CC BY
62
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10905 УДК 633.14:631.53.02
ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ЗЕРНОВОК РЖИ И ЯЧМЕНЯ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОЙ ОБРАБОТКИ
О. М. СОБОЛЕВА12, кандидат биологических наук, доцент (e-mail: meer@yandex.ru)
кемеровский государственный сельскохозяйственный институт, ул. Марковцева, 5, Кемерово, 650056, Российская Федерация
2Кемеровский государственный медицинский университет, ул. Ворошилова, 22 а, Кемерово, 650056, Российская Федерация
Резюме. Многие представители микрофлоры зерна отрицательно влияют на его качество и безопасность, что отражается на здоровье потребителей, а также приводиткэкономическим потерям производителей и переработчиков. Альтернативой традиционным методам снижения микробной обсемененности (физическим, химическим и термическим) могут служить электрофизические способы, в частности, обработка в электромагнитном поле сверхвысокой частоты (СВЧ). В связи с этим изучали динамику численности микроорганизмов на поверхности зерна озимой ржи и ярового ячменя после СВЧ-обработки. Для создания искусственной контаминации поверхности зерна нарабатывали биомассу микромицетов родов Fusarium, Aspergillus и Penicillium на питательной среде Сабуро; бактерий Bacillus subtilis - на питательной средедля определения количества мезо-фильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ). После инокуляции зерно подсушивали и подвергали СВЧ-обработке при частоте магнетрона 2,45 ГГц, мощности 700 Вт, экспозиции 0, 5, 15,45 сек. Общая обсемененность составила для зерна ржи4,3-106 КОЕ/г, ячменя - 4,910s КОЕ/г. СВЧ-обработка при экспозиции 5 сек. существенно повышала количество бактерий Bacillus subtilis на зерне ржи в 165 раз - до 7,1-Ю3, на зерне ячменя - в 12,7 раза, до 6,1-107. Увеличение длительности до 15 сек. приводило к существенному снижению почти всехизучаемыхгрупп микроорганизмов относительно контроля в среднем на 98,81% для зерна ржи и на86,28% для зерна ячменя. Максимальный в опыте стерилизующий эффект отмечен при экспозиции 45 сек. - погибало 99,78...99,99 % от первоначального количества микроорганизмов. Выживаемость микроорганизмов на поверхности зерна ячменя была выше, чем на ржи; однако при выдержке 45 сек. она практически выравнивалась и составляла 9,310 КОЕ/г для ржи и 5,0-10 КОЕ/г для ячменя. Ключевые слова: электромагнитное поле, СВЧ, микрофлора, зерновые злаки, озимая рожь, яровой ячмень, выживаемость микроорганизмов.
Для цитирования: Соболева О. М. Динамика численности микроорганизмов на поверхности зерновокржи и ячменя после электромагнитной обработки //Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 9. С. 21-23. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10905.
Микробиологическое загрязнение поверхности и глубинных слоев зерна злаковых культур неоднородно и имеет такие разнообразные источники контаминации, как воздух, пыль, осадки, почва, насекомые, навоз животных, помет птиц. Обсеменение может происходить как во время роста и развития растения в течение всего вегетационного периода (эпифитные и фитопатоген-ные микроорганизмы), так и при уборке урожая, а также во время послеуборочной сушки и хранения [1].
Бактерии, составляющие спермосферу злаков, чаще всего принадлежат к семействам Pseudomonadaceae, Micrococcaceae, Lactobacillaceae и Bacillaceae. Зерно также может быть контаминировано патогенными и такими условно-патогенными видами бактерий, как Salmonella, Escherichia coli и др.
Нельзя не упомянуть и о наличии на поверхности зерна различных видов микромицетов, относимых к так называемым «полевым плесеням», преимущественно фитопа-
тогенным представителям родов Alternaria, Fusarium и др., а также «плесеням хранения» родов Aspergillus и Penicillium [2]. Многие из указанных микромицетов способны вызывать микозы и микотоксикозы людей, сельскохозяйственных животных и птицы из-за синтеза вторичных метаболитов -микотоксинов [3]. Традиционные методы снижения микробной обсемененности зерновых культур предусматривают физическую, термическую и химическую стерилизацию; реже фотоэнергетическое и биологическое воздействие [4]. Однако указанные методы могут негативно сказаться на качестве и функциональных свойствах вырабатываемых из зерна пищевых и фуражных продуктов [5]. При их использовании может быть не достигнута полная инактивация микотоксинов [6], в отличие от электрофизических методов обработки. Например, использование электромагнитного поля сверхвысокой частоты (ЭМП СВЧ) позволило разрушить афлатоксины и при этом сохранить качество обрабатываемого зерна [7]. Сохранение или улучшение показателей его качества после обработки ЭМП СВЧ также доказано в наших предыдущих работах [8, 9].
