CC BY
269
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Харсеева Г. Г.1, Тюкавкина С. Ю.1, Миронов А. Ю.2
ДИФТЕРИЯ: ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА (ЛЕКЦИЯ)
1ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, 344022, г. Ростов-на-Дону, Россия;
2ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, 125212, Москва, Россия
Проблема дифтерийной инфекции остается актуальной, поскольку циркуляция токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae сохраняется в организме бактерионосителей, несмотря на проводимую вакцинопрофилактику. В лекции изложены современные представления о свойствах возбудителя, факторах его патогенности (токсин, пили, поверхностные белки (67-72р (или DIP0733), DIP1281 и др.) и их роли в патогенезе заболевания. Представлена информация о клинико-эпидемиологической характеристике и современных методах лабораторной диагностики дифтерии. Описан алгоритм бактериологического исследования и методы определения токсигенных свойств возбудителя. Основы вакцинопрофи-лактики дифтерии как единственно эффективного средства предотвращения массовых вспышек этого заболевания рассмотрены в рамках предлагаемой лекции. Знание особенностей циркуляции штаммов С. diphtheriae в современных условиях, патогенетических и клинико-эпидемиологических особенностей дифтерии, современных методов лабораторной диагностики является важным и необходимым для врачей всех специальностей.
Ключевые слова: Corynebacterium diphtheriae; дифтерийный токсин; факторы адгезии и инвазии; лабораторная диагностика.
Для цитирования: Харсеева Г. Г., Тюкавкина С. Ю., Миронов А. Ю. Дифтерия: характеристика возбудителя и лабораторная диагностика (лекция). Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65 (11): 699-706. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-11-699-706 Kharseeva G.G.1, TyukavkinaS.Yu.1, MironovA.Yu.2
DIPHTHERIA: CHARACTERISTICS OF THE PATHOGEN AND LABORATORY DIAGNOSTICS (A LECTURE)
1SBEI HPE «Rostov state medical university» Ministry of Health Protection of Russia, 344022, Rostov-on-Don, Russia; 2Federal State Institution of Science «Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology», of Federal Service of Surveillance on Consumer' Rights Protection and Human Wellbeing, Departament for microbiology, 125212, Moscow, Russia
The problem of diphtheria infection remains relevant, since the circulation of toxigenic .strains of Corynebacterium diphtheriae persists in the body of bacterial carriers, despite ongoing vaccination. The lecture presents modern ideas about the properties of the pathogen, its pathogenicity factors (toxin, pili, surface proteins (67-72P (or DIP0733), DIP1281, etc.) and their role in the pathogenesis of the disease.. Information about the clinical and epidemiological characteristics and modern methods of laboratory diagnostics of diphtheria is presented. The algorithm of bacteriological research and methods for determining the toxigenic properties of the pathogen are described. The basics of diphtheria vaccination as the only effective means ofpreventing mass outbreaks of this disease are considered in the framework of the proposed lecture. Knowledge of the peculiarities of the circulation of strains of Corynebacterium diphtheria in modern conditions, pathogenetic and clinical-epidemiological features of diphtheria, as well as modern methods of laboratory diagnostics is important and necessary for students of medical schools and infectious diseases doctors, pediatricians, bacteriologists, therapists, pulmonologists, epidemiologists, etc.
Key words: Corynebacterium diphtheriae; diphtheria toxin; adhesion and invasion factors; laboratory diagnostics.
For citation: Kharseeva G. G., Tyukavkina S. Yu., Mironov A. Yu. Diphtheria: characteristics of the pathogen and laboratory diagnostics (lecture). Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2020; 65 (11): 699706 (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-11-699-706
For correspondence: Kharseeva G.G., Professor, Head of the Department of Microbiology and Virology № 2; e-mail galinagh@bk.ru Information about authors:
Kharseeva G.G., https://orcid.org/0000-0002-6226-2183; Tyukavkina S.Yu., https://orcid.org/0000-0001-9291-2012; Mironov A.Yu., https://orcid.org/0000-0002-8544-5230.
Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare absence of conflict of interest.
