CC BY
0
DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-1-55-78
c«d:
Контакты: Екатерина Викторовна Шутко katshutko@gmail.com
чт
сч О сч
Динамика экспрессии микроРНК внеклеточных везикул мочи больных раком предстательной железы после радикальной простатэктомии
Е.В. Шутко1, 2, О.Е. Брызгунова1, И.А. Остальцев3, С.В. Пак3, С.Э. Красильников3, П.П. Лактионов1, 3, М.Ю. Коношенко1
ФГБУН«Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук»; Россия, 630090 Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева, 8;
2ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»; Россия, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1;
3ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России; Россия, 630055Новосибирск, ул. Речкуновская, 15
>
и о
—I
о и Z
о
ОС <
о
ю
< >
а
<
Введение. Известно, что лечение онкологических заболеваний, в том числе рака предстательной железы (РПЖ), вызывает изменения экспрессии онкогенных и онкосупрессорных микроРНК. Анализ динамики их экспрессии может быть использован для прогнозирования течения заболевания и ответа на терапию. Тем не менее влияние лечения РПЖ на экспрессию внеклеточных микроРНК только начинает исследоваться.
Цель исследования - изучить динамику экспрессии 14 микроРНК (miR-19b, -22-3p, -30e, -31, -92a, -125b, -144, -200b, -205, -222, -375, -378a, -425, -660) внеклеточных везикул мочи больных РПЖ после радикальной простатэктомии и выявить прогностические пары микроРНК.
Материалы и методы. Исследованы образцы мочи 18 доноров и 18 больных РПЖ, полученные до радикальной простатэктомии, через 1 нед и спустя 3 мес после операции. Внеклеточные везикулы выделены методом агрегации-преципитации, их микроРНК - с использованием стекловолокнистых сорбентов и октановой кислоты. С помощью обратной транскрипции - петлевой полимеразной цепной реакции (TaqMan) - получены данные о пороговых циклах детекции 14 микроРНК.
Результаты. Обнаружено, что радикальная простатэктомия вызывает достоверное изменение относительной экспрессии 44 пар микроРНК во внеклеточных везикулах мочи больных РПЖ. Можно выделить 4 группы пар микроРНК:
1) пары микроРНК, уровень экспрессии которых достоверно различался между донорами и больными РПЖ до операции и достоверно изменялся у больных РПЖ через 3 мес после нее по направлению к уровню доноров (6 пар);
2) пары микроРНК, уровень экспрессии которых достоверно не различался между донорами и больными РПЖ до операции, однако через 3 мес после нее достоверно отличался от исходного у больных РПЖ и доноров (5 пар);
3) пары микроРНК, на основании данных об относительной экспрессии которых больных РПЖ через 3 мес после радикальной простатэктомии можно разделить на 2 или 3 достоверно различающиеся подгруппы (19 пар); 4) пары микроРНК, достоверно не изменившие свою экспрессию после операции (30 пар).
Заключение. Радикальная простатэктомия вызывает значительное изменение уровня экспрессии микроРНК внеклеточных везикул мочи. На основании анализа динамики экспрессии микроРНК после этой операции выявлены 6 пар микроРНК, уровень относительной экспрессии которых после хирургического вмешательства достоверно изменялся в сторону ее уровня у здоровых доноров, и 19 пар микроРНК, по уровню относительной экспрессии которых больные РПЖ разделялись на 2 достоверно различные подгруппы через 3 мес после радикальной простатэктомии.
Ключевые слова: рак предстательной железы, микроРНК, внеклеточные везикулы мочи, радикальная простатэктомия, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, динамика микроРНК после лечения рака
Для цитирования: Шутко Е.В., Брызгунова O.E., Остальцев И.А. и др. Динамика экспрессии микроРНК внеклеточных везикул мочи больных раком предстательной железы после радикальной простатэктомии. Успехи молекулярной онкологии 2024;11(1):55-78. DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-1-55-78
О m
а.
в;
5
о ж.
U >
BY 4.0
^ Dynamics of miRNA expression in urine extracellular vesicles of prostate cancer patients о after radical prostatectomy
E.V. Shutko12, O.E. Bryzgunova1,1.A. Ostal'cev3, S.V. Pak3, S.E. Krasi'nikov3, P.P. Laktionov1,3, M.Yu. Konoshenko1
ГН
1Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences; 8 Academician Lavrentiev
S Prospekt, Novosibirsk 630090, Russia;
to
< >
в;
>
о ж.
и >
Novosibirsk State University; 1 Pirogov St., Novosibirsk 630090, Russia;
O
® 3E.N. Meshalkin National Medical Research Center, Ministry of Health of Russia; 15 Rechkunovskaya St., Novosibirsk 630055, Russia Z
O Contacts: Ekaterina Viktorovna Shutko katshutko@gmaii.com 0£
< Introduction. It is known that the treatment of oncological diseases including prostate cancer (PCa) causes changes
3 in the expression of oncogenic and oncosuppressive miRNAs. The analysis of miRNA expression dynamics can be used
y to predict the course of the disease and its response to therapy. However, the effect of PCa therapy on the expression
^ of extracellular miRNAs is just beginning to be investigated.
Aim. To study the expression dynamics of 14 miRNAs (miR-19b, -22-3p, -30e, -31, -92a, -125b, -144, -200b, -205, -222, z -375, -378a, -425, -660) in urine extracellular vesicles of PCa patients after radical prostatectomy and to reveal prognos-
tic miRNA ratios.
Materials and methods. Urine samples of 18 donors and 18 PCa patients, obtained before radical prostatectomy, 1 week and 3 months after surgery, were examined. Extracellular vesicles were isolated by aggregation-precipitation protocol; extracellular vesicles miRNAs were isolated using fiberglass sorbents and octane acid. Data on threshold detection cycles
O of 14 miRNAs were obtained using reverse transcription - loop polymerase chain reaction (TaqMan).
Results. It was found that prostatectomy causes a significant change in the relative expression of 44 miRNA ratios in the urine of PCa patients. Four groups of miRNA ratios can be distinguished: 1) miRNA ratios, which expression level s significantly differed between donors and PCa patients before surgery and significantly changed in PCa patients 3 months
i_ after prostatectomy in the direction of the level of donors (6 pairs); 2) miRNA ratios, which expression did not signifi-
® cantly differ between donors and PCa patients before surgery, but significantly differed from the baseline in PCa patients
© and donors 3 months after prostatectomy (5 pairs); 3) miRNA ratios, based on expression ratios of which PCa patients
can be divided into two or three significantly different subgroups 3 months after prostatectomy (19 pairs); 4) miRNA ratios that did not significantly change their expression after prostatectomy (30 pairs).
Conclusion. Prostatectomy causes a significant change in the level of expression of miRNA in urine. 6 pairs of miRNAs, the relative expression of which after surgery significantly changed towards that of healthy donors and 19 pairs of miRNAs, ç^ according to the level of relative expression of which patients with prostate cancer were divided into two significantly
different subgroups 3 months after prostatectomy, were identified based on the analysis of the dynamics of miRNA expression after prostatectomy.
Keywords: prostate cancer, miRNA, extracellular vesicles of urine, radical prostatectomy, reverse transcription polymerase chain reaction, miRNA dynamics after cancer treatment
For citation: Shutko E.V, Bryzgunova O.E., Ostal'cev I.A. et al. Dynamics of miRNA expression in urine extracellular vesicles of prostate cancer patients after radical prostatectomy. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2024;11(1):55-78. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-1-55-78
введение
В настоящее время рак предстательной железы (РПЖ) занимает 1-е место по заболеваемости совместно с раком легких и 5-е место по смертности среди мужчин в России и в мире. Всего в 2020 г. зафиксированы 1 414 259 новых случаев РПЖ, что составляет 14,1 % от общего числа новых случаев злокачественных новообразований среди мужчин [1].
Радикальная простатэктомия (РПЭ) примерно в 40 % случаев является первым и обязательным шагом в лечении РПЖ [2]. Хирургическому вмешательству подвергаются пациенты с локализованной формой РПЖ и ожидаемой продолжительностью жизни более 10 лет. Радикальная простатэктомия представляет собой операцию, подразумевающую полное удаление предстательной железы в комплексе с семенными пузырьками и фрагментом мочеиспускательного канала
(уретры), который проходит через орган. Несмотря на значительное совершенствование хирургической техники, развитие рецидива после РПЭ остается актуальной проблемой. Так, у 30 % больных, перенесших оперативное вмешательство, в течение первых 10 лет после него наступает биохимический рецидив (БХР) [3].
Для прогноза течения заболевания и предсказания развития рецидива РПЖ после РПЭ в клинической практике используют такие показатели, как уровень и плотность сывороточного простатического специфического антигена (ПСА), патологоанатомическая стадия заболевания, оценка по шкале Глисона, характер хирургического края, объем опухоли, наличие/отсутствие лимфоваскулярной и периневральной инвазий [4]. Однако данные показатели характеризуются низкими чувствительностью и специфичностью [5, 6]. В настоящий момент в клинической практике отсутствуют
Таблица 1. Характеристика доноров и больных раком предстательной железы (РПЖ) Table 1. Characteristics of donors and prostate cancer (PCa) patients
Показатель Parameter Больные РПЖ (n = 18) Доноры Donors
Возраст, лет Age, years 61,0 ± 8,0 52,9 ± 5,2
ПСА, нг/мл: PSA, ng/ml: до РПЭ before RP через 3 мес после РПЭ 3 months after RP через 6 мес после РПЭ 6 months after RP через 9 мес после РПЭ 9 months after RP через 1 год после РПЭ 1 year after RP 8,39 ± 2,62 0,17 ± 0,24 0,30 ± 0,47 0,29 ± 0,56 0,35 ± 0,53 0,68 ± 0,47
Стадия по классификации Tumor, Nodus and Metastasis (TNM), %: The stage according to the classification of Tumor, Nodus and Metastasis (TNM), %: Т1 Т2 Т3 N0 M0 50 39 11 100 100 -
Оценка по шкале Глисона, %: Gleason score, %: 6 7 8 83 6 11
Стадия, %: Stage, %: II III 89 11
Примечание. РПЭ — радикальная простатэктомия; ПСА Note. RP — radical prostatectomy; PSA — prostatic specific antigen. — простатический специфический антиген.
чт
СЧ
о
СЧ
>-
(J
о
-J
о и z о
ОС <
о ж.
to ш и
z <
>
a
<
о
a.
в;
£
о ж.
и >
надежные маркеры эффективности лечения и предсказания развития рецидива РПЖ. Анализ ПСА также не является надежным методом оценки эффективности выполненной операции, прогнозирования течения заболевания и стратификации рисков [7, 8]. Распространенность РПЖ и его рецидивов требует совершенствования методов диагностики и оценки эффективности терапии с целью увеличения продолжительности жизни пациентов и улучшения ее качества.