Цель работы - изучить динамику численности микроорганизмов на поверхности зерна ржи и ячменя после СВЧ-обработки.
Условия, материалы и методы. Для искусственной контаминации поверхности зерна нарабатывали биомассу микроорганизмов на соответствующих питательных средах. Накопление микромицетов родов Fusarium, Aspergillus и Penicillium проводили в чистых культурах на питательной среде Сабуро. Использовали накопительные культуры микромицетов, выделенные нами путем многократного изоляционного пересева на плотных питательных средах. Микромицеты культивировали при 25 °С в течение 5.. .7 суток до массового спороношения, которое определяли по приобретению характерной для каждого рода пигментации мицелия. Прямое микроскопирование изолятов не проводили, поскольку использовали своевременно перевиваемые и поддерживаемые в активном состоянии культуры, свободные от посторонних микроорганизмов.
Спорообразующие бактерии вида Bacillus subtilis культивировали на питательной среде для определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов - КМАФАнМ. Выращивали их в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч.
Накопление биомассы кишечной палочки Escherichia coli как представителя санитарно-показательной микрофлоры осуществляли на жидкой синтетической среде по рецептуре [10]. Выращивали ее в термостате при 37 °С в течение 24 ч, максимальная концентрация микробных тел в 1 мл составляла после этого 15.16 млрд.
В эксперименте использовали образцы зерна озимой ржи сорта Тетра короткая и ярового ячменя Авалон урожая 2017 г., выращенные в одинаковых эдафических условиях. Поверхность зерна не обрабатывали, сохраняя его естественную микрофлору. На каждые 100 г зерна в 3-х кратной повторности брали 1 г (мл) культуральной жидкости кишечной палочки и 1 мл суспензии сенной палочки и смешивали вручную. Затем добавляли по кусочку мицелия каждого вида микромицета с органами спороношения (вырезанные
стерильным скальпелем из агара блоки площадью 1 см2), снова перемешивали в асептических условиях. Разница в инокуляции объясняется консистенцией используемых для культивирования питательных сред (жидкая - для кишечной палочки, плотная - для сенной палочки и микромицетов). Клетки сенной палочки предварительно смывали с поверхности агара стерильной водой, полученную суспензию использовали для искусственной контаминации. Споры микромицетов не переводили в суспензию во избежание чрезмерного увлажнения поверхности зерновок, они хорошо прилипали на увлажненную после бактериальных суспензий поверхность зерна.
После этого остатки питательной среды удаляли, зерно подсушивали при комнатной температуре без попадания прямого солнечного света, обрабатывали ЭМП СВЧ и закладывали на хранение в течение недели в стерильные бумажные пакеты. Использовали следующие режимы воздействия электромагнитным полем: частота магнетрона -2,45 ГГц, мощность - 700 Вт, экспозиция - 0; 5; 15; 45 сек.
Количество микроорганизмов на поверхности зерна ржи и ячменя определяли общепринятыми чашечными методами с предварительным приготовлением разведений по ГОСТ ISO 21527-2-2013. Для учета числа спороо-бразующих бактерий и микромицетов посев проводили на поверхность питательной среды КМАФАнМ и Сабуро соответственно. Определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) осуществляли бродильным методом на средах Кесслера и Эндо. Продолжительность культивирования споровых бактерий и БГКП составляла 20.. .24 ч, микромицетов - 5.7 сут. (с просматриванием каждые сутки в зависимости от скорости роста мицелия).
Исследования проводили в 2018 г. Для каждого варианта зерна и режима ставили по 3 лабораторных эксперимента, в каждом варианте засевали по 3 чашки Петри для каждого показателя.
Результаты представлены в виде среднего арифметического в колониеобразующих единицах (КОЕ). Достоверность отличий, по сравнению с контролем, определяли по F-критерию при уровне значимости 0,05 (в таблицах достоверные различия обозначены знаком*).