Received 18.06.2020 Accepted 18.07.2020
Для корреспонденции: Харсеева Галина Георгиевна, д-р мед.наук, проф., зав. каф. микробиологии и вирусологии № 2; e-mail: galinagh@bk.ru
REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDICATION
Вакцинопрофилактика дифтерии препаратами дифтерийного анатоксина позволила за последнее столетие значительно снизить заболеваемость этой инфекцией в мире, однако не способствовала искоренению бактерионосительства и циркуляции возбудителя среди населения. В России в настоящее время случаи заболевания дифтерией почти не регистрируются. Подъём заболеваемости наблюдается в Индии, Индонезии, Нигерии, Йемене, странах Латинской Америки и, особенно, в Венесуэле. Резервуар инфекции сохраняется в странах Европейского Союза (Германия, Великобритания, Латвия и др.). Следует принимать во внимание тот факт, что антитоксический иммунитет, формирующийся в ответ на введение препаратов дифтерийного анатоксина, не препятствует адгезии и колонизации возбудителя на слизистой оболочке респираторного тракта прививаемых. У лиц с защитным уровнем антитоксина могут развиться как бессимптомные формы заболевания (бактерионосительство), так и клинически выраженные. В сложившейся ситуации необходимым является совершенствование лабораторной диагностики дифтерии, постоянное проведение профилактических мероприятий, направленных на предотвращение и сдерживание распространения этой инфекции, а также дальнейших исследований по данной проблеме.
Этиология. Дифтерия - острое инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Сorynebacterium diphtheriac, передающееся преимущественно воздушно-капельным путём, характеризующееся фибринозным воспалением в области «входных ворот», явлениями общей интоксикации и поражением сердечно-сосудистой, нервной и выделительной систем.
Род Corynebacterium (класс Actinobacteria, порядок Actinomycetales, семейство Corynebacteriaceae) включает более 120 видов коринебактерий, более 70 из которых имеют медицинское значение. C. diphtheriae впервые описана Klebs в 1883 г., чистая культура выделена Lбеffler в 1884 г. Дифтерию вызывают токсигенные штаммы C. diphtheriae. Способностью продуцировать токсин, помимо C. diphtheriae, обладают С. ulcerans и C. pseudotuberculosis, являющиеся патогенными для человека и животных (крупный и мелкий рогатый скот, лошади, домашние животные). Случаи дифтерии, вызванные С. ulcerans, регистрируются в Великобритании и других европейских странах, в том числе, у лиц, привитых противодифтерийными препаратами. C. pseudo-tuberculosis, основным источником которого являются животные, вызывает у человека лимфаденит и считается одним из видов коринебактерий, которые могут вызвать дифтериеподобную инфекцию при лизогенизации бактериофагом, несущим ^х+-ген C. diphtheriae.
Другие представители рода Corynebacterium (Cory-nebacterium spp. или недифтерийные коринебактерии), входят в состав нормальной микрофлоры организма человека и вызывают оппортунистические инфекции у им-мунокомпрометированных лиц. Нетоксигенные штаммы C. diphtheriae, как и Corynebacterium spp., считаются потенциальными патогенами, поскольку способны вызывать тяжёлые заболевания (инфекции респираторного тракта, кожи, эндокардит, полиневрит, остеомиелит, септический артрит и др.) и не контролируются средствами вакцинопрофилактики. Предрасполагающими факторами к развитию инфекционных поражений, вызванных этими микроорганизмами, являются алкоголизм, сахарный диабет, кариес зубов, цирроз печени, посещение стран с тропическим климатом.
C. diphtheriae неоднородна по результатам фено- и генотипирования. На основе фенотипического биохимического исследования выделены биовары «gravis», «mitis» и промежуточный вариант - «intermedius». В 50-е годы описан вариант биовара «mitis» - С. diphtheriae mitis var. belfanti. Имеются указания на отсутствие филогенетической основы данной классификации, поскольку нет прямого соответствия между биоваром и аллелем dtxR, что связано, предположительно, с распространённостью горизонтального переноса генов. Предлагается подразделить вид C. diphtheriae на два подвида: C. diphtheriae subsp. diphtheriae и C. diphtheriae subsp. lausannense. Штаммы С. diphtheriae могут быть токсигенны-ми, т. е. способными продуцировать дифтерийный экзотоксин, или нетоксигенными. Возбудителем дифтерии являются только токсигенные штаммы С. diphtheriae, в геном которых интегрирован профаг, несущий ^+-ген.
