CC BY
34
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2021 - V. 28, № 1 - P. 69-71
УДК: 636.2:612.17.014.2 DOI: 10.24412/1609-2163-2021-1-69-71
ДИГИДРОКВЕРЦЕТИН И ТРОЛОКС КАК ИНГИБИТОРЫ ЛИПОПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСА ЦИТОХРОМА C С КАРДИОЛИПИНОМ
Л.А. РОМОДИН*, Ю.А. ВЛАДИМИРОВ**
* Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина», ул. Академика Скрябина, д. 23, г. Москва, 109472, Россия, e-mail: rla2904@mail.ru
** Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Ленинские горы, д. 1, г. Москва, 119991, Россия, e-mail: yuvlad@mail.ru
Аннотация. Ключевую роль при запуске апоптоза по митохондриальному пути играет цитохром с, который, образуя комплекс с фосфолипидами, приобретает пероксидазную активность. Вследствие катализируемой им пероксидазной реакции происходит разрушение мембран митохондрий. Это приводит к выходу различных проапоптотических факторов в цитоплазму клетки. Ингибируя липидную пероксидацию, вызванную активностью комплекса цитохрома с с кардиолипином, возможно блокировать патологический процесс апоптоза. Это позволит разработать способы терапии различных заболеваний, в том числе и кардиодегенеративных и нейродегенеративных патологий. Одним из наиболее перспективных способов добиться указанного результата является использование антиоксидантов. Цель исследования - методом активированной хемилюминесценции изучить влияние тролокса и дигидрокверцетина (таксифолина) как синтетического и природного антиоксидантов соответственно на липидную пероксидацию, катализируемую комплексом цитохрома с с кардиолипином. Материалы и методы исследования: регистрация хемилюминесценции при использовании специфического для реакций липидной пероксидации активатора, известного в англоязычной литературе как coumarin-334. Результаты и их обсуждение. Было показано полное угнетение липид-ной пероксидации в течение определённого латентного периода с дальнейшим её полным развитием при действии тролокса и дозозависимое равномерное её снижение при действии дигидрокверцетина. Данные результаты открывают дорогу перспективным будущим исследованиям по подавлению антиоксидантами липопероксидазной активности комплекса цитохрома с с кардиолипином для подавления патологического апоптоза.
Ключевые слова: цитохром с, кардиолипин, комплекс цитохрома с с кардиолипином, хемилюминесценция, антиокси-данты, апоптоз, перекись водорода, липопероксидазная реакция, дигидрокверцетин, тролокс.
DIHYDROQUERCETIN AND TROLOX AS INHIBITORS OF LIPOPEROXIDASE ACTIVITY OF THE COMPLEX OF
CYTOCHROME C WITH CARDIOLIPIN
L.A. ROMODIN*, YU.A. VLADIMIROV**
*Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MBA named after K.I. Scriabin ", Academician Smabin Str., 23, Mos^u^, 109472, Russia,
e-mail: rla2904@mail.ru
**Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Moscow State University named afterM.V. Lomonosov", Leninskie Gory, 1, Mosmw, 119991, Russia, e-mail: yuvlad@mail.ru
Abstract. The key role in triggering apoptosis along the mitochondrial pathway is played by cytochrome с, which forms a complex with phospholipids and acquires peroxidase activity. As a result of the peroxidase reaction catalyzed by it, mitochondrial membranes are destroyed. This leads to the release of various proapoptotic factors into the cytoplasm of the cell. By inhibiting lipid peroxidation caused by the activity of the cytochrome C-cardiolipin complex, it is possible to block the pathological process of apoptosis. This will allow you to develop methods of treatment of various diseases, including cardiodegenerative and neurodegenerative pathologies. Thus, one of the most promising ways to achieve this result is the use of antioxidants. The research purpose was to study the effects of trolox and dihy-droquercetin (taxifolin) as a synthetic and natural antioxidant on the lipoperoxidase activity of the cytochrome с-cardiolipin complex by the method of the activated chemiluminescence. Methods. The registration of chemiluminescence using a specific sensitizer for lipid peroxidation reactions was used. This sensitizer is Coumarin-334. Results: It was shown a complete inhibition of lipid peroxidation during a certain latent period with its further full development under the action of trolox and its dose-dependent uniform decrease under the action of dihydroquercetin. These results are the ways for promising future research on the suppression of cytochrome C-cardiolipin complex lipoperoxidase activity by antioxidants to suppress pathological apoptosis.