В настоящее время внимание российских и зарубежных исследователей привлекают внеклеточные нуклеиновые кислоты. Изучается их потенциал в качестве биомаркеров различных заболеваний [9]. Анализ циркулирующих нуклеиновых кислот может быть использован для разработки методов диагностики онкологических заболеваний и мониторинга эффективности лечения или развития лекарственной устойчивости, а также для выбора наиболее подходящей терапии [10]. Оценка эффективности лечения с помощью жидкост-
ной биопсии позволит скорректировать или при необходимости внести принципиальные изменения в курс лечения [11]. В качестве маркеров жидкостной биопсии могут быть использованы аберрантно экспрессирован-ные внеклеточные микроРНК, представленные в составе комплексов с белками/липопротеинами/протеогликана-ми или упакованные во внеклеточные везикулы (ВВ). Из литературных [12] и полученных нами ранее [13] данных известно, что РПЭ вызывает разнонаправленные изменения уровней экспрессии микроРНК. Уже были получены свидетельства того, что наибольшим потенциалом в качестве диагностических маркеров РПЖ обладают микроРНК ВВ мочи [14, 15]. Тем не менее влияние РПЭ на экспрессию внеклеточных микроРНК биологических жидкостей, так же как и возможность их использования в качестве маркеров эффективности РПЭ, остаются малоизученными [16]. Очевидно, что для поиска маркеров эффективности РПЭ необходимо исследовать динамику экспрессии микроРНК после
чт
сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж.
ю
< >
а
<
о
а. те
о ж.
и >
хирургического вмешательства в краткосрочной и длительной перспективах.
В представленной работе проанализирована динамика относительной экспрессии 14 микроРНК (hsa-miR-19b, -22-3p, -30e, -31, -92a, -125b, -144, -200b, -205, -222, -375, -378a, -425, -660), которые согласно результатам наших исследований, проведенных ранее [13, 16], а также анализу данных литературы [17—19] ассоциированы с развитием РПЖ в целом и вовлечены в механизмы развития рецидива в частности. Выполнен сравнительный анализ полученных данных с уровнем относительной экспрессии доноров, а также корреляционный анализ клинических характеристик больных до РПЭ, через 3 мес и 1 год после нее.
Цель исследования — изучить динамику экспрессии 14 микроРНК (miR-19b, -22-3p, -30e, -31, -92a, -125b, -144, -200b, -205, -222, -375, -378a, -425, -660) ВВ мочи больных РПЖ после радикальной простатэктомии и поиск прогностических пар микроРНК.
материалы и методы
Образцы мочи доноров получены из отделения переливания крови, больных РПЖ — из радиологического отделения Национального медицинского исследовательского центра им. акад. Е.Н. Мешалкина (Новосибирск, Россия) (табл. 1). Образцы мочи пациентов с РПЖ были взяты до РПЭ и повторно через 1 нед и 3 мес после операции для оценки динамики относительной экспрессии микроРНК. Дополнительную терапию до и после РПЭ больные не получали.
Образцы мочи больных РПЖ и доноров центрифугировали в течение 20 мин при 400g и при комнатной температуре (центрифуга MLW K70D) для осаждения клеток. Отбирали супернатант и центрифугировали в течение 20 мин при 17 000g и 24 °С для осаждения клеточного дебриса (Eppendorf Centrifuge 5810 R). Внеклеточные везикулы выделены из образцов мочи методом, разработанным ранее и основанным на агрегации-преципитации с использованием полиэтиленгликоля (Sigma-Aldrich, США) и декстрана синего (Ferak Berlin GmbH, Германия) [20]. Из полученной фракции ВВ с применением ß-меркаптоэтанола (PanReac AppliChem, Германия), гуанидин тиоцианата (Sigma-Aldrich, США) и октановой кислоты (Sigma Life Science, США) выделены микроРНК методом, описанным ранее [21]. С помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени получены данные о пороговых циклах детекции каждой микроРНК в образцах доноров. Праймеры и флуоресцентно-меченные зонды, используемые для постановки реакций, синтезированы в лаборатории биомедицинской химии Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (Новосибирск, Россия). Относительную экспрессию микроРНК анализировали в 2 постановках (сетах): в 1-й постановке
анализировали экспрессию miRNA-19b, -30e, -31, -92a, -125b, -200b, -205, -375, -660, во 2-й - miRNA-19b,-22-3p,-30e, -125b, -144, -222, -378a, -425. Для эффективной оценки всех возможных комбинаций любых двух микроРНК внутри одного сета выполнена попарная нормализация, так как результаты анализа экспрессии каждой отдельно взятой микроРНК могут быть искажены из-за влияния множества внешних и внутренних факторов [22, 23]. Поскольку экспрессия микроРНК оценивалась в двух разных наборах микроРНК, нормализация проводилась только внутри каждого сета. Таким образом, были сформированы 60 соотношений микроРНК. Для дальнейшего анализа рассчитаны значения dCt (разница пороговых циклов) каждой пары микроРНК внутри сета.
Далее проанализировано распределение значений dCt с помощью теста Шапиро-Уилка. Достоверность межгрупповых различий оценена с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Данные об изменении относительной экспрессии микроРНК после РПЭ проанализированы с помощью дисперсионного анализа ANOVA для повторных измерений. Результаты считали статистически значимыми приp <0,05 (программа MedCalc Statistical Software).
результаты
В настоящей работе проанализирована динамика относительной экспрессии 14 микроРНК (в составе 60 пар), вовлеченных в регуляцию РПЖ [13, 24-26], до и после РПЭ. Источником микроРНК служили ВВ, которые выделяли из образцов мочи больных РПЖ, полученных до и после операции (через 1 нед, 3, 6, 9 и 12 мес после РПЭ) и доноров в качестве контрольной группы.
Выявлены 19 пар микроРНК, дифференциально экспрессированных у первичных больных РПЖ до РПЭ по сравнению с донорами (рис. 1, а—г). При этом miRNA-30e, -92a, -200b, -375 и -660 входили в состав наибольшего количества дифференциально экс-прессированных пар микроРНК: при участии miRNA-660 сформированы 6 таких пар, miRNA-19b, -30e, -200b, -375 - 5 пар, miRNA-92a - 4 пары.
Показано, что 44 пары микроРНК ВВ, формируемые 14 микроРНК мочи больных РПЖ, статистически значимо изменяли экспрессию микроРНК после РПЭ (табл. 2). Кроме того, сравнение уровней относительной экспрессии микроРНК до и после РПЭ больных РПЖ и доноров позволило получить данные об изменении экспрессии микроРНК после операции относительно нормы (см. табл. 2).
На основании анализа динамики относительной экспрессии пар микроРНК до и после РПЭ они были разделены на 4 группы: 1) пары микроРНК, уровень экспрессии которых достоверно различался у доноров и больных РПЖ до операции, достоверно изменялся у больных РПЖ через 3 мес после РПЭ по направлению к уровню
10 8 6 4 2
** 0 u и ■с
-2 -4 -6 -8 -10
miR-30e/375 miR-30e/660 miR-31/375 miR-200b/205 miR-200b/375
tp
I * 1—1 **
- * о ** I
О' г в» 1 Т ! г i : т ■1
L цр А F1 Г 7~
г] 1 г л,1''"Г # ■ г~ L 1 ь
? э— ■ в н г п Р
г \ ь ш -
_ * 5 РМ 0
I 1 1 » ' •
6 4 miR-125b/660 miR-200b/660 miR-92a/660 miR-19b/660 miR-31/660
-2
-4
-6
1
***
A №
I _;_
*
i-1
ш
JL
I
I
I
i-1
»
a
Д / D РПЖ / PCa Д / D РПЖ / PCa Д / D РПЖ / PCa Д / D РПЖ / PCa Д / D РПЖ / PCa miR-92a/375 miR-125b/375 miR-425/19b miR-30e/92a miR-30e/205 г ю
8 6 4
J
! 2
0 -2 -4
Д/D РПЖ/РСа Д/D РПЖ/РСа Д/D РПЖ/РСа Д/D РПЖ/РСа Д/D РПЖ/РСа
*p <0,05. **p <0,01. —p <0,001.
Д / D РПЖ / PCa Д/ D РПЖ / PCa Д / D РПЖ/ PCa Д / D РПЖ/ PCa Д / D РПЖ/ PCa
miR-19b/30e miR-19b/200b miR-92a/200b miR-19b/125b
Д / D РПЖ / PCa Д / D РПЖ / PCa Д / D РПЖ / PCa Д / D РПЖ / PCa
Рис. 1. Пары микроРНК, относительная экспрессия которых достоверно различалась у больных раком предстательной железы (РПЖ) и доноров (Д): а - miR-30e/375, -30e/660, -31/375, -200b/205, -200b/375; б - miR-125b/660, -200b/660, -92a/660, -19b/660, -31/660; в - miR-92a/375, -125b/375, -425/19b, -30e/92a, -30e/205; г - miR-19b/30e, -19b/200b, -92a/200b, -19b/125b
Fig. 1. miRNA ratios, the relative expression of which significantly differs in prostate cancer (PCa) patients and donors (D): a - miR-30e/375, -30e/660, -31/375, -200b/205, -200b/375; б - miR-125b/660, -200b/660, -92a/660, -19b/660, -31/660; в - miR-92a/375, -125b/375, -425/19b, -30e/92a, -30e/205; г - miR-19b/30e, -19b/200b, -92a/200b, -19b/125b
чт
СЧ
о
СЧ
>-
(J
о
—I
о и z о
ОС <
о ж
to ш и
z <
>
a
<
о
a.
в;
£
о ж.
и >
доноров (miRNA-92а/375, -125Ь/375, -205/375) или достигал такового (miRNA-19b/200b, -30е/205, -30е/660) (6 пар; рис. 2, а);
2) пары микроРНК, уровень экспрессии которых достоверно не различался у доноров и больных РПЖ до РПЭ, достоверно отличался от исходного у пациентов с РПЖ и доноров через 3 мес после операции (miRNA-19b/222, -19Ь/375, -30е/222, -92а/205, -375/660) (5 пар; рис. 2, б);
3) пары микроРНК, на основании данных об относительной экспрессии которых через 3 мес после РПЭ больных РПЖ можно разделить на 2 или 3 достоверно различающиеся по данному показателю подгруппы (р <0,001), условно обозначенные как А, Б, В в порядке убывания значений dCt (19 пар; табл. 3; рис. 2, в);
4) пары микроРНК, достоверно не изменявшие свою экспрессию через 3 мес после РПЭ согласно кри-
териям, описанным выше, или не имевшие определенного паттерна изменения экспрессии: 17 пар микроРНК, достоверно изменявших свою относительную экспрессию после РПЭ по результатам дисперсионного анализа для повторных измерений, но не принадлежавших ни к одной из вышеперечисленных групп (не имевших четкого паттерна динамики экспрессии; miRNA-19b/22-3p, -19Ь/92а, -19Ь/144, -22-3р-30е, -22-3р-222, -22-3р/425, -30е/92а, -30е/200Ь, -30е/378а, -30е/425, -31/92а,-31/205,-92а/125Ь, -92а/200Ь,-125Ь/200Ь (рис. 2, г), -125Ь/205, -378а/425); 13 пар ми-кроРНК, достоверно не изменявших свою относительную экспрессию по результатам дисперсионного анализа для повторных измерений (miRNA-19b/30e, -19Ь/31, -30е/375, -31/375, -200Ь/375,-144/222,-144/425,-144/125Ь,-222/378а, -222/425,-222/125Ь, -378а/125Ь,-425/125Ь).
а
2
0
в
Таблица 2. Динамика относительной экспрессии микроРНК внеклеточных везикул мочи больных раком предстательной железы (РПЖ). Средняя разница уровней экспрессии (mean ddCt), среднее ± стандартное отклонение
Table 2. Dynamics of relative miRNA expression of extracellular vesicles in the urine of prostate cancer (PCa) patients. Mean difference in expression levels (mean ddCt), mean ± standard deviation
микроРНК
Сравнение пациентов с РПЖ до РПЭ, через 1 нед и через 3 мес после операции с донора!