Эпидемиология. Дифтерия - антропоноз. Источником инфекции являются больные и бактерионосители токсигенных штаммов С. diphtheriae. Механизм передачи - аэрогенный. Регистрируют воздушно-капельный, контактно-бытовой и алиментарный пути передачи. Возбудитель устойчив во внешней среде: сохраняется при комнатной температуре до 7 мес, в пыли - до 5 нед, в воде и молоке - до 20 сут. Характерна сезонность: подъём заболеваемости наблюдают в сентябре-ноябре, спад - в апреле-августе. Восприимчивость населения к дифтерии зависит от уровня напряжённости противодифтерийного антитоксического иммунитета (содержание антитоксина в крови менее 0,01 МЕ/мл указывает на то, что индивидуум подвержен дифтерии, 0,01-0,09 МЕ/мл - минимальный защитный уровень (базовый иммунитет), 0,1 МЕ/мл и более - защитный). В допри-вивочный период эпидемический процесс характеризовался выраженной цикличностью. В пределах одной и той же территории периодически повышался уровень заболеваемости за счёт накопления восприимчивых к дифтерии лиц (прежде всего, маленьких детей) в силу ослабевающего уровня напряжённости коллективного иммунитета. В результате проведения плановой вакци-нопрофилактики достигнуто значительное снижение заболеваемости дифтерией. Даже лица, привитые высо-коиммуногенным препаратом - дифтерийным анатоксином, имеющие защитные уровни противодифтерийных антител, подвержены заболеванию. Известны случаи повторного заболевания дифтерией.
Гетерогенность генетической структуры С. diphtheriae определяет высокий уровень внутривидового биологического разнообразия. В России зарегистрирован 31 риботип циркулирующих штаммов С. diphtheriae. В 40-70-е годы ХХ века в популяции циркулировали штаммы биовара gravis риботипа Lyon (84,6%), в 80-е годы - C. diphtheriae биовара mitis риботипа Otchakov (29,4%) и биовара gravis риботипов Sankt-Peterburg/ Rossiya (23,5%). В 90-е годы во время эпидемического подъёма в России доминировали штаммы биовара gravis риботипов Sankt-Peterburg/Rossiya (75-96,1%). В период наступления эпидемического благополучия (2003-2008 гг.) наблюдали снижение удельного веса риботипов Sankt-Peterburg/Rossiya до 72,1% и увеличение удельного веса риботипа Otchakov до 17%.
Для каждого эпидемического цикла характерно распространение определённых эпидемических клонов, процесс формирования которых начинается до повышения заболеваемости дифтерией и выражается в увеличе-
нии удельного веса штаммов определённого биовара и риботипа среди циркулирующих. В период спорадической заболеваемости популяция приобретает гетерогенную структуру, в результате появляются эпидемические штаммы, способные к инфицированию большого числа людей, у которых к этим штаммам не сформирована колонизационная резистентность. Антитоксический иммунитет не препятствует колонизации. Носительство C. diphtheriae в коллективах охватывает 10-20% детей, в очагах дифтерии бактерионосители составляют иногда более 70% от числа обследованных.
Биологические свойства возбудителя. С. diphtheriae - прямые или слегка изогнутые тонкие грамполо-жительные неподвижные, неспорообразующие, полиморфные палочки. Клеточная стенка бактерий рода Corynebacterium имеет сложное строение: содержит пептидогликан, миколовые кислоты, арабиногалактан, димиколат трегалозы (корд-фактор), липидоманнан и липоарабиноманнан (CdiLAM). Верхний наружный слой клеточной стенки включает в свой состав нефим-бриальный поверхностный белок 67-72р (или DIP0733), поверхностный белок DIP1281, пили, свободные полисахариды и гликолипиды. Оболочка пронизана белка-ми-поринами. Имеют заостренные или булавовидные концы, внутри которых расположены зёрна «волютина», (метахроматиновые гранулы полиметафосфата). Зёрна волютина выявляют путём окраски препаратов щелочным метиленовым синим по Леффлеру. Гранулы по-лиметафосфата воспринимают краситель интенсивнее, чем цитоплазма клетки, обусловливая метахромазию. Зёрна волютина обнаруживают и при использовании окраски по Нейссеру, и люминесцентной микроскопии. В мазках бактерии располагаются под углом, напоминая латинские буквы L, X, V, Y или «растопыренные» пальцы рук.