Keywords: cytochrome C, cardiolipin, cytochrome c-cardiolipin complex, chemiluminescence, antioxidants, apoptosis, hydrogen peroxide, lipoperoxidase reaction, dihydroquercetin, trolox.
Введение. Липипороксидазная активность комплекса цитохрома с с кардиолипином (ЦитC-КЛ) играет ключевую роль при запуске апоптоза по митохондриальному пути [2,4]. В силу того, что апоптоз - причина развития многих заболеваний, то весьма необходимым кажется поиск способа его блокирования. Весьма перспективным направлением в этой области
видится использование антиоксидантов, механизм действия которых заключается в подавлении липопероксидазной активности ЦитС-КЛ.
Цель исследования - изучение влияния антиоксидантов, таких как дигидрокверцетин, или такси-фолин (ДГК), как представитель естественных расти-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2021 - V. 28, № 1 - P. 69-71
тельных антиоксидантов, и тролокс как представитель искусственных химически синтезированных антиоксидантов на интенсивность течения липоперок-сидазной реакции, катализируемой ЦитС-КЛ.
Исследования по воздействию антиоксидантами на ЦитС-КЛ методом хемилюминесценции (ХЛ) уже проводились [1,5], однако в тех работах в качестве активатора ХЛ использовали люминол, который сам по себе активно химически реагирует с компонентами реакционной смеси. По нашему мнению, следует использовать активатор, который вступает в подобные взаимодействия либо очень ограничено, либо вообще не вступает. Подобными активаторами, к тому же ещё и специфическими для липопероксидазных реакций, по данным авторов [7], являются хинолизидиновые производные кумарина. В этой работе в качестве активатора ХЛ мы использовали coumarin-334 (C-334).
Материалы и методы исследования. Исследования по измерению ХЛ проводились на хемилюми-нометре «Lum-5773» фирмы ООО «ДИСофт» (Россия), подключённом к компьютеру с программным обеспечением «PowerGraph». Перед началом каждой серии измерений хемилюминометр калибровался по ураниловому стеклу.
В пустую кювету хемилюминометра мы добавляли 100 мкл 100 мкМ цитохрома c и 50 мкл растворов тролокса или ДГК различных концентраций и начинали регистрацию ХЛ-сигнала. Через 30 секунд в кювету мы добавляли 800 мкл раствора, содержащего 25 мкл 1 мМ метанольного раствора кумарина С-334 и 775 мкл 20 мМ фосфатного буфера. На 60-ой секунде регистрации ХЛ мы добавляли 100 мкл 6 мМ бычьего кардиолипина, после чего регистрировали ХЛ в течение 250 секунд, после чего в кюветное отделение помещали кювету с 100 мкл 1 мМ H2O2 и на 360-й секунде после начала измерения переносили в эту кювету 800 мкл содержимого первой кюветы. Далее регистрировали свечение в течение необходимого времени.
Результаты и их обсуждение. В ходе настоящей работы мы исследовали влияние ДГК и тролокса на кинетику реакции образования свободных радикалов в системе ЦитС-КЛ - H2O2. Оценка этого образования проводилась при помощи метода хемилю-минесценции при использовании а качестве активатора хинолизидиновое производное кумарина, известное в англоязычной литературе под названием coumarin-334 (C-334).
Из рис. 1* следует дозозависимое снижение интенсивности ХЛ при действии ДГК.
На графике, представленном на рис. 2, показана зависимость угнетения ХЛ, сопровождающей липо-пероксидазную реакцию, катализируемую ЦитС-КЛ, при внесении в систему различных концентраций ДГК. При используемом нами соотношении цито-хром скардиолипин, равном 1:60, концентрация половинного угнетения липопероксидазной реакции ДГК оказалась равной -0,55 мкМ.
Рис. 2. Влияние ДГК на амплитуду ХЛ
Авторами работы [5] в аналогичном эксперименте при соотношении бычий кардиолипин: ЦитС 32:1 было получено значение концентрации половинного ослабления ХЛ, равное 10 мкМ.
Мы также изучили и влияние тролокса на липо-пероксидазную активности ЦитС-КЛ. По данным графиков, представленных на рис. 3**, видно, что действие тролокса несколько отлично от действия ДГК: нет снижения амплитуды ХЛ, но при этом имеет место задержка во времени наступления медленной вспышки ХЛ (латентный период), причём её продолжительность прямо пропорциональна концентрации тролокса.