11
Сравнение пациентов с РПЖ через 1 нед и через 3 мес после РПЭ с пациентами с РПЖ до РПЭ
Comparison PCa patients 1 week and 3 months after RP with PCa patients before RP
Сравнение пациентов с РПЖ через 1 нед и пациентов с РПЖ через 3 мес после РПЭ
Через 1 нед после РПЭ
1 week after RP
Через 3 мес после РПЭ
months after RP
Через 1 нед после РПЭ
Через 3 мес после РПЭ
3 months after RP
1-я группа пар микроРНК Group 1 of miRNA ratios
miRNA-92a/375 1,25 + 2,50* -5,69+ 2,67*** -5,10+ 1,87*** -6,95+ 3,83*** -6,35 + 2,34*** H/p N/d rn
miRNA-125b/375 1,89 + 2,72* -5,06 + 2,36*** -4,26 + 2,33*** -6,94+ 3,64*** -6,15 + 2,96*** H/p N/d 2
miRNA-205/375 0,91 + 3,21* —7 37 + 2 91*** -3,74 + 2,26*** -8,60 + 3,92*** -4,9 + 2,69*** 3,63 + 3,20***
miRNA- 19b/200 -1,48 + 2,63* -1,83 + 2,21** H/p N/d H/p N/d 1,94 + 1,60** z 2,29 + 1,92*** >
miRNA-30e/205 1,57+ 3,20* 2,16 + 2,36*** H/p N/d H/p N/d -2,06+ 3,23* to -2,65 + 2,76*** 0
miRNA-30e/660 2,35+ 3,39*** 1,13 + 2,35* -1,37+ 1,63* H/p N/d -3,72+ 3,69**** -2,50 + 2,74***
2-я группа пар микроРНК Group 2 of miRNA ratios
miRNA- 19b/222 H/p N/d H/p N/d 2,08 + 2,21*** H/p N/d 3,04 + 2,60** 2,50 + 2,49**
miRNA-19b/375 H/p N/d -6,99 + 3,82*** -4,11 + 2,47*** -7,83 + 4,67*** -4,95 + 2,66*** 2,87 + 3,02**
miRNA- 30e/222 H/p N/d 1,42 + 3,10* 2,72+3,13*** H/p N/d 2,50 + 3,73* H/p N/d g
mi RNA- 9 2 a/2 0 5 H/p N/d 1,68 + 2,06*** -1,36 + 1,87** 1,65 + 1,67** -1,39 + 2,05* -3,04 + 2,33***
miRNA-375/660 H/p N/d 6,34 + 2,81*** 2,86 + 2,89** 6,79 + 4,24*** 3,31 + 2,44** < -3,48 + 3,84***
Продолжение табл. 2
Continuation of table 2
1 2 3 4 5 6 7
3-я группа пар микроРНК Group 3 of miRNA ratios
miRNA-19b/205 H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d
miRNA-19b/125b -0,55+ 1,55* -1,29+ 1,53*** H/p N/d -0,69 + 2,09* H/p N/d H/p N/d
miRNA-425/19 1,31 + 2,10* 0,06 + 2,04** H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d
miRNA-22—3p/378a H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d
miRNA-22—3p/125b H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d
miRNA-22 -3p/144 H/p N/d H/p N/d -1,85 + 4,04* H/p N/d H/p N/d -2,58 + 4,03*
miRNA-30e/144 H/p N/d 1,31+2,69* -1,72+ 3,27* H/p N/d H/p N/d -3,03 + 2,12***
miRNA-30e/125b H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d H/p N/d
miRNA-31/200b H/p N/d -1,81 + 0,94*** H/p N/d -1,22 + 0,96** H/p N/d 1,89+ 1,41***
miRNA-31/125b H/p N/d -1,91 + 1,60*** H/p N/d -1,75+ 1,66*** H/p N/d 1,68 + 1,39**
miRNA—31/660 1,28 + 1,62** H/p N/d H/p N/d -1,91 + 1,53*** -2,92 + 3,34** H/p N/d
miRNA-125b/660 1,44+ 1,30*** 1,29+ 1,42*** -1,40 + 2,11* H/p N/d -2,84 + 2,72*** -2,69 + 2,97***
miRNA-92a/660 0,81 + 1,48* H/p N/d —2 34 + 1 77*** H/p N/d -3,05 + 2,38*** -2,89 + 3,26***
miRNA-200b/205 1,09 + 2,09* 2,21 + 1,55*** H/p N/d 1,12 + 1,91* -1,93 + 2,29** -3,05 + 1,98***
miRNA-200b/660 1,87+ 1,66*** 1,18+1,40** -1,72 + 1,67** H/p N/d -3,59 + 2,75*** -2,90 + 2,61***
miRNA-205/660 H/p N/d -1,03+ 1,86* H/p N/d -1,81 + 1,76*** -1,66 + 1,34** H/p N/d
4^
М
+1 оо
<4
ГЦ
гц
+1
4^
К
+1
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
+1
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
ГЦ
+1
к z
4^
M
+1
Д2?
+1
j^t^ J^T^
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
ГЦ
+1 сл
M
ft-o au .ft-o .ft-o .ft-o .ft-o .ft-o .ft-o .ft-o .ft-o
£.1
ft-o au .ft-o .ft-o
« =
в С
rt о
В
& S
S о ■
■4-
ГЦ
+1 ЧО
4^ т^
M 2?
ЧО ГЦ
+1 a\
ГЦ
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
4^ т^
M 2?
+1
о
+1 о
CD
к 2?
4^ т^
M 2?
ГЦ
+1
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
ГЦ
+1
+1 oo
ГЦ
4^;o
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
+1 ГЦ
к 2?
4^^
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
ft -o
Piiz
ГЦ
+1
4^^
ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ ffiZ
t--ГЦ
+1 a\
ft -o Pi*
о &
§ s
"-ч
V
« a
fO
a ^
1
E? I
^^
3 ^
a ^^ •o ^
«0
0
S
S
f 1
1
# § Ss
Доноры/ Donors
РПЖ до РПЭ / PCa before RP
РПЖ через 1 нед после РПЭ / PCa 1 week after RP
РПЖ через 3 мес после РПЭ / PCa 3 months after RP
Доноры / Donors
РПЖ до РПЭ /
PCa before RP
РПЖ через 1 нед после РПЭ /
PCa 1 week after RP
РПЖ через 3 мес после РПЭ / PCa 3 months after RP
чт
сч о сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
Доноры / Donors
РПЖ до РПЭ /
PCa before RP
РПЖ через 1 нед после РПЭ / PCa 1 week after RP
РПЖ через 3 мес после РПЭ / PCa 3 months after RP
Доноры / Donors
РПЖ до РПЭ /
PCa before RP
РПЖ через 1 нед после РПЭ / PCa 1 week after RP
О
ж
ю
< >
а
<
РПЖ через 3 мес после РПЭ / PCa 3 months after RP
о
РПЖ 1 /РСа 1 РПЖ 2 /РСа 2 РПЖ 3/ РСа 3 РПЖ 4 /РСа 4 РПЖ 5 /РСа 5 РПЖ 6 /РСа 6
РПЖ 7 / РСа 7 • РПЖ 8 /РСа 8 РПЖ 9 /РСа 9 РПЖ 10 /РСа 10 РПЖ 11 /РСа 11 РПЖ 12 /РСа 12
*p <0,05. **p <0,01. —p <0,001.
РПЖ 13/РСа 13 РПЖ 14/РСа 14 РПЖ 15/РСа 15 РПЖ ЛЫРСа 16 РПЖ 17/РСа 17 РПЖ 18/РСа 18
Рис. 2. Динамика относительной экспрессии (dCt) микроРНК в микровезикулах мочи больных раком предстательной железы (РПЖ): а — miRNA-30e/660 (пример 1-й группы пар микроРНК); б — miRNA-375/660 (пример 2-й группы пар микроРНК); в — miRNA-425/19b (пример 3-й группы пар микроРНК); г — miRNA-125b/200b (пример 4-й группы пар микроРНК). РПЭ — радикальная простатэктомия
Fig. 2. Dynamics of relative expression (dCt) of miRNAs in urine microvesicles of prostate cancer (PCa) patients: a — miRNA-30e/660 (an example of the Group 1 of miRNA ratios); б — miRNA-375/660 (an example of the Group 2 of miRNA ratios); в — miRNA-425/19b, an example of the Group 3 of miRNA ratios; г — miRNA-125b/200b, an example of the Group 4 of miRNA ratios. RP — radical prostatectomy
в;
о ж.
и >
б
а
На основании данных об относительной экспрессии 19 пар микроРНК (3-я группа) через 3 мес после РПЭ (р <0,001) больных можно разделить на 2 (miRNA-19b/205, -425/19Ь (рис. 2, в), -22-3р/378а, -22-3р/125Ь,-22-3р/144,-30е/125Ь,-30е/144,-31/125Ь, -31/200Ь, -92а/660, -200Ь/205, -200Ь/660, -205/660, -19Ь/125Ь, -144/378а, -30е/31) или 3 (miRNA-19b/378a, -31/660, -125Ь/660) подгруппы, условно обозначенные как А, Б и В. Следует отметить, что в подгруппы больных РПЖ вошли одни и те же пациенты с единичными исключениями, т. е. подгруппы мало различались по составу при анализе экспрессии разных пар микроРНК. При этом экспрессия некоторых пар микроРНК 3-й группы через 3 мес после РПЭ достоверно отличалась от таковой у доноров и больных РПЖ до хирургического вмешательства, а некоторых — нет (табл. 3). К 3-й группе относятся и 3 пары микроРНК (miRNA-144/378a, -19Ь/378а, -30е/31), для которых
методом дисперсионного анализа для повторных измерений не выявлены достоверные изменения экспрессии после РПЭ. Тем не менее значимые различия уровней экспрессии этих пар микроРНК через 3 мес после РПЭ позволили разделить пациентов на достоверно различающиеся подгруппы (p <0,001) и отнести такие пары микроРНК к 3-й анализируемой группе, а не ко 2-й. Отсутствие достоверности при статистическом анализе можно объяснить широким диапазоном dCt у пациентов из разных подгрупп (А и Б или А, Б и В) через 3 мес после РПЭ, из-за чего при анализе этой временной точки в качестве единой группы (по алгоритму Repeated measures analysis of variance (ANOVA)) различия нивелируются.
В 3-й группе пар микроРНК особый интерес с точки зрения поиска маркеров рецидива представляют те пары, относительная экспрессия которых у части пациентов через 3 мес достоверно отличалась от таковой
чт
сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю ш и
Z <
>
а
<
Таблица 3. Сравнение уровней относительной экспрессии пар микроРНК, относящихся к 3-й группе (с разделением пациентов на подгруппы), у пациентов с раком предстательной железы (РПЖ) через 3 мес после радикальной простатэктомии (РПЭ) с уровнями до операции и через 1 нед после нее. Средняя разница уровней экспрессии (mean ddCt), среднее ± стандартное отклонение
Table 3. Comparison of the relative expression levels of microRNA pairs belonging to group 3 (with the division ofpatients into subgroups) in patients with prostate cancer (prostate cancer) 3 months after radical prostatectomy (RP) with the levels before surgery and 1 week after it. The mean difference in expression levels (mean ddCt), mean ± standard deviation
О
X О
о
X
те m
о ж.