С. diphtheriae и другие представители рода Coryne-bacterium - аэробы, факультативные и облигатные анаэробы, хемогетеротрофы, каталазоположительны. С. diphtheriae требовательны к условиям культивирования, хорошо растут при +37° С (рН 7,4-8,0) на питательных средах, обогащённых аминокислотами, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, с добавлением лошадиной или бычьей сыворотки или гемолизированной крови. Для культивирования С. diphtheriae используют кровяной (5-10%) агар, сывороточный (10-15%) агар, свёрнутую сыворотку Леффлера или Ру, селективные среды с добавлением теллурита калия (кровяно-теллуритовый агар (КТА), среды Клауберга II и Тинсдейла-Садыковой, «Коринебакагар»). На плотных питательных средах С. diphtheriae gravis растёт преимущественно в R-форме, образуя через 48 час колонии диаметром 1,5-2,0 мм, с радиальной исчерченностью и неровными краями, напоминающие цветок маргаритки. Для С. diphtheriae mitis более характерна S-форма колоний (диаметр - 0,5-1,0 мм, с ровными краями, выпуклой гладкой поверхностью). С. diphtheriae intermedius образуют мелкие, слегка конусообразные, округлые колонии диаметром 0,5-1,0 мм. Куль-туральные свойства вида С. diphtheriae mitis var. belfanti, как и С. diphtheriae intermedius, сходны с биоваром mitis. При выделении С. diphtheriae из клинического материала для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры используют среды, содержащие теллурит калия. Большинство штаммов С. diphtheriae резистентны к относительно высоким концентрациям теллурита калия, способны за счёт продукции теллуритредуктазы восста-
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
навливать теллурит калия до металлического теллура и накапливать его внутри клеток, что придаёт колониям серо-чёрную или чёрную окраску. На жидких питательных средах R-формы С. diphtheriae (биотип gravis) растут, образуя плёнку на поверхности или крошкообраз-ный осадок, S-формы (биотип mitis) дают равномерное помутнение и мелкозернистый осадок.
Ферментативная активность невысокая. Ключевой дифференциально-диагностический признак - наличие фермента цистиназы, который выявляют на питательной среде Пизу (сывороточный агар, содержащий цистин и уксусно-кислый свинец). С. diphtheriae не обладают уреазной активностью, окисляют глюкозу и мальтозу, не разлагают сахарозу. Способность разлагать крахмал присуща только биотипу gravis. Тест на редукцию нитратов положителен для всех биотипов С. diphtheriae, за исключением С. diphtheriae mitis var. belfanti. Подвид C. diphtheriae subsp. lausannense обладает способностью сбраживать N-ацетилглюкозамин, в отличие C. diphthe-riae subsp. diphtheriae.
Факторы патогенности. Основной фактор пато-генности - дифтерийный токсин (ДТ), последовательность которого кодируется геном tox. Структурный ген tox переносится коринефагом при лизогенной интеграции генома ß-профага в хромосому C. diphtheriae и других близкородственных видов, обладающих функциональным dtxR-геном (Corynebacterium spp. и неток-сигенные штаммы C. diphtheriae), в результате чего они становятся токсигенными. Вирулентные штаммы могут нести в геноме две или три копии гена tox. Существуют разные, функционально эквивалентные сайты прикрепления (attB) для интеграции ß-профага в хромосому C. diphtheriae. Каждый attB-сайт расположен в гене Arg-tRNA2, который локализуется в двух разных участках хромосом. Регуляция токсинопродукции осуществляется металлорегуляторным белком DtxR - продуктом хромосомного гена dtxR - и зависит от экспрессии гена tox и метаболизма Fe2+.
Законсервированная dtxR-связывающая последовательность расположена рядом с промоторами гена tox и генов сидерофоров. Сидерофоры солюбилизируют и связывают Fe2+, транспортируют его в клетку бактерий через специфические мембранные рецепторы. Функциональная активность DtxR контролируется железом, Ni2+, Co2+, Mn2+, Cd2+, Zn2+. DtxR блокируется при низком содержании Fe2+ в среде, что ведёт к увеличению продукции токсина. Ответом на дефицит Fe2+ в среде является адгезия, колонизация, образование биоплёнки С. diphtheriae. DtxR может блокировать индуцированный Fe2+ эффект Фентона (генерация активных форм кислорода, токсичных для бактерий), защищая бактериальную ДНК от окислительного повреждения. Ген dtxR присутствует у токсигенных и нетоксигенных штаммов, и, помимо регуляции токсинопродукции, обусловливает посредством DtxR синтез сидерофоров, функционирование высоко аффинной транспортной системы (ciuABCDEFG) и транскрипцию трёх локусов, вовлеченных в работу геммонооксигеназы (hmuO).
