Динамическое изучение микробиоты ротоглотки у пациентов инфекционного стационара Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

E.N. Smirnova, O.N. Sarapulova

CLINICAL AND HORMONAL STATUS OF

PATIENTS WITH AUTOIMMUNE POLYENDOCRINOPATHIES IN PERM REGION

Ten case histories of patients with autoimmune polyendocrinopathies treated during 5 years at Endocrinologie Department of Perm Regional Clinical Hospital were analyzed. Similar occurrence rate of both 1 type APHS and 2 type APHS was revealed. First type APHS is diagnosed in childhood and well compensated. In spite of substitution therapy, we failed to reach compensation in 2 type APHS patients.

Keywords: autoimmune polyendocrinopathy, hormones.

Пермская государственная медицинская академия им ак. Е.А. Вагнера

Материал поступил в редакцию 6.09.2007

© Смирнова Е. Н., Сарапулова О.Н., 2007

УДК 616.327.3-008.87-022-07

ДИНАМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МИКРОБИОТЫ РОТОГЛОТКИ У ПАЦИЕНТОВ ИНФЕКЦИОННОГО СТАЦИОНАРА

Библиографический список

1. Клинический полиморфизм аутоиммунного полигландулярного синдрома 1-го типа. Роль молекулярно-генетической диагностики / ЕМ. Орлов, АМ. Букина и др. // Проблемы эндокринологии. - 2005. - Т. 51. - №5. -С. 22-26.

2. Полигландулярный аутоиммунный синдром 1-го типа / АВ.Древалъ, Т.С.Камынина и др. // Проблемы эндокринологии. - 2006. -Т. 52. - №5. -С. 35-37.

3. ВеПеНе, С. Современный взгляд на аутоиммунные полигландулярные синдромы / С.Веиег1е, К Zanchetta // Клиническая эндокринология. - 2005. - №8. - С. 1-13.

М.В. Кузнецова, Т.И. Карпунина, А. О.

Проблема микроэкологии ротоглотки как наиболее открытого биотопа, претерпевающего постоянную контаминацию патогенной и условно-патогенной микрофлорой из окружающей среды, особенно актуальна для пациентов инфекционных стационаров. В условиях общего режима содержания больных с различными заболеваниями высока вероятность взаимного дополнительного инфицирования,

фушин, Г.А. Вахрушева, В.А. Демаков

в особенности микрофлорой, распространяющейся воздушно-капельным путем. Резидентная микрофлора ротовой полости служит биологическим барьером для многих микроорганизмов, но имеет тенденцию изменяться под воздействием общих и местных факторов [2,4]. Как известно, в норме в ее составе преобладают грамположительные, преимущественно кокковые формы: «зеленящие» стрептококки,

коагулазонегативные стафилококки и т.п. Транзиторное носительство основных возбудителей гнойно-септических инфекций -Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis и др. -может наблюдаться у любого здорового человека [1], в то время как грамотрицательные аэробные палочки встречаются крайне редко (менее чем у 2% здоровых людей) [10]. Обсемененность этими бактериями резко возрастает при алкоголизме, у истощенных, пожилых людей и при тяжелых, требующих госпитализации заболеваниях [3, 7]. Этому могут способствовать дисбиотические процессы, часто развивающиеся у ослабленных больных с инфекционной патологией на фоне, как правило, длительной антибиотикотерапии. Многие грамотрицательные, в том числе нефер-ментирующие бактерии, позиционируются современными исследователями и клиницистами как возбудители внутрибольничных инфекций в отделениях хирургического профиля и прежде всего интенсивной терапии [8]. В доступной нам литературе практически отсутствуют сведения об их выявлении в инфекционных стационарах.

Цель настоящего исследования - изучить в динамике состав микробиоты слизистых оболочек верхних дыхательных путей пациентов и сотрудников «общего» отделения инфекционной больницы.