Результаты и обсуждение. Искусственный инфекционный фон поверхности зерна складывался из комплекса экзогенных и аутохтонных микромицетов и бактерий. Неидентифицированные микромицеты, выявленные в ходе исследования, относились к видам, присущим исследуемому зерну изначально. Количество микроорганизмов, определенных с помощью чашечных методов, составило для зерна ржи 4,3-106 КОЕ/г, ячменя - 4,9-106 КОЕ/г. Под
Таблица. Динамика численности микроорганизмов
действием СВЧ-обработки микробная обсемененность семян менялась в зависимости от продолжительности экспозиции и биологических особенностей группы.
Не все варианты сверхвысокочастотного воздействия обладали бактерицидным и фунгицидным эффектом. Так, использование электромагнитного поля в наименее интенсивном режиме (экспозиция 5 сек.) приводило к стимуляции и существенному увеличению количества спо-рообразующих бактерий вида Bacillussubtilis. По сравнению с контролем, число КОЕ этого вида выросло в 165 раз. Указанный режим также обладал стимулирующим эффектом в отношении неидентифицированных грибов - относительно необработанного зерна прибавка составила 65,0 %.
Пока нет однозначного объяснения механизмов стимуляции роста численности микроорганизмов после СВЧ-обработки. Предполагают, что в этом случае воздействие комплексное - тепловой нагрев (небольшой, поскольку режим облучения не жесткий) ускоряет биохимические реакции синтеза метаболитов, а электромагнитные волны определенной интенсивности, возможно, действуют напрямую на генетический аппарат клеток, стимулируя процессы трансляции и транскрипции. Подобный эффектнеоднократ-но доказан для микроорганизмов [11] и высших растений [12]. Возможно, в нашем случае установленный эффект имел туже природу, что и при действии УФ и ионизирующего излучения на микроорганизмы, когда конечный результат обработки определяют доза и продолжительность.
Полного уничтожения при максимальном в опыте режиме СВЧ-обработки (экспозиция 45 сек.) удалось добиться лишь по отдельным группам микроорганизмов, видимо, более уязвимых, чем остальные. К таковым отнесены фитопатогенные микромицеты рода Fusarium и бактерии группы кишечной палочки. Часть бактерий вида Bacillus subtilis выдержала эту обработку, единичные споры микромицетов также остались жизнеспособными -разница с контролем достигала 99,92...99,97 %.
Выживаемость бактериальной и грибной микрофлоры на поверхности семян ячменя была выше, чем на зерне ржи (см. табл.). Это касается как первоначального количества микроорганизмов, так и динамики величины этого показателя после СВЧ-обработки. Указанный факт, видимо, объясняется строением зерновок исследуемых культур. Наличие семенных оболочек у зерновок ячменя служит дополнительной защитой как для уже имеющейся микрофлоры, так и для привнесенной извне. Строение семян разных видов злаковых культур может служить дополнительным фактором, способствующим или, напротив, препятствующим сохранению микрофлоры [13].
на поверхности зерна после СВЧ-обработки, КОЕ/г
Показатель Режим СВЧ-обработки
контроль, без обработки, КОЕ/г 700 Вт, 5 сек. 700 Вт, 15 сек. 700 Вт, 45 сек.
КОЕ/г % КОЕ/г 1 % КОЕ/г 1 %
Рожь
Микромицеты рода Fusarium 0,8104 1,1-103 -86,25 0,6102* -99,25 0 -100,00
Микромицеты рода Aspergillus 1,2-104 0,5103* -95,83 0,4 103* -96,67 5,0* -99,96
Микромицеты рода Pénicillium 2,4-104 2,3103 -90,42 1,8102 -99,25 7,1* -99,97
Микромицеты неидентифицированные 4,0103 6,6103 +65,00 0,7102 -98,25 3,2 -99,92
Бактерии Bacillus subtilis 4,3-106 7,1-108* +165 раз 1,1-104 -99,74 9,1-102* -99,98
Общая обсемененность 4,3-106 7,1-108 +165 раз 1,3-104 -99,70 9,3102 -99,78
БГКП, в 1,0 г + + -
Ячмень
Микромицеты рода Fusarium 1,0-104 0,8104* -20,00 1,6102 -98,40 9,3* -99,91
Микромицеты рода Aspergillus 1,3-104 0,5104 -61,54 0,5103 -96,15 8,7 -99,93
Микромицеты рода Pénicillium 2,6104 2,3104* -11,54 8,0103 -69,23 4,4* -99,98
Микромицеты неидентифицированные 4,4-103 4,6103 +4,55 5,3102 -87,95 6,9* -99,84
Бактерии Bacillus subtilis 4,8106 6,1-107* +12,7 раза 8,2105* -82,92 4,7102 -99,99
Общая обсемененность 4,9106 6,1-107 +12,4 раза 8,3105 -83,03 5,0102 -99,99
БГКП, в 1,0 г + + +
В то же время стимулирующий эффект в отношении роста бактерий сенной палочки при минимальном в опыте режиме был выражен менее ярко - количество КОЕ увеличилось лишь в 12,7 раза, по сравнению с контролем.