и >
Сравнение с донорами
'onoi
Сравнение с пациентами с РПЖ до РПЭ
Comparison with PCa patients before RP
Сравнение с пациентами с РПЖ через 1 нед после РПЭ
Comparison with PCa patients 1 week after RP
miRNA-19b/205 Подгруппа А Subgroup A Н/р N/d Н/р N/d 0,32 ± 1,15***
Подгруппа Б Subgroup B Н/р N/d Н/р N/d -1,97 ± 1,17***
miRNA-425/19b Подгруппа А Subgroup A 2,06 ± 1,06*** Н/р N/d 2,07 ± 1,84**
Подгруппа Б Subgroup B -2,19 ± 1,07*** -3,37 ± 2,12*** -2,18 ± 1,93**
Подгруппа А Subgroup A 5,51 ± 2,24*** 4,84 ± 2,72*** 4,60 ± 3,04**
miRNA-22-3p/378a
Подгруппа Б Subgroup B Н/р N/d Н/р N/d Н/р N/d
miRNA-22-3p/125b Подгруппа А Subgroup A 4,14 ± 1,67*** 3,61 ± 2,62** 4,17 ± 2,14**
Подгруппа Б Subgroup B Н/р N/d Н/р N/d Н/р N/d
miRNA-22-3p/144 Подгруппа А Subgroup A Н/р N/d 1,30 ± 1,89* Н/р N/d
Подгруппа Б Subgroup B -4,32 ± 1,45*** -3,95 ± 1,70*** -5,05 ± 2,80***
miRNA-30e/125b Подгруппа А Subgroup A 3,44 ± 1,96*** 2,63 ± 1,82** 2,90 ± 1,00***
Подгруппа Б Subgroup B Н/р N/d -1,77 ± 1,99* -1,50 ± 0,89***
miRNA-30e/144 Подгруппа А Subgroup A Н/р N/d Н/р N/d -1,75 ± 2,11**
Подгруппа Б Subgroup B -4,80 ± 1,77*** -4,72 ± 3,19** -6,11 ± 1,93***
miRNA-31/125b Подгруппа А Subgroup A 1,01 ± 1,25* 1,17 ± 1,05** 2,93 ± 1,42***
Подгруппа Б Subgroup B -1,34 ± 1,22** -1,18 ± 1,11** Н/р N/d
miRNA-31/200b Подгруппа А Subgroup A 1,24 ± 0,83*** 1,83 ± 0,99*** 3,05 ± 0,98***
Подгруппа Б Subgroup B -1,23 ± 0,71*** Н/р N/d Н/р N/d
Подгруппа А Subgroup A 2,92 ± 1,39*** 1,64 ± 0,98** 3,59 ± 1,34***
miRNA-31/660 Подгруппа Б Subgroup B Н/р N/d -1,53 ± 1,07** Н/р N/d
Подгруппа В Subgroup C -4,55 ± 1,58*** -5,82 ± 1,06*** -3,88 ± 1,36***
Окончание табл. 3 End of table 3
Пары микроРНК Сравнение с донорами Сравнение с пациентами с РПЖ до РПЭ Сравнение с пациентами с РПЖ через 1 нед после РПЭ
microRNA pairs Compared with donors Comparison with PCa patients before RP Comparison with PCa patients 1 week after RP
Подгруппа А Subgroup A 1,72 ± 0,48*** Н/р N/d Н/р N/d
miRNA-125b/660 Подгруппа Б Subgroup B -0,69 ± 0,43** -2,18 ± 1,14*** -1,99 ± 1,38***
Подгруппа В Subgroup C -3,82 ± 0,51*** -5,31 ± 1,14*** -5,12 ± 1,45***
miRNA-92a/660 Подгруппа А Subgroup A Н/о N/a -0,96 ± 1,14* Н/р N/d
Подгруппа Б Subgroup B -4,09 ± 1,39*** -4,90 ± 1,03*** -4,74 ± 1,76***
miRNA-200b/205 Подгруппа А Subgroup A Н/р N/d Н/р N/d -2,03 ± 1,37***
Подгруппа Б Subgroup B -2,72 ± 0,97*** -3,81 ± 1,79*** -4,93 ± 1,38***
miRNA-200b/660 Подгруппа А Subgroup A Н/р N/d _1 97 ± 1 29*** -1,28 ± 1,76*
Подгруппа Б Subgroup B -4,03 ± 1,05*** -5,90 ± 1,22*** -5,22 ± 1,62***
miRNA-205/660 Подгруппа А Subgroup A Н/р N/d Н/р N/d 1,13 ± 1,69*
Подгруппа Б Subgroup B -3,24 ± 1,28*** -4,01 ± 1,17*** -2,21 ± 1,72*
miRNA-19b/125b Подгруппа А Subgroup A 2,24 ± 1,31*** 2,60 ± 1,45*** 3,53 ± 2,02***
Подгруппа Б Subgroup B -2,05 ± 0,83*** -1,69 ± 1,04*** Н/р N/d
miRNA-144/378a Подгруппа А Subgroup A 1,23 ± 2,13*** 2,31 ± 2,93*** 4,73 ± 3,50***
Подгруппа Б Subgroup B Н/р N/d Н/р N/d Н/р N/d
miRNA-30e/31 Подгруппа А Subgroup A 2,10 ± 1,43*** Н/р N/d Н/р N/d
Подгруппа Б Subgroup B -1,84 ± 1,37*** -3,05 ± 2,04*** -3,67 ± 1,70***
Подгруппа А Subgroup A 3,86 ± 1,39*** 4,03 ± 2,89*** 4,09 ± 2,60***
miRNA-19b/378a Подгруппа Б Subgroup B Н/р N/d Н/р N/d Н/р N/d
Подгруппа В Subgroup C -3,73 ± 1,34*** -3,56 ± 2,62* -3,50 ± 2,54*
чт
сч о сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю ш и
Z <
>
а
<
о m X
о о
X а.
о;
Ii
m ш с; о Ж.
U >
*p <0,05. **p <0,01. ***p <0,001.
Примечание. В подгруппу А включены больные РПЖ, у которых уровень относительной экспрессии пары микроРНКчерез 3 мес после РПЭ достоверно превышал таковой у больных подгруппы Б. В подгруппу Б вошли пациенты с РПЖ, у которых относительная экспрессия пары микроРНК через 3 мес после РПЭ достоверно превышала таковую у пациентов подгруппы В. H/р — нет достоверных различий.
Note. Subgroup A includes PCa patients, whose relative expression 3 months after RP significantly exceeds that in patients of Subgroup B. Subgroup B includes PCa patients, whose relative expression 3 months after RP significantly exceeds that in patients of subgroup C. N/d — no significant differences.
чт
сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а. те
о ж.
и >
у доноров, при этом направленность различий соответствовала различиям между донорами и больными до РПЭ. К таким микроРНК относятся пары miRNA-425/19Ь, -31/200Ь, -31/125Ь, -31/660, -92а/660, -22-3р/125Ь, -22-3р/378а, -200Ь/205, -200Ь/660, -205/660.
Через 1 год после РПЭ у 2 больных РПЖ уровень ПСА плазмы крови превышал 1,25 нг/мл, что свидетельствует о неблагоприятном прогнозе. Более того, у 1 из этих пациентов через 1 год после операции были обнаружены вторичные изменения в тазовых лимфатических узлах. По значениям уровней относительной экспрессии пар miRNA-22-3p/378a, -22-3р/125Ь, -22-3р/144, -30е/125Ь, -30е/144, -31/660, -92а/660, -200Ь/205, -200Ь/660,-205/660,-144/378а,-19Ь/378а эти больные вошли в подгруппу пациентов, уровни относительной экспрессии микроРНК ВВ мочи которых достоверно отличались от данного показателя у доноров (табл. 3). В другую подгруппу, в которой относительная экспрессия вышеупомянутых пар микроРНК не отличалась от их экспрессии у доноров, вошли пациенты, у которых спустя 1 год после операции не были выявлены признаки рецидива и уровень ПСА не превышал 0,2 нг/мл (за исключением 2 больных, у которых данный показатель оказался равным 0,3 и 0,5 нг/мл). Относительная экспрессия этих пар микроРНК у доноров и пациента с изначально неблагоприятным прогнозом в связи с положительным хирургическим краем после операции, но без признаков рецидива через 1 год после операции не различалась.
В 4-ю группу пар микроРНК, относительная экспрессия которых не изменялась после РПЭ или не имела определенного паттерна ее изменения, вошли 30 пар микроРНК. Из них уровень экспрессии 11 пар микроРНК у пациентов ни до, ни после хирургического вмешательства не отличался от такового у доноров (см. табл. 2). В связи с этим можно полагать, что данные микроРНК не играют значительной роли в биологических процессах в ответ на РПЭ и малопригодны в качестве маркеров эффективности такого вида лечения РПЖ. Также в эту группу вошли 6 пар микроРНК, относительная экспрессия которых достоверно различалась у доноров и больных РПЖ до РПЭ (miRNA-30е/92а, -92а/200Ь (р <0,05)) или через 1 нед после нее (miRNA-19b/92a, -30е/425 (р 0,05)), -31/92а (р <0,01), -125Ь/205 (р <0,001). Однако устойчивых изменений относительной экспрессии через 3 мес после РПЭ не наблюдалось, поэтому данные пары микроРНК нельзя отнести к 1-й и 2-й группам.
С помощью критерия Спирмена была оценена корреляция уровней относительной экспрессии исследуемых микроРНК с клинико-патологическими характеристиками больных РПЖ: возрастом, уровнем ПСА, оценкой по шкале Глисона. Корреляция хотя бы с одним из клинических параметров выявлена для 20 пар микроРНК. При этом для пары miRNA-31/125b корреляция наибольшей силы наблюдалась с возра-
стом доноров (к = —0,67; р = 0,004), для пары miRNA-30е/660 - с уровнем ПСА (к = -0,63,р = 0,007) и для пары miRNA-22-3p/30e — с оценкой опухоли по шкале Глисона (к = 0,65; р = 0,004). Обнаруженная в большинстве остальных случаев корреляционная связь с возрастом пациентов была слабой или умеренной и не обладала высоким уровнем достоверности. Таким образом, относительная экспрессия выбранных для исследования микроРНК в малой степени зависит от возраста, что повышает привлекательность маркера для диагностики и прогноза эффективности терапии РПЖ. Выявлены корреляционные связи, р-уровни их значимости и коэффициенты корреляции Спирмена (табл. 4). Кроме того, выполнена оценка корреляционной связи между уровнем ПСА крови пациентов через 1 год после РПЭ и уровнями относительной экспрессии микроРНК до и после операции (табл. 5). Для 12 пар микроРНК обнаружена статистически значимая связь (как положительная, так и отрицательная) между уровнями ПСА через 1 год после операции и экспрессией микроРНК в одной из исследуемых временных точек.
обсуждение
Изменение уровня экспрессии каждой микроРНК в процессе лечения онкологических заболеваний и после хирургического вмешательства или курса противоопухолевой терапии зависит от того, как микроРНК вовлечена в канцерогенез и физиологические процессы. В многочисленных исследованиях показано, что экспрессия внеклеточных микроРНК при РПЖ значительно отличается от таковой у доноров, и измерение концентраций данных микроРНК в биологических жидкостях имеет диагностическую ценность [24—27]. Это согласуется с полученными в настоящей работе данными: выявлены 19 пар микроРНК, дифференциально экспрессированных у доноров и больных РПЖ до лечения. Проанализирован уровень относительной экспрессии микроРНК до РПЭ и через 1 нед и 3 мес после операции. Таким образом, выбраны точки изменения экспрессии микроРНК сразу после РПЭ (через 1 нед, в момент выписки) и через 3 мес, в момент первичной после хирургического вмешательства оценки клинических показателей пациента (таких как ПСА), что позволяет оценить раннюю предиктивную способность микроРНК и определить влияние побочных эффектов РПЭ (таких как воспаление) на изменение экспрессии микроРНК.