Материалы и методы

Исследование выполнено в марте-мае 2007 г. Обследованы 17 пациентов в возрасте от 18 до 70 лет, госпитализированных в общую палату КИБ №1, в том числе 10 человек с вирусными заболеваниями (ветряная оспа, герпес- и аденовирусная инфекция), 6 - с бактериальными инфекциями с локализацией возбудителей в верхних дыхательных путях (лаку-нарная ангина, паратонзиллярный абсцесс) и один больной клещевым боррелиозом, а также 8 сотрудников данного отделения. Для опреде-

ления общей обсемененности и микробного спектра при поступлении и выписке (или по клиническим показаниям) исследовали слизь из ротоглотки пациентов, а также медперсонала, отобранную стандартными тампонами в транспортную среду Амиеса (HiMedia). Посев проводили в лабораторных условиях по Гольду на следующие среды: кровяной агар (КА), Эндо, Сабуро, желточно-солевой агар (ЖСА). Идентификацию изолированных микробных культур осуществляли на основании морфобиохи-мических признаков [9]. Тотальную ДНК выделяли фенольным методом [6]. Генетическое типирование штаммов осуществляли посредством полимеразной цепной реакции с прай-мером М13 и DAF (RAPD-ПЦР) [11]. Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (г.Новосибирск) на термо-циклере ТЗ (Biometra, Германия). Праймеры М13 и DAP были синтезированы ООО «Евроген», г. Москва. Режим амплификации для Ml3 включал начальный цикл денатурации - 1 мин при 94°С; 35 циклов по схеме: денатурация 94°С - 20 с; отжиг 50°С - 60 с; синтез 72°С - 60 с; завершающий цикл - 5 мин при 72°С. Для DAF: денатурация 95°С - 5 мин; 30 циклов по схеме. 95°С - 60 с; Зб°С - 60 с; 72°С - 120 с. Элекгрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2 %-ном агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).

Результаты исследования

Проведенные исследования позволили проследить определенные тенденции, характеризующие микрофлору ротоглотки и ее изменения у пациентов, находившихся на лечении в инфек-

ционном стационаре (таблица). При поступлении у всех больных, независимо от этиологии заболевания, облигатные микроорганизмы, обеспечивающие стабильность микробиоценоза ротовой полости, либо не были найдены, либо регистрировались в минимальных количествах

От больных лакунарной ангиной в большинстве случаев (80%) изолировали (3-гемо-литические стрептококки (S. pyogenes) в диагностически значимых титрах (>104 КОЕ/мл), а при паратонзиллярном абсцессе - S. aureus.

(<105 КОЕ/мл). Наиболее постоянными членами ассоциаций облигатных бактерий оказались а-и/или у-гемолитические стрептококки, в 11,7% случаев - в виде монокультуры Коринебакгерии, непатогенные нейссерии и пр. встречались лишь как единичные находки.

Независимо от того, какой природы - вирусной или бактериальной - была инфекция, в составе микрофлоры ротоглотки в значимых количествах обнаруживали, как правило, не более двух ассоциантов. Помимо стрептокок-

Результаты обследования пациентов инфекционного стационара

№ п/п ФИО, диагноз Возраст, лет Срок лечения, сут. Терапия с а/б,п/в Микрофлора

■HO после

1 Б-ая Л., ветряная оспа 50 6 - Enterococcus sp. Enterococcus sp.

2 Б-ой 3., энтеровирусный серозный менингит 27 14 пенициллин 5. epidermidis, Streptococcus haem+ Staphylococcus sp., Enterococcus sp.

3 Б-ая С., аденовирусная инфекция 20 8 ампициллин Bacillus sp. Pseudomonas alcaligenes S. epidermidis, Bacillus sp., Enterococcus sp.

4 Б-ой Т., герпетическая инфекция 52 7 ацикловир Enterococcus sp. Staphylococcus sp., Enterococcus sp.

5 Б-ой 0., ветряная оспа 18 7 ацикловир S. epidermidis, Streptococcus haem+ S. aureus, Enterococcus sp., Streptococcus haem-, Alcaligenes faecalis

6 Б-ая М., клещевой боррелиоз 3-й степ. 70 16 цефтриак-сон Micrococcus Candida Streptococcus haem+, Enterococcus sp., Candida

7 Б-ая М., аденовирусная инфекция, пневмония 69 10 цефтриак-сим Alcaligenes faecalis Enterococcus sp., Bacillus sp., Micrococcus, Candida

8 Б-ая Д., энтеровирусная инфекция 56 7 цефотаксим S. pyogenus, Streptococcus haem- Staphylococcus sp., A. baumanii, Enterococcus sp.

9 Б-ая Ш., аденовирусная инфекция, отит 19 8 пенициллин Streptococcus haem-, Candida Streptococcus haem-

10 Б-ой Ж., опоясывающий лишай 54 14 ампициллин ацикловир Streptococcus haem- Streptococcus haem-, Staphylococcus sp., Enterococcus sp., Candida

11 Б-ой Г., ветряная оспа 18 8 ацикловир Streptococcus haem- Streptococcus haem-, Candida Enterococcus sp., A. baumanii,

12 Б-ая 3., лакунарная ангина 33 7 пенициллин S. pyogenus. Streptococcus haem- Streptococcus haem-, Proteus mirabilis, Candida

13 Б-ая Н., паратонзиллярный абсцесс 49 7 пенициллин S. aureus, Candida, Streptococcus haem- S. aureus, Enterobacter sp.