На зерне ячменя зафиксирована полная гибель представителей только БГКП; отдельные споры и клетки всех остальных изученных групп сохраняли жизнеспособность, что проявлялось в виде роста колоний на соответствующих питательных средах. Самым устойчивым к воздействию СВЧ-обработки оказался споровый прокариотический микроорганизм сенная палочка (Bacillus subtilis).
Применявшаяся электромагнитная обработка не повлияла на культуральные свойства изученных микроорганизмов и их метаболические особенности. Внешний вид колоний,пигментация, размеры и скорость их образования между изученными вариантами не имели существенных различий.
СВЧ-обработка в более интенсивном режиме неблагоприятно отразилась на выживаемости бактерий группы кишечной палочки - на зерновках ржи они погибали при обработке в течение 15 сек., на семенах ячменя - после 45 сек.
Выводы. Сверхвысокочастотная электромагнитная обработка может стимулировать или угнетать рост бактерий и микромицетов, что при равных мощности и частоте определяется продолжительностью воздействия. СВЧ-обработка мощностью 700 Вт с экспозицией 5 сек. оказывает значительное стимулирующее влияние на спорообразующие бактерии сенной палочки, вызывая резкий рост числа жизнеспособных клеток. Увеличение длительности обработки до 15 сек. приводит к существенному снижению численности изученных групп микроорганизмов, относительно контрольных значений - в среднем на 98,81 % для зерна ржи и на 86,28 % для зерна ячменя. Максимальный в опыте стерилизующий эффект отмечен для режима СВЧ-обработки с экспозицией 45 сек., при котором погибают до 99,78.99,99 % от первоначального количества микроорганизмов, включая собственныхпредставителей микрофлоры зерна, а также внесенных специально.
Выживаемость микроорганизмов на поверхности зерна ячменя была выше, чем на зерне ржи. Однако при максимальной в опыте выдержке (45 сек.) их численность практически выравнивались и составляла 9,3-102 КОЕ/г для ржи и 5,0102 КОЕ/г для ячменя.
Литература.
1. Distribution of microbial contamination within cereal grains /A. Laca, Z. Mousia, M. Diaz, etc. // Journal of food engineering. 2006. Vol. 72. № 4. Рр. 332-338. DOI: doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2004.12.012.
2. Hocking A. D. Microbiological facts and fictions in grain storage // Proceedings of the Australian postharvest technical conference. Canberra: CSIRO, 2003. Рр. 55-58.
3. BianchiniA., Bullerman L. B. Biological control of molds and mycotoxins in foods. In mycotoxin prevention and control in agriculture //ACS symposium series, American Chemical Society, Washington: DC, 2010. Рр. 1-16. DOI: 10.1021/bk-2009-1031.ch001.
4. Бастрон А. В., Долгов И. В. Постановка проблемы обеззараживания зерна пшеницы ЭМП СВЧ в послеуборочный период и пути ее решения // Эпоха науки. 2016. № 5. С. 9.
5. Oghbaei M., Prakash J. Effect of primary processing of cereals and legumes on its nutritional quality: A comprehensive review // Cogent Food & Agriculture. 2016. Vol. 2. No. 1. Рр. 1-14. DOI: 10.1080/23311932.2015.1136015.
6. Impact of food processing and detoxification treatments on mycotoxin contamination / P. Karlovsky, M. Suman, F. Berthiller etc. // Mycotoxin research. 2016. Vol. 32. No. 4. Рр. 179-205. DOI: 10.1007/s12550-016-0257-7.