Известно, что РПЭ оказывает значительное влияние на экспрессию микроРНК и вызывает разнонаправленные изменения уровней их относительной экспрессии [12—13, 16]. Как следует из представленных результатов, наибольший интерес представляет 1-я группа микроРНК, уровень относительной экспрессии которых изменялся по направлению к таковому у здоровых доноров (miRNA-92a/375, -125Ь/375, -205/375, -19Ь/200Ь,-30е/205,-30е/660).
Таблица 4. Корреляционные связи уровней относительной экспрессии микроРНК с клинико-патологическими характеристиками пациентов до радикальной простатэктомии
Table 4. Correlation between relative micro RNA expression and patient clinical and pathological characteristics prior to radical prostatectomy
Пара микроРНК Возраст Связь P Уровень простатического специфического антигена Связь Р Оценка по шкале Глисона Связь Р
Correlation Correlation
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
miRNA-19/30e 0,123 Слабая Weak 0,637 0,394 Умеренная Moderate 0,117 0,03 Нет связи No correlation 0,908
miRNA-19/31 0,357 Умеренная Moderate 0,16 -0,3 Слабая Weak 0,242 0,011 Нет связи No correlation 0,966
miRNA-19b/92a 0,021 Нет связи No correlation 0,938 -0,404 Умеренная Moderate 0,107 -0,161 Слабая Weak 0,538
miRNA-19b/l 25b -0,136 Слабая Weak 0,604 -0,36 Умеренная Moderate 0,156 -0,238 Слабая Weak 0,358
miRNA-19b/200b 0,04 Нет связи No correlation 0,877 -0,311 Умеренная Moderate 0,224 0,072 Нет связи No correlation 0,784
miRNA-19b/205 0,149 Слабая Weak 0,568 -0,492 Умеренная Moderate 0,045* -0,094 Нет связи No correlation 0,719
miRNA-19b/375 0,037 Нет связи No correlation 0,888 -0,209 Слабая Weak 0,421 -0,044 Нет связи No correlation 0,866
miRNA-19b/660 0,095 Нет связи No correlation 0,718 -0,589 Заметная Significant 0,013* -0,105 Слабая Weak 0,688
miRNA-30e/31 0,178 Слабая Weak 0,493 -0,341 Умеренная Moderate 0,181 0,111 Слабая Weak 0,672
miRNA-30e/92a -0,098 Нет связи No correlation 0,708 -0,449 Умеренная Moderate 0,071 -0,066 Нет связи No correlation 0,8
miRNA-30e/125b -0,207 Слабая Weak 0,425 -0,486 Умеренная Moderate 0,048* -од Нет связи No correlation 0,703
miRNA-30e/200b 0,117 Слабая Weak 0,655 -0,337 Умеренная Moderate 0,186 0,188 Слабая Weak 0,469
miRNA-30e/205 -0,162 Слабая Weak 0,535 -0,492 Умеренная Moderate 0,045* -0,039 Нет связи No correlation 0,883
miRNA-30e/375 -0,025 Нет связи No correlation 0,925 -0,316 Умеренная Moderate 0,217 0,022 Нет связи No correlation 0,933
miRNA-30e/660 -0,151 Слабая Weak 0,563 -0,627 Заметная Significant 0,007** -0,1 Нет связи No correlation 0,703
ON -J
miRNA-31/92a
miRNA-31/125b
miRNA-31/200b
miRNA-31/205
miRNA-31/375
miRNA-31/660
miRNA-92a/125b
niiRNA-92a/200b
miRNA-92a/205
miRNA-92a/375
miRNA-92a/660
miRNA-125b/200b
miRNA-125b/205
miRNA-125b/375
miRNA-125b/660
miRNA-200b/205
miRNA-200b/375
-0,666 -0,107 -0,25 -0,186 -0,455 -0,171 0,342 0,179 -0,235 0,14 0,464 0,308 0,098 0,263 -0,108 -0,114
Заметная Significant
Заметная Significant
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Умеренная Moderate
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
0,004** 0,683 0,334 0,474 0,067 0,512 0,179 0,493 0,363 0,593 0,061 0,229 0,709 0,308 0,679 0,663
-0,074 -0,012 -0,262 -0,143 -0,525 0,173 0,286 -0,25 -0,149 -0,272 0,082 -0,272 -0,167 -0,412 -0,202 -0,16
Умеренная Moderate
Нет связи
No correlation
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Заметная Significant
Слабая Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Нет связи
No correlation
Слабая Weak
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Слабая
Weak
0,226 0,778 0,963 0,31 0,585 0,031* 0,506 0,265 0,334 0,569 0,291 0,753 0,292 0,521 0,101 0,438 0,54
8 9
-0,432 Умеренная
Moderate
-0,343 Умеренная
Moderate
0,083 Нет связи
No correlation
-0,304 Умеренная
Moderate
Слабая
-0,177 Weak
Слабая
-0,299 Weak
Слабая
-0,127 Weak
0,387 Умеренная
Moderate
0,011 Нет связи
No correlation
0,044 Нет связи
No correlation
0,055 Нет связи
No conelation
0,393 Умеренная
Moderate
-0,017 0,077 -0,022 -0,221 -0,183
Продолжение табл. 4 Continuation of table 4 10
0,083 0,177 0,751 0,235 0,496 0,244 0,626 0,124 0,966 0,866 0,833 0,119 0,95 0,768 0,933 0,393 0,483
Нет связи
No correlation
Нет связи
No correlation
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Слабая Weak
Продолжение табл. 4 Continuation of table 4
I miRNA- 2 0 Ob/66 0 2 -0,267 3 Слабая Weak 4 0,301 5 -0,35 6 Умеренная Moderate 7 0,168 8 -0,271 9 Слабая Weak 10 0,292
miRNA-205/375 -0,064 Нет связи No correlation 0,808 0,113 Слабая Weak 0,666 0,094 Нет связи No correlation 0,719
miRNA-205/660 -0,099 Нет связи No correlation 0,705 0,086 Нет свя зи No correlation 0,743 0,194 Слабая Weak 0,456
miRNA-375/660 0,252 Слабая Weak 0,33 -0,011 Нет связи No correlation 0,966 0,089 Нет связи No correlation 0,735
miRNA-19b/22 - 3p 0,077 Нет связи No correlation 0,769 0,052 Нет связи No correlation 0,844 -0,387 Умеренная Moderate 0,124
miRNA-19b/30e 0,389 Умеренная Moderate 0,122 -0,031 Нет свя зи No correlation 0,907 0,471 Умеренная Moderate 0,056
miRNA- 19b/144 -0,2 Слабая Weak 0,442 -0,039 Нет связи No correlation 0,881 -0,426 Умеренная Moderate 0,088
miRNA-19b/222 -0,199 Слабая Weak 0,445 -0,397 Умеренная Moderate 0,115 -0,365 Умеренная Moderate 0,149
miRNA-19b/378a -0,368 Умеренная Moderate 0,146 -0,29 Слабая Weak 0,259 -0,332 Умеренная Moderate 0,193
miRNA-19b/425 -0,108 Слабая Weak 0,681 -0,304 Умеренная Moderate 0,236 -0,017 Нет связи No correlation 0,95
miRNA-19Ь/12 5b 0,036 Нет связи No correlation 0,89 0,018 Нет связи No correlation 0,946 0,127 Слабая Weak 0,626
miRNA-22-3p/30e 0,252 Слабая Weak 0,33 -0,012 Нет связи No correlation 0,963 0,653 Заметная Significant 0,004**
miRNA-22-3p/144 -0,488 Умеренная Moderate 0,047* -0,22 Слабая Weak 0,396 -0,304 Умеренная Moderate 0,235
miRNA-22-3p/222 -0,325 Умеренная Moderate 0,204 -0,514 Заметная Significant 0,035* -0,127 Слабая Weak 0,626
miRNA-22-3p/378a -0,49 Умеренная Moderate 0,046* -0,493 Умеренная Moderate 0,045* -0,15 Слабая Weak 0,567
miRNA- 2 2 - 3p/42 5 0,015 Нет связи No correlation 0,955 -0,114 Слабая Weak 0,662 0,52 Заметная Significant 0,032*
Окончание табл. 4
End of table 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
miRNA-22-3p/125b -0,045 Нет связи No correlation 0,864 0,059 Нет связи No correlation 0,822 0,487 Умеренная Moderate 0,047*
miRNA-30e/144 -0,406 Умеренная Moderate 0,106 -0,049 Нет связи No correlation 0,851 -0,559 Заметная Significant 0,020*
miRNA-30e/222 -0,399 Умеренная Moderate 0,112 -0,247 Слабая Weak 0,339 -0,559 Заметная Significant 0,020*
miRNA-30e/378a -0,552 Заметная Significant 0,021* -0,209 Слабая Weak 0,421 -0,465 Умеренная Moderate 0,06
miRNA-30e/425 -0,489 Умеренная Moderate 0,046* -0,145 Слабая Weak 0,579 -0,57 Заметная Significant 0,017*
miRNA-30e/125b -0,356 Умеренная Moderate 0,161 0,135 Слабая Weak 0,605 -0,238 Слабая Weak 0,358
miRNA-144/222 -0,045 Нет связи No correlation 0,865 -0,323 Умеренная Moderate 0,206 0,028 Нет связи No correlation 0,916
miRNA- miRNA-L44/378a 0,063 Нет связи No correlation 0,812 -0,215 Слабая Weak 0,407 0,094 Нет связи No correlation 0,719
miRNA-144/425 0,11 Слабая Weak 0,675 0,058 Нет связи No correlation 0,826 0,559 Заметная Significant 0,020*
miRNA-144/125b 0,199 Слабая Weak 0,443 0,101 Слабая Weak 0,7 0,459 Умеренная Moderate 0,064
miRNA-222/378a -0,131 Слабая Weak 0,616 0,119 Слабая Weak 0,649 0,1 Нет связи No correlation 0,704
miRNA-222/425 0,143 Слабая Weak 0,583 0,188 Слабая Weak 0,47 0,393 Умеренная Moderate 0,119
miRNA-222/125b -0,102 Слабая Weak 0,696 0,199 Слабая Weak 0,443 0,233 Слабая Weak 0,369
miRNA-378a/425 0,508 Заметная Significant 0,037* 0,253 Слабая Weak 0,327 0,459 Умеренная Moderate 0,064
miRNA-378a/125b 0,388 Умеренная Moderate 0,124 0,391 Умеренная Moderate 0,121 0,266 Слабая Weak 0,303
miRNA-425/125b 0,139 Слабая Weak 0,595 0,199 Слабая Weak 0,444 0,061 Нет связи No correlation 0,816
*p <0,05. **p <0,01. ***p <0,001.
Примечание. Здесь и в табл. 5: цветом выделены достоверные различия. Note. Here and in Table 5: color shows significant differences.