Примечательно, что вспышка хемилюминесцен-ции развивается в две стадии: вначале наблюдается вспышка низкой интенсивности, потом наступает вспышка высокой интенсивности. Обе вспышки, низкая и высокая, дозозависимо задерживаются тролоксом, а интенсивность обеих вспышек не зависит от концентрации тролокса, однако немного ниже, чем в пробе без антиоксиданта (синяя кривая на графиках рис. 3).
Исследования по воздействию антиоксидантами на ЦитС-КЛ уже проводились [1,3,5]. Однако в качестве активаторов ХЛ в них использовались либо люминол [3,5], вступающий в непосредственную химическую реакцию с компонентами исследуемой системы, либо - coumarin-525 [5], который может проявлять антиок-сидантное действие [6] за счёт наличия в своей структуре бензимидазольной группировки, что могло исказить результаты измерения. Мы использовали в качестве активатора ХЛ был выбран coumarin-334, не содержащий в своей структуре групп, которые могут оказывать выраженный антиоксидантный эффект.
Как уже указывалось, в качестве антиоксидантов нами использовались тролокс и ДГК, их формулы - на рис. 4.
Тролокс в концентрациях от 2,12 мкМ до 3,53 мкМ дозозависимо отодвигает во времени развитие вспышки ХЛ. При концентрациях тролокса от
Рисунок данной статьи представлен на обложке 2
Рисунок данной статьи представлен на обложке 2
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2021 - V. 28, № 1 - P. 69-71
2,12 мкМ перед резким подъёмом кривой и максимумом ХЛ (высокой вспышкой) имеет место ещё и низкоамплитудная (низкая) вспышка ХЛ. При концентрациях тролокса ниже 2,12 мкМ высокая вспышка задерживается на более короткий промежуток времени, а низкую уже нельзя чётко отдифференцировать (кривые ХЛ - на рис. 3).
А Б
Рис. 4. Структурные формулы тролокса (A) и ДГК (Б)
Из данных графика на рис. 2 следует дозозависи-мое подавление ДГК ХЛ, индуцированной H2O2. Ещё раз укажем, что нами получено значению концентрации половинного угнетения ХЛ, вызванной перокси-дазной активностью комплекса цитохрома c с бычьим кардиолипином при соотношении липид:белок 1:60, ДГК, равное 0,51 мкМ. Авторы [3] изучали действие влияния антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса цитохрома c с 1,1',2,2'-тетраоле-илкардиолипином, установив концентрации половинного тушения ХЛ для тролокса и ДГК, равные 3,7 мкМ и 0,7 мкМ соответственно, однако заметим, что в том исследовании активатором ХЛ выступал люминолом [3], непосредственно химически реагирующий с компонентами изучаемой системы. Стоит также отметить, что приведённые авторами статьи [3] кривые ХЛ не соответствуют по своей форме полученным нами ни для ДГК, ни для тролокса, скорее всего это связано не с тем, что в том исследовании было иное соотношение бычий кардиолипин: ЦитС для одних опытов или что использовался тетраолеил-кардиолипин в других, а с тем, что ХЛ активировалась не физическим активатором, как это делали мы, используя С-334, а ХЛ-зондом люминолом.
Таким образом, нами было установлено угнетение липопероксидазной активности ЦитС-КЛ ДГК и временное её полное подавление тролоксом без дальнейшего угнетения. Этот вывод позволяет начать планировать более подробное изучение анти-оксидантов для их использования с целью ингибиро-вания активности ЦитС-КЛ для профилактики и терапии заболеваний, причиной которых является апоптоз по внутреннему пути.
Литература / References
1. Владимиров Ю.А., Дёмин Е.М., Проскурнина Е.В., Осипов А.Н. Образование липо-пероксидных радикалов при окислении кардиопипина в комплексе с цитохромом c // Биологические Мембраны. 2009. Т. 26, № 6. C. 493-504 / Vladimirov JuA, Djomin EM, Proskurnina EV, Osipov AN. Obrazovanie lipo-peroksidnyh radikalov pri okislenii kardiopipina v komplekse s citohromom c [formation of lipid-peroxide radicals during the oxidation of cardiopipin in complex with cytochrome c]. Biologicheskie Membrany. 2009;26(6):493-504. Russian.
2. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., Алексеев А.В. Молекулярные механизмы апоптоза. Структура комплекса цитохрома c с кардиолипином. Обзор // Биохимия. 2013. Т. 78, № 10. С. 1391-1404 / Vladimirov JuA, Proskurnina EV, Alekseev AV. Molekuljarnye mehanizmy apoptoza. Struktura kompleksa citohroma c s kardiolipinom [Molecular mechanisms of apoptosis. Structure of the cytochrome c complex with cardiolipin. Review]. Obzor. Biohimija. 2013;78(10):1391-404. Russian..
3. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., Дёмин Е.М., Матвеева Н.С., Любицкий О.Б., Новиков А.А., Измайлов Д.Ю., Осипов А.Н. Дигидрокверцетин (таксифолин) и другие флавоноиды как ингибиторы образования свободных радикалов на ключевых стадиях апоптоза // Биохимия. 2009. Т. 74, № 3. С. 372-379 / Vladimirov JuA, Proskurnina EV, Djomin EM, Matveeva NS, Ljubickij OB, Novikov AA, Izmajlov DJu, Osipov AN. i dr. Digidrokvercetin (taksifolin) i drugie flavonoidy kak ingibitory obrazovanija svobodnyh radikalov na kljuchevyh stadijah apoptoza [Dihydroquercetin (Taxifolin) and other flavonoids as inhibitors of free radical formation at key stages of apoptosis]. Biohimija. 2009;74(3):372-9. Russian.
4. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., Измайлов Д.Ю., Новиков А.А., Брусничкин А., Осипов А.Н., Каган В.Е. Механизм активации пероксидазной активности цитохрома с кардиолипином // Биохимия. 2006. Т. 91, № 9. С. 1215-1224 / Vladimirov JuA, Proskurnina EV, Izmajlov DJ, Novikov AA, Brusnichkin A, Osipov AN, Kagan VE. Mehanizm aktivacii peroksidaznoj aktivnosti citohroma s kardiolipinom [Mechanism of activation of cytochrome peroxidase activity with cardiolipin]. Biohimija. 2006;91(9):1215-24. Russian.
5. Дёмин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Антиоксидантное действие дигидрокверцетина и рутина в пероксидазных реакциях, катализируемых цитохромом с // Вестник Московского Университета Серия 2: Химия. 2008. Т. 49, № 5. С. 354360 / Djomin EM, Proskurnina EV, Vladimirov JuA. Antioksidantnoe dejstvie digidrokvercetina i rutina v peroksidaznyh reakcijah, kataliziruemyh citohromom s [Antioxidant effect of dihydroquercetin and rutin in peroxidase reactions catalyzed by cytochrome C]. Vestnik Moskovskogo Universiteta Serija 2: Himija. 2008;49(5):354-60. Russian.
6. Jiang J., Bakan A., Kapralov A.A., Silva K.I., Huang Z., Amoscato A.A., Peterson J., Garapati V.K. Designing inhibitors of cytochrome c/cardiolipin peroxidase complexes: mitochondria-targeted imidazole-substituted fatty acids // Free Radic Biol Med. 2014. Vol. 71. P. 221-230 / Jiang J, Bakan A, Kapralov AA, Silva KI, Huang Z, Amoscato AA, Peterson J, Garapati VK. Designing inhibitors of cytochrome c/cardiolipin peroxidase complexes: mitochondria-targeted imidazole-substituted fatty acids. Free Radic Biol Med. 2014;71:221-30.
7. Sharov V.S., Briviba K., Sies H. Assessment of the C-525 laser dye as a chemiluminescence sensitizer for lipid peroxidation in biological membranes: a comparison with chlorophyll-a // Free Radic Biol Med. 1996. Vol. 21, Iss. 6. P. 833-843 / Sharov VS, Briviba K, Sies H. Assessment of the C-525 laser dye as a chemiluminescence sensitizer for lipid peroxidation in biological membranes: a comparison with chlorophyll-a. Free Radic Biol Med. 1996;21(6):833-43.
Библиографическая ссылка:
Ромодин Л.А., Владимиров Л.А. Дигидрокверцетин и тролокс как ингибиторы липопероксидазной активности комплекса цитохрома C с кардиолипином // Вестник новых медицинских технологий. 2021. №1. С. 69-71. DOI: 10.24412/1609-2163-2021-1-69-71.
Bibliographic reference:
Romodin LA, Vladimirov YuA. Digidrokvertsetin i troloks kak ingibitory lipoperoksidaznoy aktivnosti kompleksa tsitokhroma C s kardiolipinom [Dihydroquercetin and trolox as inhibitors of lipoperoxidase activity of the complex of cytochrome C with cardiolipin]. Journal of New Medical Technologies. 2021;1:69-71. DOI: 10.24412/1609-2163-2021-1-69-71. Russian.