14 Б-ая Г., лакунарная ангина 19 8 пенициллин S. pyogenus, Enterococcus sp. Streptococcus haem+, Candida

15 Б-ая 0., лакунарная ангина в 20 8 пенициллин S. pyogenus Enterococcus sp., Candida, A. baumanii

16 Б-ая Б., лакунарная ангина 48 8 цефазолин S. pyogenus Corinebacterium sp. A. baumanii E. coli

17 Б-ая Бр., лакунарная ангина 26 8 пенициллин Micrococcus Moraxella^ Micrococcus

65

ков, верхние дыхательные пути колонизировали преимущественно Staphylococcus spp. Изолированные от нескольких пациентов представители Enterococcus, Candida, судя по всему, были случайными компонентами микроценоза, поскольку элиминировались без специфической терапии. Лишь у пациента с тяжелой формой клещевого боррелиоза кандидоз, очевидно, осложнял течение основного заболевания. Обращала на себя внимание контаминация слизистой грамотрицательными нефер-

ментирующими бактериями {Alcaligenes faecalis и Pseudomonas alcaligenes), в обоих случаях у больных аденовирусной инфекцией.

На момент выписки в большинстве случаев наблюдали изменения в составе микробного пейзажа ротоглотки независимо от нозологической формы заболевания, его тяжести, сроков пребывания и противомикробной терапии. Увеличилось количество многокомпонентных ассоциаций микроорганизмов, и расширился их видовой спектр (рис. 1,2).

Рис. 1. Изменения микробных ассоциаций ротоглотки пациентов инфекционного стационара

Рис. 2. Динамика видового состава слизистой ротоглотки пациентов инфекционного стационара: 1 - стафилококки; 2 - стрептококки; 3 — энтерококки; 4 - прочие Грам+; 5 — «неферментеры»; 6 - энтеробактерии; 7-кандиды

Если при поступлении только у одного пациента выделено три вида микроорганизмов, а 4-компонентные системы вообще не встречались, то при выписке частота одномоментной высеваемости трех таксонов увеличилась в четыре раза, а у каждого третьего были обнаружены 4-компонентные ассоциации. Наиболее многочисленным спектром характеризуются пациенты с вирусной этиологией.

В значительной степени возросло количество изолируемых стафило- и энтерококков, при заметном снижении обсемененности бета-гемолитическими стрептококками. Такие изменения в составе грамположительной кокковой флоры, очевидно, обусловлены использованием при лечении антибиотиков пеницил-линового ряда. На фоне антибиотикотерапии увеличивалась контаминация слизистой ротоглотки грибками рода Candida.

Самостоятельный интерес представлял тот факт, что среди изолятов выросла доля грамот-рицательных бактерий, прежде всего за счет не-ферментирующих видов. Можно было бы предположить, что определяющим селективным фактором при этом послужили использованные для лечения антибиотики. Однако аналогичные сдвиги были характерны и для больных с вирусными инфекциями, не получавших никакой антибактериальной терапии. В этой связи возник вопрос о возможных источниках и путях передачи грамотрицательной неферментирующей флоры. Поскольку в подобных стационарах источником внугрибольничного заражения зачастую становится медперсонал, на завершающем этапе исследования были обследованы постоянные сотрудники того же отделения. Несмотря на то что обследованные не предъявляли каких-либо жалоб со стороны органов дыхания, у трех человек из восьми (37,5%) были обнаружены Streptococcus haem+, а у каждого второго (!) слизистую ротоглотки колонизировали грамотри-цательные неферментирующие бактерии.

Методом RAPD-ПЦР с использованием универсальных праймеров М13 и DAF прове-

дено генотипирование выделенных (от пациентов и персонала) бактериальных культур, принадлежащих к группе грамотрицательных неферментирующих бактерий, включая Acine-tobacter baumanii (6) и Alcaligenes faecalis (4). Были выявлены одинаковые RAPD-профили тотальной ДНК у трех штаммов рода Acineto-bacter, причем два из них были изолированы от медицинского персонала (рис. 3). У пациентов при выписке были выделены три штамма A baumanii, два из которых имели одинаковый набор электрофоретических фрагментов, а третий - индивидуальный генотип. Все штаммы рода Alcaligenes, изолированные как от больных, так и от медперсонала, имели разные спектры электрофореграмм.