Tox-ген C. ulcerans не идентичен таковому у С. diphtheriae вследствие большой неоднородности генетической последовательности, в отличие от высоко консервативного генома С. diphtheriae. Обнаружено сходство в последовательностях геномов C. ulcerans и C. pseudotuberculosis и их чёткое отличие от генома С. diphtheriae.
REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDICATION
ДТ - экзотоксин, секретируемый через цитоплазма-тическую мембрану без лизиса клеток. Зрелый внеклеточный ДТ - полипептид массой 58 кДа, содержащий 535 аминокислотных остатков. Молекула ДТ состоит из А- и В-фрагментов (м.м. 24 и 28 кДа), соединенных двумя дисульфидными мостиками. А-фрагмент обладает ферментативной активностью. В-фрагмент обусловливает связывание молекулы ДТ с фосфолипидами мембран клеток. Основная масса ДТ фиксируется клетками, имеющими соответствующие рецепторы: клетки человека, обезьян, кроликов, морских свинок. Динамика процессов связывания ДТ с рецепторами клеток протекает в две стадии. Первая - обратимая, длительностью около 30 мин., состоит в создании непрочной связи ДТ с рецепторами клеток. При этом клетка полностью сохраняет жизнеспособность, а ДТ, фиксированный на поверхности цитоплазматической мембраны, легко нейтрализуется антитоксическими антителами. Вторая стадия - необратимая - завершается в течение последующих 30-60 мин. В этот период структура и функция клеток ещё не претерпевают каких-либо изменений, но добавление антитоксической сыворотки уже не предохраняет клетки от цитопатогенного действия ДТ и последующей их гибели. Трансмембранный транспорт ДТ в клетки происходит адсорбционным эндоцитозом. В-фрагмент взаимодействует с прогепарин-связывающим эпидер-мальным фактором роста, подобным фактору роста НВ-EGF. В результате формируются трансмембранные каналы, по которым А-фрагмент перемещается в цито-золь. Механизм действия А-фрагмента ДТ основан на АДФ-рибозилировании фактора элонгации 2, ведущего к нарушению синтеза белка в клетке и её гибели. Антитоксические антитела, секретируемые в ответ на введение ДТ, функционально неоднородны и могут быть направлены как против А-, так и против В-фрагмента ДТ. Основным механизмом детоксикации является взаимодействие ДТ с антитоксинами, направленными против детерминант В-фрагмента, что препятствует присоединению ДТ к мембранам клеток. Антитоксические антитела нейтрализуют ДТ на поверхности клеток. В крови ДТ циркулирует в свободном состоянии или в составе циркулирующих иммунных комплексов. При тяжёлых формах дифтерии ДТ фиксируется в тканях и органах-мишенях, в кровь выходит небольшое количество ДТ. ДТ оказывает раздражающее воздействие на рецепторы слизистых оболочек и внутренних органов и цитопа-тогенное - на клетки миокарда, почек, надпочечников, нервной ткани, реже лёгких, печени, пищевода, желудка, кишечника, поджелудочной железы. Развитие постдифтерийных осложнений (кардиомиопатия, нейропатия) имеет аутоиммунную природу, которая обусловлена общностью антигенных детерминант В-субъединицы ДТ и экстрацеллюлярного домена рецептора НВ-EGF.
С. diphtheriae обладает факторами патогенности, обеспечивающими способность к адгезии и колонизации: пили, липоарабиноманнан клеточной стенки (Cdi-LAM), нефимбриальный поверхностный белок 67-72р (или DIP0733), поверхностный белок DIP1281, миколо-вые кислоты, корд-фактор, ферменты (гиалуронидаза, нейраминидаза, амилаза, протеаза).