Таблица 5. Корреляционные связи внеклеточных везикул мочи пациентов с раком предстательной железы с уровнями относительной экспрессии микроРНК до и после радикальной простатэктомии (РПЭ) Table 5. Correlations between utinaty extracellular vesicles in patients with prostate cancer and relative microRNA expression levels before and after radical prostatectomy (RP)
Пара микроРНК До РПЭ Связь P После РПЭ Связь P Через 3 мес после РПЭ ■мщмяняя Связь Р
Before RP orrelation Correlation Correlation
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
miRNA-19/30e -0,305 Умеренная Moderate 0,219 -0,266 Слабая Weak 0,302 0,356 Умеренная Moderate 0,192
miRNA-19/31 0,151 Слабая Weak 0,55 0,275 Слабая Weak 0,286 0,548 Заметная Significant 0,034*
miRNA-19b/92a 0,341 Умеренная Moderate 0,166 -0,075 Нет связи No correlation 0,775 0,535 Заметная Significant 0,040*
miRNA-19b/125b 0,236 Слабая Weak 0,347 0,168 Слабая Weak 0,519 0,422 Умеренная Moderate 0,117
miRNA-19b/200b 0,11 Слабая Weak 0,664 0,193 Слабая Weak 0,459 0,572 Заметная Significant 0,026*
miRNA-19b/205 0,352 Умеренная Moderate 0,151 0,224 Слабая Weak 0,387 -0,213 Слабая Weak 0,446
miRNA-19b/375 0,458 Умеренная Moderate 0,056 0,221 Слабая Weak 0,395 0,494 Умеренная Moderate 0,061
miRNA-19b/660 0,153 Слабая Weak 0,545 0,183 Слабая Weak 0,483 -0,252 Слабая Weak 0,364
miRNA-30e/31 0,396 Умеренная Moderate 0,104 0,369 Умеренная Moderate 0,145 0,379 Умеренная Moderate 0,163
miRNA-30e/92a 0,366 Умеренная Moderate 0,136 -0,018 Нет связи No correlation 0,944 0,193 Слабая Weak 0,49
miRNA-30e/125b 0,518 Заметная Significant 0,028* 0,436 Умеренная Moderate 0,081 0,222 Слабая Weak 0,426
miRNA-30e/200b 0,385 Умеренная Moderate 0,114 0,386 Умеренная Moderate 0,126 0,191 Слабая Weak 0,494
miRNA-30e/205 0,446 Умеренная Moderate 0,063 0,196 Слабая Weak 0,45 -0,608 Заметная Significant 0,016*
miRNA-30e/375 0,438 Умеренная Moderate 0,069 0,405 Умеренная Moderate 0,107 0,206 Слабая Weak 0,462
miRNA-30e/660 0,255 Слабая Weak 0,308 0,319 Умеренная Moderate 0,212 -0,49 Умеренная Moderate 0,064
miRNA-31/92a
miRNA-31/125b
miRNA-31/200b
niiRNA-31/205
miRNA-31/375
miRNA-31/660
miRNA-92a/125b
miRNA-92a/200b
miRNA-92a/205
miRNA-92a/375
miRNA-92a/660
miRNA-125b/200b
miRNA-125b/205
miRNA-125b/375
miRNA-125b/660
miRNA-200b/205
miRNA-200b/375
0,047 -0,182 0,278 0,416 -0,025 -0,197 -0,316 0,219 0,398 -0,172 -0,321 0,332 0,365 -0,099 0,347 0,384
Нет связи No correlation
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Нет связи No correlation
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Умеренная
Moderate
Умеренная
Moderate
Нет связи No correlation
Умеренная
Moderate
Умеренная
Moderate
0,855 0,47 0,264 0,086 0,922 0,433 0,201 0,383 0,102 0,496 0,194 0,179 0,137 0,695 0,158 0,115
0,004 0,161 -0,07 0,166 -0,109 0,361 0,473 0,277 0,456 0,32 0,071 -0,007 0,229 0,039 -0,06 0,183
Умеренная
Moderate
Нет связи
No correlation
Слабая Weak
Нет связи
No correlation
Слабая Weak
Слабая
Weak
Умеренная Moderate
Умеренная
Moderate
Слабая Weak
Умеренная
Moderate
Умеренная
Moderate
Нет связи
No correlation
Нет связи No correlation
Слабая
Weak
Нет связи No correlation
Нет связи
No correlation
Слабая Weak
Продолжение табл. 5
Continuation of table 5 10
0,089 -0,394 Умеренная 0,146
Moderate
0,989 -0,322 Умеренная 0,242
Moderate
0,538 -0,474 Умеренная 0,074
Moderate
0,79 -0,463 Умеренная 0,082
Moderate
0,525 -0,025 Нет свя зи 0,929
No correlation
0,677 -0,522 Заметная 0,046*
Significant
0,155 0,107 Слабая 0,703
Weak
0,055 0,131 Слабая 0,642
Weak
0,282 -0,547 Заметная 0,035*
Significant
0,066 0,168 Слабая 0,549
Weak
0,21 -0,422 Умеренная 0,117
Moderate
0,786 -0,116 Слабая 0,68
Weak
0,978 -0,581 Заметная 0,023*
Significant
0,376 0,089 Нет свя зи 0,751
No correlation
0,881 -0,497 Умеренная 0,06
Moderate
0,819 -0,615 Заметная 0,015*
Significant 1
0,483 0,073 Нет связи 0,795
No correlation
A
n
m -o
£
> ь
o~
X
>
io
О
—i >
—I
SO
m
X
"D
m
£ m Z
—( >
i—
JO m -o
О
to
О 2:
< О
1 miRNA-200b/660 2 0,267 3 Слабая Weak 4 0,285
miRNA-205/375 0,245 Слабая Weak 0,327
miRNA-205/660 -0,217 Слабая Weak 0,387
miRNA-375/660 -0,368 Умеренная Moderate 0,133
miRNA-19b/22-3p 0,228 Слабая Weak 0,362
miRNA-19b/30e 0,389 Умеренная Moderate 0,111
miRNA-19b/144 0,13 Слабая Weak 0,607
miRNA-19b/222 0,094 Нет связи No correlation 0,711
miRNA-19b/378a 0,312 Умеренная Moderate 0,208
miRNA-19b/425 0,475 Умеренная Moderate 0,046*
miRNA-19Ь/125b 0,057 Нет связи No correlation 0,823
miRNA-22-3p/30e 0,1 Слабая Weak 0,692
miRNA-22-3p/144 0,155 Слабая Weak 0,539
miRNA-22-3p/222 -0,182 Слабая Weak 0,47
miRNA-22-3p/378a 0,116 Слабая Weak 0,648
miRNA-22-3p/425 0,365 Умеренная Moderate 0,137
miRNA-22-3p/125t > -0,147 Слабая Weak 0,561 усп1
■I
7
8
IB
0,01 0,202 0,01 -0,175 0,266 0,058 -0,4 0,048 0,235 0,078 0,116 -0,284 -0,416 -0,298 -0,242 -0,332 -0,33
Нет связи
No correlation
Слабая Weak
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Слабая Weak
Нет связи No correlation
Умеренная Moderate
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Нет связи
No correlation
Слабая Weak
Слабая Weak
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Умеренная Moderate
Умеренная Moderate
0,97 0,436 0,97 0,501 0,302 0,826 0,112 0,855 0,363 0,765 0,656 0,268 0,097 0,245 0,35 0,193 0,196
-0,476 0,53 -0,084 -0,42 -0,077 0,233 0,134 0,222 0,261 0,159 0,252 0,068 0,068 0,098 0,463 0,2 0,234
Умеренная Moderate
Заметная
Significant
Нет связи
No correlation
Умеренная
Moderate
Нет связи No correlation
Слабая Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Слабая Weak
Слабая Weak
Слабая
Weak
Нет связи
No correlation
Нет связи
No correlation
Нет связи No correlation
Умеренная Moderate
Слабая Weak
Слабая
Weak
Продолжение табл. 5 Continuation of table 5 . 10
0,073 0,042* 0,766 0,119 0,785 0,404 0,634 0,427 0,347 0,571 0,364 0,81 0,81 0,727 0,082 0,474 0,401
Окончание табл. 5 End of table 5
■
1
■ I
miRNA-30e/144 0,034
miRNA-30e/222 -0,181
miRNA-30e/378a 0,077
miRNA-30e/425 0,262
miRNA-30e/125b -0,361
miRNA-144/222 -0,273
miRNA-144/378a -0,204
mi RNA-144/425 0,311
miRNA-144/125b -0,208
miRNA-222/378a 0,338
miRNA-222/425 0,342
miRNA-222/125b -0,216
miRNA-378a/425 0,22
miRNA-378a/125b -0,319
miRNA-425/125b -0,615
*p <0,05. **p <0,01. ***p <0,001.
Пет связи No correlation
Слабая Weak
Нет связи No correlation
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Слабая Weak
Умеренная Moderate
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Умеренная Moderate
Слабая Weak
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Заметная
Significant
4
8
0,893 0,473 0,76 0,293 0,142 0,274 0,418 0,209 0,408 0,17 0,165 0,389 0,38 0,197 0,007**
-0,362 0,025 0,091 0,061 0,079 0,291 0,321 0,346 0,374 0,291 -0,114 0,09 -0,207 -0,256 0,021
Умеренная
Moderate
Нет связи No correlation
Нет связи No correlation
Нет связи
No correlation
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Умеренная Moderate
Умеренная Moderate
Умеренная
Moderate
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Нет связи No correlation
Слабая Weak
Слабая
Weak
Нет связи
No correlation
0,154
0,926
0,729
0,815
0,764
0,258
0,209
0,174
0,139
0,258
0,663
0,733
0,425
0,321
0,937
0,009 0,174 0,327 0,131 0,204 0,213 0,404 0,379 0,057 0,51 0,029 0,156 -0,306 -0,404 0,054
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Умеренная Moderate
Слабая Weak
Слабая
Weak
Слабая
Weak
Умеренная
Moderate
Умеренная Moderate
Нет связи No correlation
Заметная
Significant
Нет связи
No correlation
Слабая
Weak
Умеренная Moderate
Умеренная Moderate
Нет связи
No correlation
10
0,975
0,536 0,234 0,643 0,466 0,446 0,136 0,164 0,839 0,052 0,919 0,58 0,268 0,135 0,849
На основании данных об относительной экспрессии 19 пар микроРНК (3-я группа; см. рис. 2, в) через 3 мес после РПЭ больных можно разделить на подгруппы. Особый интерес с точки зрения поиска маркеров возможного развития рецидива представляют те пары микроРНК, относительная экспрессия которых у одной подгруппы пациентов через 3 мес достоверно отличается от данного показателя у доноров, при этом направленность различий соответствует различиям между донорами и больными до РПЭ. К таким парам микроРНК относятся пары miRNA-425/19b, -31/200Ь, -31/125Ь,-31/660,-92а/660,-22-3р/125Ь,-22-3р/378а, -200Ь/205, -200Ь/660 и -205/660. Значимость выбранных пар микроРНК подтверждает тот факт, что пациенты с БХР и метастазами попадают в подгруппу микроРНК, экспрессия которых достоверно отличается от таковой у доноров. Анализ динамики уровня ПСА в течение 1 года после РПЭ показал, что у больных с БХР его повышение наблюдается позднее (через 6 или 9 мес после РПЭ), чем изменения в экспрессии микроРНК (через 3 мес после РПЭ). Это позволяет предположить большой потенциал микроРНК в качестве ранних маркеров развития рецидива. В подгруппу БХР попадали также 6 пациентов (в зависимости от анализируемой пары микроРНК), у которых не был выявлен рецидив через 1 год после операции. Тем не менее 1-летний срок наблюдения не является окончательным, и для того чтобы понять, разовьется ли рецидив или наступит длительная ремиссия, необходимо дальнейшее наблюдение в течение 2—5 лет.