Результаты проведенных исследований указывают на существенные нарушения микроэкологии ротоглотки как у большинства пациентов, находившихся на лечении в инфекционном стационаре, так и у постоянных его сотрудников. Оценка выраженности проявлений дисбактериоза ротоглотки, предложенная В.В. Хазановой и соавт. (1996), предполагает выделение четырех степеней тяжести и включает компенсированную, субкомпенсирован-ную и декомпенсированную формы [10]. В нашем исследовании практически все обследованные больные при поступлении имели нарушение микроэкологии полости рта в той или иной степени: 48% - компенсированный дисбактериоз ротоглотки, 34,4% - субкомпен-сированный и 17,6% - декомпенсированный. Вероятно, это связано с тем, что большая часть больных поступает в стационар после курса антибиотикотерапии или имеет в анамнезе хронические заболевания. При выписке увеличивалось число субкомпенсированных (6; 41,8%) и декомпенсированных форм (8; 47%). Выраженное нарушение микроэкологии чаще наблюдали в случае вирусной этиологии основного заболевания или при длительном лечении антибиотиками. Пациенты с вирусной этиологией характеризовались и наибо-

лее разнообразным составом условно-пато-генных бактерий, «населяющих» слизистую верхних дыхательных путей. Это может быть связано с тем, что вирусы в значительной степени трансформируют эпителиальные клетки, угнетают местную и общую иммунологическую реактивность организма. При этом представители нормальной микрофлоры в полости рта пациентов определялись менее чем в 50% случаев при резком угнетении их роста. Ассоциированная флора представлена преимущественно коагулазопози-тивными видами стафилококков, энтерокок-

ками, грамотрицательньми неферментирую-щими бактериями, то есть представителями тех групп микроорганизмов, которым свойственно либо природная устойчивость ко многим антибактериальным препаратам, либо они способны легко приобретать это свойство. Более 40% пролеченных становятся носителями грибов рода Candida. Как известно, обнаружение в ротовой полости энтеробак-терий (Е. coli и P. mirabilis) и увеличение концентрации дрожжеподобных грибов рода Candida является индикатором снижения уровня колонизационной резистентности [2].

М13

DAF

с а S

s «

-о

|я, §

а -о

tN

С

а S s а -о

а

и

«S,

г-

« о

M

«

о tu

«a,

к а S s а -с

■t

с а S s а -о

к а S a a -о

к: S S г a -о

к а S s a -о

<N

С

а S г es -о

а

о

а

о tu

«S,

а

о ij .в

V*- ' ~$> ' К,?' • T'i * s, ' <

У:У: -v:, .'■ ■■■'■;;■ ■. "■■■^'■■■уУк

H - Я№

Рис. 3. РАРО-профили тДНК клинических изолятов А. Ъаитапи и А. /аесаИя ■ использованием праймеров М13 и ПАР: соответствующие однотипные наборы фрагментов у 1, 4, 5-го и 2, 3-го образцов

На основании генотипических признаков с учётом фенотипического сходства трех изолятов АстеЮЬШег Ьаитапп можно полагать, что они являлись нозокомиальными штаммами и послужили причиной ятроген-ной контаминации одного из пациентов. Два других штамма, изолированные от разных пациентов, но имеющие идентичный генотип, очевидно, указывают на их взаимное инфицирование. Из этого следует, что внутри стационара возможен обмен условно-патогенными микроорганизмами как между больными, так и в цепочке «пациент - медицинский персонал». В то же время на фоне антибиоти-котерапии нельзя исключить и эндогенной контаминации слизистых условно-патогенной грамотрицательной флорой, более устойчивой к данным препаратам.