Пили представлены в геноме типового штамма С. diphtheriae NCTC13129 (эпидемический клон Ros-sija/Sankt-Peterburg) тремя генетическими кластерами: spaABC, spaDEF, spaНGI. Каждый кластер кодирует синтез фимбрий соответствующих типов, представ-
ленных основными белками SpaА, SpaD, SpаH, которые формируют ось фимбрий. Пили содержат и малые субъединицы: SpaB, SpaC, SpaE, SpaF, SpaG, SpaI. SpaB равномерно распределяется вдоль стержня пиля, SpaC, SpaF, SpaG располагаются на его конце. Штаммы C. diphtheriae имеют различные типы пилей, между которыми существуют антигенные различия. Кластеры генов, кодирующих каждый тип фимбрий, содержат гены сортаз (англ. srt - surface protein sorting), специфически катализирующих ковалентное связывание фимбриаль-ных протеинов между собой, а основание фимбрий - с клеточной стенкой бактерий. Это происходит с участием специфического сайта с аминокислотной последовательностью LPxTG (где «х» обозначает любую аминокислоту).
SpaA-тип пилей C. diphtheriae кодируется кластером генов spaA-srtА-spaB-spaC. Осевая часть пиля SpaA-типа представлена большой SpaA-субъединицей, на боковой поверхности которой располагается малая субъединица SpaB, на кончике пиля - SpaC. Подобным образом устроены SpaD- и SpаH-пили. Большие субъединицы являются структурными компонентами пилей, малые - функциональными, играющими ключевую роль в адгезии. Каждый тип пилей вступает во взаимодействие с определёнными рецепторами на клетках хозяина: пили SpaA-типа взаимодействуют с фаринге-альными эпителиальными клетками, SpaD, SpaH - эпи-телиоцитами гортани и бронхов. Штаммы, не имеющие пилей, могут прикрепляться к клеткам хозяина за счёт компонентов клеточной стенки (CdiLAM, белок 67-72p (или DIP0733), DIP1281).
Липоарабиноманнан клеточной стенки (CdiLAM) расположен на поверхности клеточной оболочки, способствует связыванию с эпителиальными клетками хозяина и, взаимодействуя с TLR2, активирует дендритные клетки и Т-хелперы. CdiLAM не связывается с эритроцитами человека, но взаимодействует с клетками карциномы фарингеального эпителия Нер-2. CdiLAM рассматривается как адгезин и потенциальный фактор вирулентности С. diphtheriae.
Нефимбриальный поверхностный белок 67-72р (или DIP0733) распознаёт и специфически связывается с рецепторами эпителиальных клеток человека, способствует внутриклеточной инвазии C. diphtheriae, обусловливает цитопатическое действие и апоптоз, взаимодействует с эритроцитами человека, вызывая их агглютинацию.
Поверхностный белок DIP1281 ассоциирован с адгезией и инвазией, встречается у патогенных и непатогенных коринебактерий, в частности, C. diphtheriae, С. efficiens, С. glutamicum, C. jeikeium.
При дифтерийной инфекции зарегистрированы случаи прижизненной бактериемии, выделения токсиген-ного возбудителя из крови и органов умерших. Неток-сигенные штаммы C. diphtheriae и Corynebacterium spp. способны вызывать эндокардит, остеомиелит, абсцесс селезёнки, септический артрит и др. Эти системные инфекции предполагают адгезию коринебактерий на эпителиальных клетках, инвазию в более глубокие ткани и персистенцию в них. Это является свидетельством способности коринебактерий к инвазии, которая обусловлена поверхностными структурами бактериальной клетки и, в частности, белками DIP1281 и 67-72р (или DIP0733).
Миколовые кислоты, являясь физиологическим барьером проницаемости коринебактерий, участвуют в процессах адгезии, активируют врождённый иммуни-
тет, способствуя экспрессии TLR, ингибируют функцию макрофагов.
Корд-фактор обладает способностью нарушать процессы дыхания и фосфорилирования клеток хозяина, обусловливая устойчивость к фагоцитозу.
Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту соединительной ткани, что ведёт к повышению проницаемости кровеносных сосудов, выходу плазмы за их пределы, отёку тканей.
Нейраминидаза модифицирует клеточную поверхность, приводя к разжижению поверхностной слизи эпителия, и подготавливает рецепторы эпителиоцитов к прикреплению ДТ.
Амилаза, кодируемая amy-геном, утилизирует углеводы и создает дополнительный источник энергии для ускорения колонизации С. diphtheriae на слизистых оболочках человека и роста на питательных средах. Ами-лазная активность характерна только для C. diphtheriae биотипа gravis.
