крыс. Фиксация Карнуа. Масштаб: 300 мкм.
а, б - обонятельные луковицы. а - иммуногитохимическое окрашивание с использованием антител к морфину и вторых антител - к иммуноглобулинам кролика, конъюгированных с перокси-дазой хрена; б - контроль (неиммунный иммуноглобулин). Lcm -lamina cellularum mitralium, Lg - lamina glomerulosa, Lf- lamina fibrosa, Lm - lamina medullaris.
в - септальная область, горизонтальный срез. S - septum, VLCA - ventriculum lateralis cornu anterius.
г - фронтальный срез на уровне среднего мозга. ATL - area tegmentum lateralis.
д - фронтальный срез на границе среднего и промежуточного мозга. Aq - aqueductus cerebri, Sgc - substantia grisea centralis
Во всех структурах, где локализованы сайты специфического связывания антител к морфину, иммунопе-роксидазная реакция выявлена в цитоплазме и на мембране нейронов и начальных сегментов их отростков, а также в клетках сопровождающих глиоцитов.
Химическая природа мест связывания антител к морфину не ясна. Исходя из характера распределения их в головном мозге, представляется маловероятным, что они относятся к эндогенным опиоидным пептидам. Известно, что в нервной ткани присутствуют незначительные количества эндогенно-синтезируемого морфина [6], однако данные о конкретных структурах мозга и клеточных типах, где происходит его синтез, отсутствуют.
Анализируя полученные результаты, можно отметить, что места связывания антител к морфину расположены в областях, отличающихся высоким содержанием опиатных рецепторов, и прежде всего опиатных рецеп-
Рис. 2. Выявление мест связывания антител к морфину на горизонтальных парафиновых срезах мозга крыс. Фиксация Карнуа. Масштаб: а, в - 300 мкм, б - 200 мкм.
а, б - мозжечок. а - опыт, б - контроль. ОЬ - гранулярный слой, МЬ - молекулярный слой, Р - слой клеток Пуркинье.
в - гиппокамп. СА1, СА2, СА3 - области пирамидного слоя Аммонова рога гиппокампа; ОЬ - гранулярный слой зубчатой фасции
торов ц-типа. Так, по данным иммуноцитохимии, авторадиографии и распределения матричной РНК ц-рецеп-тора, в конечном мозге крысы наибольшим содержанием его отличаются обонятельные луковицы, пирамидный слой гиппокампа, гранулярный слой зубчатой фасции, амигдала, септальные ядра; в диенцефалоне - отдельные таламические и гипоталамические ядра [7]. В большинстве ядер гипоталамуса и вентральной области тегментум выявлено высокое содержание каппа-опиатного рецептора [7]. В зернистом слое мозжечка расположены возбуждающие синапсы моховидных волокон, содержащие энкефалины. В то же время, поскольку нам не удалось выявить интенсивную реакцию в отдельных структурах, обладающих достаточно высоким уровнем содержания опиатных рецепторов, нельзя однозначно утверждать, что антитела к морфину взаимодействуют непосредственно с компонентами рецептора.
Представляет интерес и тот факт, что сайты связывания антител к морфину выявлены в большинстве образований, входящих в так называемый “центр формирования наркотического пристрастия” - area tegmentum ventralis, area hypothalamica lateralis, cortex enthorinalis [5]. Наряду с ранее полученными данными о способности антител к модификации синаптической пластичности и возрастании их титра при длительном потреблении наркотических веществ, это также позволяет предполагать участие антител в механизмах развития аддик-ций.
Заключение. Таким образом, с помощью иммуногистохимических методов удалось показать, что антитела к морфину имеют специфические сайты связывания в определенных структурах головного мозга крыс. Распределение этих сайтов в значительной мере совпадает с локализацией опиатных рецепторов. В частности, интенсивная иммунопероксидазная реакция выявлена в областях мозга, образующих “центр формирования наркотического пристрастия”; обонятельных луковицах; пирамидном слое (СА1, СА3 и СА4) Аммонова рога и гранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа, зернистом слое мозжечка.
Авторы выражают благодарность М.А. Мягковой и С.М. Свиридову за предоставленные антитела к морфину.
IDENTIFICATION OF SITES FOR SPECIFIC BINDING OF ANTIBODIES TO MORPHINE IN RATS’ BRAIN
T.M. Pankova, N.S. Sorokina, M.V. Starostina
Sites of specific binding for anti-morphine antibodies were identified in various regions of rats’ brain with the help of im-munohistochemical methods. The highest levels of binding sites were present in brain structures designed as the ‘center of drug addiction’ - area tegmentum ventralis, area hypothalamical lateralis, cortex enthorinalis, in the granular layer of fascia dentata and the pyramidal layer CA1 of hippocampus and in the granular layer of cerebellum.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антитела к морфину в механизмах морфинной резистентности, морфинной толерантности и действия антагониста / Л.В. Калюжный, С.В. Литвинова, А.Л. Калюжный и др.// Экспер. клин. фармакол. 1998. Т. 61. № 1. С. 21-24.
2. Влияние антител к морфину на синаптическую пластичность гиппокампа / Н.А. Береговой, Т.М. Панкова, Н.С. Сорокина, М.В. Старостина // Бюл. экспер. биол. мед. 2003. Т. 135. №2. С. 114-116.
3. Крыжановский Г.Н. Нейроиммунопатология / Г.Н. Крыжановский, С.В. Магаева, С.В. Макаров. М., 1997. 283 с.
4. Мозгоспецифические белки в сыворотке крови больных опийной наркоманией / Т.П. Ветлугина, М.В. Старостина, Н.С. Сорокина и др. // Сибирский вестник психиатр. и наркол. 2002. № 1. С. 110-111.
5. Оленев С.Н. Нейробиология-95 / С.Н. Оленев, А.С. Оле-нев. СПб., 1995. 247 с.
6. Сергеев П.В. Рецепторы / П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, В.И. Петров. М., 1999. 640 c.
7. Harrison L.M. Opiate tolerance and dependence: receptors, G-proteins, and antiopiates / L.M. Harrison, A.J. Kastin, J.E. Zadina//Peptides. 1998. Vol. 19. Is. 9. P. 1603-1630.
8. Zeman W.Craigie’s Neuroanatomy of the rat /W. Ze-man, J.R.M. Innes. N.-Y. - L., 1963. 228 p.