Выводы

Таким образом, в условиях инфекционного стационара существуют предпосылки для ускоренной селекции потенциально опасной условно-патогенной флоры, которые обусловлены как внешними, так и внутренними факторами. Именно в такой клинике, где, с одной стороны, реализуются жесткие требования к соблюдению санитарного режима за счет постоянного использования широкого арсенала дезинфицирующих средств, а необходимым компонентом проводимой терапии являются антибиотики, с другой - всегда присутствуют иммунокомпрометированные контингенты больных с усугубляющимся нарушением микробиоценоза слизистых оболочек ротоглотки, формируются специфические микробные ассоциации, компоненты которых могут представлять определенную опасность с эпидемиологической точки зрения. Микробиологический мониторинг условно-патогенных видов в инфекционных больницах, о результатах которого в специальной литературе практически

отсутствуют какие-либо сведения, на наш взгляд, представляет особый интерес. Хотя опыт таких исследований пока невелик, есть основания полагать, что контроль за циркуляцией условно-патогенных микроорганизмов с помощью методов молекулярно-генетического анализа, создание базы данных генетического картирования наиболее значимых из них открывает новые перспективы для корректной расшифровки источников и путей передачи такой инфекции не только в конкретном лечебном учреждении, но и в решении вопросов сохранения эпидемиологического благополучия в регионе в целом.

Библиографический список

1. Бондаренко, ВМ. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы / ВМ. Бондаренко, ТВ.Мацулевич. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 304 с.

2. Боровский, ЕВ. Биология полости рта / ЕВ. Боровский, B.C. Леонтьев. - М.: Медицина, 1991. - 304 с.

3. Давыдова, ТР. К проблеме дисбактериоза в стоматологической практике / ТР. Давыдова, ЯН. Карасенков, ЕЮ. Хавкина // Стоматология. - 2001. - № 2. - С. 23-24.

4. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины / АЛ Воробьев, НА. Абрамов, В.Ф. Бондаренко, Б А тендеров // Вестник Росс. акад. мед наук - 1997. - № 3. - С. 4-7.

5. Изучение микробиоценоза при хронических заболеваниях слизистой оболочки полости рта / ВВ. Хазанова, ИМ. Рабинович, ЕА. Земская и др. // Стоматология. -1996. - № 3. - С. 26-27.

6. Клонирование ДНК методы: пер. с англ. / под ред.Д.Гловера. - М.: Мир, 1988. - 538 с.

7. Несвижский, ЮВ. Микробиоценоз человека в норме, патологии и иммунный статус / ЮВ. Несвижский, A3. Дорофеев // Архив

69

клинической и экспериментальной медицины. - 1995. - № 2. - С. 175-177.

8. Неферментирующие грамотрицательные возбудители нозокомиальных инфекций в ОРИТ России: проблемы антибиотикорези-стентности / ГКРешедъко, ЕЛ.Рябкова, АН. Фаращук, Л.С. Страчунский // КМАХ. -2006. - Т.8. - №3. - С. 243-259.

9. Определитель бактерий Берджи: пер. с англ. / под ред. Дж. Хоулта и др. - М.: Мир, 1997. - Т. 1, 2.

10. Хазанова, ВВ. Микробная флора полости рта / ВВ. Хазанова // Справочник по стоматологии. - М„ 1993. - С. 438-443-

11. Шагинян, И А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничной инфекции / И А. Шагинян // КМАХ. - 2000. - Т.2. -№3.-С. 82-95.

M.V. Kuznetsova, T.I. Karpunina, A.O. Charushin, GA. Vakhrusheva, VA. Demakov

DYNAMIC STUDY OF OROPHARYNX MICROBIOTA IN INFECTIOUS HOSPITAL PATIENTS

Microbiota content of upper airway mucosa in patients and medical staff of "general" department of infectious hospital has been studied in dynamics. Significant disturbances of oropharynx

microbiota were revealed in most of its patients and in permanent staff of the department, as well. The number of subcompensated (41,8%) and decompensated (47%) forms of dysbiosis was elevated in patients discharged from hospital - the case usually observed in viral etiology of the main disease or during continuous antibiotic treatment. Associated flora was represented mainly by coagu-lase-positive types of staphylococci, enterococci and Gram-negative nonfermentative bacteria. Over 40% of treated patients become the carriers of Candida fungi. Examination of permanent medical staff showed that 37,7% were the carriers of Streptococcus haem+\ oropharynx mucosa of every second person was colonized by Gram-negative nonfermentative bacteria. Nosocomial strain of Acinetobacter baumnii, being the cause of iatrogenic contamination of one of patients, was revealed with molecular-genetic analysis (RAPD-PCR method). It was concluded that exchange of opportunistic microorganism between patients and in the chain patient - medical staff is possible.

Keywords: infectious hospital, nosocomial infection, oropharynx, nonfermentative bacteria, molecular-genetic analysis.

Пермская государственная медицинская академия им. ак. ЕА. Вагнера

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Материал поступил в редакцию 19.09.2007

© Кузнецова М.В., Карпунина Т.И., Чарушин АО., Вахрушева ГА, Демаков В А, 2007