В то же время, хотя 1-я и 3-я группы пар микроРНК обладают более высоким потенциалом в качестве диагностических маркеров, 5 пар микроРНК, относительная экспрессия которых изменилась после РПЭ не по направлению к значениям здоровых доноров (2-я группа), также представляют интерес. В отличие от остальных групп пар микроРНК, во 2-ю группу согласно выбранным критериям не вошли диагностически перспективные микроРНК, уровень экспрессии которых достоверно различался у доноров и больных РПЖ до РПЭ. Эти пары микроРНК также могут быть потенциальными прогностическими маркерами, хотя они и не обладают значимостью в качестве диагностических маркеров. Точно так же больные РПЖ после РПЭ, даже находящиеся в длительной ремиссии, не тождественны здоровым донорам, и, естественно, это накладывает отпечаток на профиль экспрессии микроРНК. В качестве примера можно привести miR-320a, -320Ь, -320с, уровень экспрессии которых в плазме крови больных после РПЭ увеличивался у пациентов без рецидива заболевания и не изменялся у пациентов с БХР, в то время как у доноров он ниже по сравнению с больными РПЖ до РПЭ [28].
Что касается 4-й группы, включающей в себя 30 пар микроРНК, анализ экспрессии которых не выявил устойчивых изменений после РПЭ, то, по-видимому,
они малопригодны для оценки эффективности хирургического лечения РПЖ.
Полученные результаты согласуются с данными литературы. Например, ранее была показана онкосу-прессорная роль ряда исследованных микроРНК. В частности, продемонстрировано, что экспрессия miRNA-205 в клетках опухоли предстательной железы снижена по сравнению со здоровыми тканями, что ассоциировано с активным ростом и делением клеток, а также метаста-зированием опухоли [29]. Для miRNA-19b и miRNA-92a, входящих в один кластер miR-17-92a [30], miRNA-30e [31], miRNA-200b [26], также показана онкосупрессор-ная роль. Так, известно, что miRNA-200b является ингибитором процессов клеточного роста, метастазиро-вания и эпителиально-мезенхимального перехода. Кроме того, низкая экспрессия miRNA-200b ассоциирована с возникновением БХР [26]. В настоящем исследовании относительная экспрессия miRNA-30e была снижена у больных РПЖ по сравнению с донорами во всех анализируемых парах, а экспрессия miR-200b, 205 и -92а — в большинстве случаев. Обнаружено, что после РПЭ повышается уровень экспрессии miRNA-205 (в составе всех анализируемых пар) и miRNA-30e (в большинстве случаев), в то время как уровень относительной экспрессии miRNA-200b снижается сразу после РПЭ, но повышается до уровня у здоровых доноров через 3 мес после операции. Таким образом, полученные в настоящей работе данные подтверждают онкосупрессорную роль данных микроРНК.
Что касается miRNA-92a и miRNA-19b, то невозможно выявить доминирующее направление изменения их экспрессии после РПЭ. Вероятно, уровень относительной экспрессии этих микроРНК в меньшей степени, чем других, зависит от операции, и динамика изменения экспрессии пар микроРНК, в состав которых входят miRNA-92a и miRNA-19b, определяется второй микроРНК в каждой паре. Тем не менее спустя 3 мес после РПЭ относительная экспрессия miRNA-19b, -30е, -92a, -200Ь и -205 в составе формируемых ими пар соответствует таковой у доноров, а уровни относительной экспрессии пар, в состав которых входит miRNA-375, демонстрируют тенденцию к приближению к значениям доноров. Это свидетельствует о значительном потенциале пар, в которые входят эти микроРНК, в качестве прогностических маркеров.
Напротив, miRNA-375, по-видимому, является онкогенной микроРНК, поскольку ее повышенная экспрессия положительно коррелирует с большим риском развития БХР. Действительно, обнаружено, что высокий уровень экспрессии данной микроРНК ассоциирован с метастатическим РПЖ и более агрессивной формой рака [32]. В настоящем исследовании также обнаружен повышенный уровень экспрессии miRNA-375 у больных РПЖ во всех анализируемых парах. Кроме того, пары, в состав которых входит эта микроРНК, демонстрировали достоверное снижение экспрессии
чг
сч О сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а.
в;
о ж.
и >
чт
сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а. те
о ж.
и >
после выполнения РПЭ (см. табл. 2). По-видимому, miRNA-375 играет большую роль в развитии РПЖ, и поэтому ее экспрессия значительно снижается через 1 нед после РПЭ. Более того, уровень относительной экспрессии всех пар микроРНК, сформированных при участии miRNA-375, у больных РПЖ через 3 мес после РПЭ не совпадает с уровнем экспрессии доноров, наблюдается лишь тенденция к такому соответствию, которое, вероятно, наступает позднее, т. е. уровень относительной экспрессии miRNA-375 остается аберрантным в течение более длительного времени.
Показано, что miRNA-144 способствует подавлению роста опухоли, а также препятствует метастазированию, т. е. играет онкосупрессорную роль [33]. Сверхэкспрессию miRNA-425, напротив, связывают с метастазирова-нием РПЖ и неблагоприятным прогнозом [34]. В настоящем исследовании наблюдалась пониженная относительная экспрессия обеих этих микроРНК (miRNA-144 и miRNA-425) у больных РПЖ по сравнению с донорами, которая повышалась после РПЭ. В отношении miRNA-378a и miRNA-125b в литературе представлены противоречивые сведения: в различных исследованиях показаны как онкосупрессорные функции данных микроРНК [35, 36], так и онкогенные [37, 38]. В настоящей работе уровень экспрессии этих микроРНК у больных РПЖ был выше, чем у доноров, а после РПЭ он мог как снижаться, так и немного повышаться, в зависимости от второй микроРНК в паре, т. е. решающее влияние оказывала вторая микроРНК (не miRNA-378a или miRNA-125b) в соотношении.
Исследования, посвященные изучению функций miRNA-22-3p, miRNA-31 и miRNA-660 в канцерогенезе, выполнялись в основном в отношении видов онкологических заболеваний, в частности рака молочной железы и легких. Тем не менее показано, что miRNA-22-3p подавляет рост опухоли при раке молочной железы [39], низкая экспрессия miRNA-31 ассоциирована с развитием рака молочной железы [40], а повышенная экспрессия miRNA-660 способствует росту опухоли при раке легких и метастазированию в кости in vivo [41]. Экстраполяция данных литературы и их сравнение с результатами нашей работы позволяют сделать вывод, что эти микроРНК оказывают аналогичное действие на канцерогенез предстательной железы, поскольку в настоящем исследовании относительная экспрессия miRNA-660 оказалась повышенной у больных РПЖ по сравнению с донорами, а miRNA-22-3p и miRNA-31, напротив, в большинстве случаев — пониженной. После РПЭ уровни относительной экспрессии miRNA-22-3p и miRNA-660 уменьшались, а экспрессия miRNA-31 усиливалась, т. е. наблюдаемое изменение относительной экспрессии miRNA-22-3p противоречит ожидаемому. Тем не менее это, скорее, связано с постоперационными процессами, поскольку не выявлена достоверная разница относительной экспрессии большинства пар микроРНК, в состав которых входит miRNA-22-3p,
у пациентов с РПЖ спустя 3 мес после РПЭ и у доноров, т. е. эти пары микроРНК через 3 мес после операции экспрессируются также, как у здоровых доноров.
Корреляционный анализ показал, что относительная экспрессия исследованных микроРНК, возраст, уровень ПСА и стадия опухолевого процесса характеризуются либо отсутствием, либо слабой корреляционной зависимостью. Это свидетельствует о возможности использования сочетанного анализа ПСА и экспрессии микроРНК для оценки эффективности терапии. Наибольшее количество пар микроРНК, уровень относительной экспрессии которых коррелировал с уровнем ПСА через 1 год после РПЭ, обнаружено через 3 мес после операции (9 пар). Устойчивой (сохраняющейся при анализе двух временных точек) корреляции между уровнем относительной экспрессии исследованных микроРНК и уровнем ПСА не выявлено, что, по-видимому, связано с тем, что на уровень экспрессии микроРНК через 1 нед после операции в значительной мере оказывают влияние процедура хирургического вмешательства и сопровождающие ее побочные эффекты, в том числе воспаление. В связи с этим анализ относительной экспрессии микроРНК через 3 мес после РПЭ представляется более информативным с точки зрения предсказания развития БХР и/или клинического рецидива. Кроме того, исследованная группа больных РПЖ была довольно однородной по уровню ПСА плазмы крови через 1 год после РПЭ, что затрудняет поиск возможных корреляций.
заключение
Анализ динамики экспрессии 60 пар микроРНК (14 различных микроРНК) в составе ВВ мочи больных РПЖ после РПЭ (до, через 1 нед и 3 мес после операции) показал, что уровень относительной экспрессии после хирургического вмешательства достоверно изменялся у 44 из исследованных пар. Выявлены пары микроРНК, дальнейший анализ относительной экспрессии которых наиболее перспективен с точки зрения оценки эффективности РПЭ. К ним относятся 2 группы пар микроРНК: 1) пары микроРНК, относительная экспрессия которых после операции достоверно изменялась в сторону таковой у здоровых доноров и соответствовала ей через 3 мес после лечения (miRNA-19b/miRNA-200b, -30е/205, -30е/660) или демонстрировала тенденцию к такому соответствию (miRNA-92a/miRNA-375, -125Ь/375, -205/375); 2) пары микроРНК, по уровню относительной экспрессии которых больные РПЖ разделялись на 2 (miRNA-19b/205, -425/19Ь, -22-3р/378а, -22-3р/125Ь, -22-3р/144, -30е/125Ь, -30е/144, -31/125Ь,-31/200Ь, -92а/660, -200Ь/205, -200Ь/660,-205/660, -19Ь/125Ь, -144/378а, -30е/31) или 3 (miRNA-19b/378a, -31/660, -125Ь/660) достоверно различающиеся подгруппы через 3 мес после РПЭ. Таким образом, анализ динамики относительной экспрессии микроРНК является перспективным подходом для разработки панелей для
диагностики РПЖ и оценки эффективности РПЭ. Тем не менее необходимы дополнительные исследования экспрессии этих микроРНК через 6 мес и спустя 1 год
после РПЭ, а также их ассоциации с клинико-патоло-гическими характеристиками и состоянием пациентов через 1, 2 года и 5 лет после операции.
чт
сч О сч
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Ferlay J., Colombet M., Soerjomataram I. et al. Cancer statistics for the year 2020: an overview. Int J Cancer 2021.
DOI: 10.1002/ijc.33588
2. Costello A.J. Considering the role of radical prostatectomy
in 21st century prostate cancer care. Nat Rev Urol 2020;17(3):177—88. DOI: 10.1038/s41585-020-0287-y
3. D'Amico A.V., Chen M.H., Roehl K.A. et al. Preoperative PSA velocity and the risk of death from prostate cancer after radical prostatectomy. N Engl J Med 2004;351(2):125-35.
DOI: 10.1056/NEJMoa032975
4. Porcaro A.B., Corsi P., Inverardi D. et al. Prostate-specific antigen associates with extensive lymph node invasion
in high-risk prostate cancer. Tumori 2018;104(4):307-11. DOI: 10.1177/0300891618765567
5. Karakiewicz P.I., Benayoun S., Kattan M.W. et al. Development and validation of a nomogram predicting the outcome of prostate biopsy based on patient age, digital rectal examination and serum prostate specific antigen. J Urol 2005;173(6):1930-4.