7. Толмачева Т. А. Афлатоксины, их влияние на продовольственное сырье и методы обеззараживания // Вестник ЮжноУральского государственного университета. Серия: Пищевые и биотехнологии. 2013. Т. 1. № 2. С. 40-44.
8. Соболева О. М. Экологическая оценка действия электромагнитного поля на семена озимых злаков //Достижения науки и техники АПК. 2017. Т. 31. № 11. С. 47-49.
9. Соболева О. М., Кондратенко Е. П., Витязь С. Н. Влияние электромагнитного поля на аминокислотный состав и биологическую ценность зерна новой озимой культуры //Вестник АГАУ. 2015. №11. С. 58-64.
10. Среда для выращивания кишечной палочки и способ получения колибактериозного анатоксина / А. А. Евглевский, Е. П. Евглевская, И. Ф. Наумова и др. // Патент № 2270857 РФ; заявл. 07.04.2004; опубл. 27.02.2006. Бюл. № 6. 6 с.
11. Лукьянова А. А. Влияние СВЧ- И КВЧ-излучения на гетеротрофных и фототрофных партнеров смешанных культур микроорганизмов: автореф. ... канд. биол. наук. М., 2007. 24 с.
12. Кондратенко Е. П., Соболева О. М., Егорова И. В. Характер влияния электромагнитного поля и влажности зерна на особенности развития пшеницы на ювенильных стадиях //Аграрная Россия. 2016. № 4. С. 18-23.
13. Обработка семян СВЧ энергией/А. В. Бастрон, А. А. Василенко, А. В. Заплетина и др.// Сельский механизатор. 2017. № 4. С. 16-17.
DYNAMICS OF MICROORGANISM POPULATION ON THE SURFACE OF RYE AND BARLEY GRAINS AFTER ELECTROMAGNETIC TREATMENT
O. M. Soboleva
'Kemerovo State Agricultural Institute, ul. Markovtseva, 5, Kemerovo, 650056, Russian Federation 2Kemerovo State Medical University, ul. Voroshilova, 22 а, Kemerovo, 650056, Russian Federation
Abstract. Many microorganisms on the grain surface influence negatively its quality and safety; this affects the health of consumers and also leads to economic losses of manufactures and processers of grain. Electrophysical methods of grain treatment, in particular, processing by the superhigh frequency (SHF) electromagnetic field, can serve as an alternative to the classical methods of reducing microbial contamination (physical, chemical and thermal means). The goal of the research was to study the dynamics of the microorganism population on the surface of winter rye and spring barley grain after SHF-treatment. To create an artificial contamination of the grain surface, the biomass of micromycetes (genera of Fusarium, Aspergillus and Penicillium) was grown on Saburo medium. Bacillus subtilis were grown on nutrient medium for determination of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms. After inoculation, the grain was dried and treated by SHF-field with the magnetron frequency of 2.45 GHz, power of 700 W, and exposure of 0, 5, 15, 45 seconds. The total contamination was 4.3*10E6 CFU/g for rye grain and 4.9*10E6 CFU/g for barley grain. SHF-treatment during 5 seconds significantly increased the number of Bacillus subtilis: up to 7.1*10E8 CFU/g for rye grain (165 times) and up to 6.1*10E7 CFU/g for barley grain (12.7 times). The increase in the exposure to 15 seconds led to a significant decrease in the number of almost all studied groups of microorganisms relative to the control values, on average by 98.81% for rye grain and by 86.28% for barley grain. The maximum sterilizing effect was observed for SHF-treatment with the exposure of 45 seconds - 99.93-99.97% of microorganisms died. The survival rate of microorganisms on the surface of barley grain was higher compared to rye grain; however, at the maximum exposure (45 seconds) it was practically equal: 9.3*10E2 CFU/g for rye and 5.0*10E2 CFU/g for barley. Keywords: electromagnetic field; SHF; microflora; cereals; winter rye; spring barley; microbial survival rate. Author Details: O. M. Soboleva, Cand. Sc. (Biol.), assoc. prof. (e-mail: meer@yandex.ru).
For citation: Soboleva O. M. Dynamics of Microorganism Population on the Surface of Rye and Barley Grains after Electromagnetic Treatment. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 9. Pp. 21-23 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10905.