DOI: 10.1097/01.ju.0000158039.94467.5d
6. Bai X., Jiang Y., Zhang X. et al. The value of prostate-specific antigen-related indexes and imaging screening in the diagnosis of prostate cancer. Cancer Manag Res 2020;12:6821-6. DOI: 10.2147/CMAR.S257769
7. Pashaei E., Pashaei E., Ahmady M. et al. Meta-analysis of miRNA expression profiles for prostate cancer recurrence following radical prostatectomy. PLoS One 2017;12(6):e0179543.
DOI: 10.1371/journal.pone.0179543
8. Zhao Z., Stephan C., Weickmann S. et al. Tissue-based microRNAs as predictors of biochemical recurrence after radical prostatectomy: what can we learn from past studies? Int J Mol Sci 2017;18(10):2023. DOI: 10.3390/ijms18102023
9. Szilagyi M., Pos O., Marton É. et al. Circulating cell-free nucleic acids: main characteristics and clinical application. Int J Mol Sci 2020;21(18):6827. DOI: 10.3390/ijms21186827
10. Chen M., Zhao H. Next-generation sequencing in liquid biopsy: cancer screening and early detection. Hum Genomics 2019;13(1):34. DOI: 10.1186/s40246-019-0220-8
11. Wang J., Ni J., Beretov J. et al. Exosomal microRNAs as liquid biopsy biomarkers in prostate cancer. Crit Rev Oncol Hematol 2020;145:102860. DOI: 10.1016/j.critrevonc.2019.102860
12. Zedan A.H., Hansen T.F., Assenholt J. et al. Circulating miRNAs in localized/locally advanced prostate cancer patients after radical prostatectomy and radiotherapy. Prostate 2019;79(4):425-32. DOI: 10.1002/pros.23748
13. Konoshenko M.Y., Bryzgunova O.E., Lekchnov E.A. et al. The influence of radical prostatectomy on the expression of cell-free MiRNA. Diagnostics (Basel) 2020;10(8):600. DOI: 10.3390/diagnostics10080600
14. Bryzgunova O.E., Zaripov M.M., Skvortsova T.E. et al. Comparative study of extracellular vesicles from the urine of healthy individuals and prostate cancer patients. PLoS One 2016;11(6):e0157566. DOI: 10.1371/journal.pone.0157566
15. Koppers-Lalic D., Hackenberg M., de Menezes R. et al. Non-invasive prostate cancer detection by measuring miRNA variants (isomiRs) in urine extracellular vesicles. Oncotarget 2016;7(16):22566-78. DOI: 10.18632/oncotarget.8124
16. Konoshenko M.Y., Laktionov P.P. MiRNAs and radical prostatectomy: Current data, bioinformatic analysis and utility as predictors of tumour relapse. Andrology 2021;9(4):1092—107. DOI: 10.1111/andr.12994
17. Abramovic I., Ulamec M., Katusic Bojanac A. et al. miRNA in prostate cancer: challenges toward translation. Epigenomics 2020;12(6):543-58. DOI: 10.2217/epi-2019-0275
18. Casanova-Salas I., Rubio-Briones J., Fernandez-Serra A. et al. miRNAs as biomarkers in prostate cancer. Clin Transl Oncol 2012;14(11):803-11. DOI: 10.1007/s12094-012-0877-0
19. Filella X., Foj L. miRNAs as novel biomarkers in the management of prostate cancer. Clin Chem Lab Med 2017;55(5):715-36. DOI: 10.1515/cclm-2015-1073
20. Konoshenko M.Y., Lekchnov E.A., Bryzgunova O.E. et al. Isolation of extracellular vesicles from biological fluids via the aggregation-precipitation approach for downstream mirnas detection. Diagnostics (Basel) 2021;11(3):384. DOI: 10.3390/diagnostics11030384
21. Lekchnov E.A., Zaporozhchenko I.A., Morozkin E.S. et al. Protocol for miRNA isolation from biofluids. Anal Biochem 2016;499:78-84. DOI: 10.1016/j.ab.2016.01.025
22. Boeri M., Verri C., Conte D. et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(9):3713-8. DOI: 10.1073/pnas.1100048108
23. Landoni E., Miceli R., Callari M. et al. Proposal of supervised data analysis strategy of plasma miRNAs from hybridisation array data with an application to assess hemolysis-related deregulation. BMC Bioinformatics 2015;16:388. DOI: 10.1186/s12859-015-0820-9
24. Zheng H., Guo Z., Zheng X. et al. MicroRNA-144-3p inhibits cell proliferation and induces cell apoptosis in prostate cancer by targeting CEP55. Am J Transl Res 2018;10(8):2457-68.
25. Rana S., Valbuena G.N., Curry E. et al. MicroRNAs as biomarkers for prostate cancer prognosis: a systematic review and a systematic reanalysis of public data. Br J Cancer 2022;126(3):502-13.
DOI: 10.1038/s41416-021-01677-3
26. Katz B., Reis S.T., Viana N.I. et al. Comprehensive study of gene and microRNA expression related to epithelial-mesenchymal transition in prostate cancer. PLoS One 2014;9(11):e113700. DOI: 10.1371/journal.pone.0113700
27. Konoshenko M.Y., Lekchnov E.A., Bryzgunova O.E. et al. The panel of 12 cell-free microRNAs as potential biomarkers in prostate neoplasms. Diagnostics (Basel) 2020;10(1):38. DOI: 10.3390/diagnostics10010038
28. Lieb V., Weigelt K., Scheinost L. et al. Serum levels of miR-320 family members are associated with clinical parameters and diagnosis in prostate cancer patients. Oncotarget 2017;9(12):10402-16. DOI: 10.18632/oncotarget.23781
29. Guo Z., Lu X., Yang F. et al. The Expression of miR-205 in prostate carcinoma and the relationship with prognosis
in patients. Comput Math Methods Med 2022;2022:1784791. DOI: 10.1155/2022/1784791
30. Ottman R., Levy J., Grizzle W.E. et al. The other face of miR-17-92a cluster, exhibiting tumor suppressor effects in prostate cancer. Oncotarget 2016;7(45):73739-53. DOI: 10.18632/oncotarget.12061
31. Zheng X.M., Zhang P., Liu M.H. et al. MicroRNA-30e inhibits adhesion, migration, invasion and cell cycle progression of prostate
>-
(J О
—I
О и z о
ОС <
о ж
to
< >
а
<
о m
а.
в;
m
о ж.
U >
чт
сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
cancer cells via inhibition of the activation of the MAPK signaling pathway by downregulating CHRM3. Int J Oncol 2019;54(2):443-54. DOI: 10.3892/ijo.2018.4647
32. Nitusca D., Marcu A., Seclaman E. et al. Diagnostic value
of microRNA-375 as future biomarker for prostate cancer detection: a meta-analysis. Medicina (Kaunas) 2022;58(4):529. DOI: 10.3390/medicina58040529
33. Sun X.B., Chen Y.W., Yao Q.S. et al. MicroRNA-144 suppresses prostate cancer growth and metastasis by targeting EZH2. Technol Cancer Res Treat 2021;20:1533033821989817.
DOI: 10.1177/1533033821989817
34. Rode M.P., Silva A.H., Cisilotto J. et al. miR-425-5p as an exosomal biomarker for metastatic prostate cancer. Cell Signal 2021;87:110113. DOI: 10.1016/j.cellsig.2021.110113
35. Chen Q.G., Zhou W., Han T. et al. MiR-378 suppresses prostate cancer cell growth through downregulation of MAPK1 in vitro and in vivo. Tumour Biol 2016;37(2):2095-103.
DOI: 10.1007/s13277-015-3996-8
36. Sun D., Lee Y.S., Malhotra A. et al. miR-99 family of microRNAs suppresses the expression of prostate-specific antigen and prostate
cancer cell proliferation. Cancer Res 2011;71(4):1313—24. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-10-1031
37. Samami E., Pourali G., Arabpour M. et al. The potential diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in the assessment of patients with prostate cancer: rational and progress. Front Oncol 2022;11:716831. DOI: 10.3389/fonc.2021.716831
38. Shi X.B., Xue L., Ma A.H. et al. miR-125b promotes growth of prostate cancer xenograft tumor through targeting pro-apoptotic genes. Prostate 2011;71(5):538-49. DOI: 10.1002/pros.21270
39. Gorur A., Bayraktar R., Ivan C. et al. ncRNA therapy with miRNA-22-3p suppresses the growth of triple-negative breast cancer. Mol Ther Nucleic Acids 2021;23:930-43. DOI: 10.1016/j.omtn.2021.01.016
40. Abbas M.A., El Sayed I.E.T., Kamel Abdu-Allah A.M. et al. Expression of MiRNA-29b and MiRNA-31 and their diagnostic and prognostic values in Egyptian females with breast cancer. Noncoding RNA Res 2022;7(4):248-57. DOI: 10.1016/j.ncrna.2022.09.003
41. Ai C., Ma G., Deng Y. et al. Nm23-H1 inhibits lung cancer bone-specific metastasis by upregulating miR-660-5p targeted SMARCA5. Thorac Cancer 2020;11(3):640-50.
DOI: 10.1111/1759-7714.13308
< >
a
<
о m
Вклад авторов
Е.В. Шутко: проведение экспериментов, анализ и интерпретация данных, написание текста статьи;
М.Ю. Коношенко, О.Е. Брызгунова: разработка дизайна исследования, анализ и интерпретация данных, написание текста статьи; П.П. Лактионов: интерпретация данных, написание текста статьи;
И.А. Остальцев, С.В. Пак, С.Э. Красильников: сбор биоматериала, подбор групп больных и доноров, предоставление, анализ и интерпретация клинических данных. Authors' сontribution
E.V. Shutko: experiment conduction part, data analysis and interpretation, article writing;
M.Yu. Konoshenko, O.E. Bryzgunova: research design development, data analysis and interpretation, article writing; P.P. Laktionov: data interpretation, article writing;
I.A. Ostal'cev , S.V. Pak, S.E. Krasil'nikov: collection of biomaterial, selection of groups of patients and donors, provision, analysis and interpretation of clinical data.
£
О
ж.
ORCID авторов / ORCID authors
Е.В. Шутко / E.V. Shutko: https://orcid.org/0009-0004-3004-8969
О.Е. Брызгунова / O.E. Bryzgunova: https://orcid.org/0000-0003-3433-7261
С.В. Пак / S.V. Pak: https://orcid.org/0009-0009-6221-2758;
П.П. Лактионов / P.P. Laktionov: https://orcid.org/0000-0002-0866-0252
М.Ю. Коношенко / M.Yu. Konoshenko: https://orcid.org/0000-0003-2925-9350
U >
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (грант № 23-25-10026; https://rscf.ru/ project/23-25-10026) в рамках поддержанного Правительством Новосибирской области проекта 0000005406995998235120582 № р-45. Funding. The research was carried out at the expense of a grant from the Russian Science Foundation (grant No. 23-25-10026; https://rscf.ru/project/23-25-10026) within the framework of the project 0000005406995998235120582 supported by the Government of the Novosibirsk Region No. r-45.
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики
Протокол исследования одобрен этическим комитетом ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук» (протокол № 10 от 22 декабря 2008). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Compliance with patient rights and principles of bioethics
The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences (protocol No. 10, December 22, 2008). All patients gave written informed consent to participate in the study
Статья поступила: 27.06.2023. Принята к публикации: 12.02.2024. Article submitted: 27.06.2023. Accepted for publication: 12.02.2024.