Протеаза инактивирует sIgA, в частности, его изотип sIgAr
Патогенез. Начальный этап инфекционного процесса - адгезия - обусловлен электростатической силой клеток, гидрофобностью клеточной оболочки C. diphtheriae, высокоспецифичным лиганд-рецептор-ным взаимодействием с клетками хозяина. Адгезия C. diphtheriae осуществляется посредством минорных пи-линов SpaA-типа за счёт тесного взаимодействия концов пилей с рецепторами эпителиоцитов хозяина, затем - боковых субъединиц от верхушки до основания пилей по типу замка «молнии». Затем во взаимодействие вступают малые субъединицы, расположенные на клеточной стенке коринебактерий. Такая плотная адгезия позволяет предотвратить диссоциацию бактерий, усиливая их взаимодействие с клетками хозяина и колонизацию.
Процесс адгезии C. diphtheriae облегчается действием фермента нейраминидазы (сиалидазы), разрушающей сиаловые кислоты на поверхности клетки хозяина. Это позволяет освободить поверхность клеток от слизи и интенсифицировать межклеточное взаимодействие. Колонизация слизистой оболочки C. diphtheriae осуществляется с участием фермента каталазы, разлагающей перекиси, продуцируемые представителями нормальной микрофлоры, что создает селективные преимущества С. diphtheriae перед индигенной микрофлорой хозяина в месте внедрения. Корд-фактор, ДТ, протеаза, каталаза подавляют местный иммунитет, разрушая sIgA (в том числе изотип sIgAj) и угнетая фагоцитоз. Разжижение слизи на эпителии верхних дыхательных путей, нарушение функции реснитчатого эпителия происходит под воздействием ДТ, нейраминидазы, гиалуронидазы.
ДТ, связываясь с комплементарным рецептором, проникает внутрь клетки хозяина и парализует её жизнедеятельность посредством ингибирования синтеза белка. Клетка некротизируется, формируя безопасное убежище для адгезированной С. diphtheriae, где она может размножаться, колонизируя другие клетки хозяина. Токсигенные и нетоксигенные штаммы C. diphtheriae, попадая в фагоцитирующие клетки, индуцируют их апоптоз и некроз, что может быть обусловлено действием ДТ, поверхностных структур коринебактерий, ферментов агрессии. Колонизация сопровождается формированием биоплёнки, что наиболее интенсивно происходит в условиях развития инфекции при дефиците железа.
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
Дальнейшее развитие инфекционного процесса может быть различным. Развитие классической клинической картины дифтерии чаще наблюдается у лиц с отсутствием антитоксического иммунитета. В месте внедрения С. diphtheriae наблюдают массивное размножение, сопровождающееся увеличением продукции ДТ и развитием некроза слизистой оболочки. Токсинемия является главным фактором, формирующим клиническую картину заболевания и определяющим его характер и исход. Помимо поражения слизистой оболочки верхних дыхательных путей и токсинемии формируются и системные осложнения - миокардит, нефрозо-не-фрит, пневмония, поражения нервной ткани, кишечника и др. Это указывает на то, что C. diphtheriae способна колонизировать эпителий, а ДТ - проникать в более глубокие ткани, взаимодействуя с различными типами клеток организма.
Формирование бактерионосительства токсигенных штаммов С. diphtheriae происходит, как правило, у лиц на фоне высокого уровня антитоксических антител и неполноценного антибактериального иммунитета. Бактерионосительство развивается за счёт факторов адгезии, инвазии, колонизации, имеющихся у токсигенных и не-токсигенных штаммов C. diphtheriae, а также способности к биоплёнкообразованию. ДТ, продуцируемый С. diphtheriae, поступает в лимфатическую систему и кровоток. При наличии антитоксинов у инфицированных лиц, как правило, не возникает ни местных, ни общих проявлений действия токсина и инфекционный процесс ограничивается бессимтомной колонизацией, т. е. носи-тельством.
Клиника. Типичная форма дифтерии сопровождается явлениями выраженной интоксикации и фибринозным воспалением слизистой оболочки и/или кожи в области входных ворот, при генерализации - выходом процесса за пределы первичного очага, триадой специфических острых поражений органов-мишеней: сердца (дифтерийные мио- и перикардиты), нервной системы (дифтерийная полинейропатия), почек (дифтерийная нефропатия). Характерно образование плёнок - фибринозных наложений беловато-серого цвета с чёткой границей краёв наложений, возвышающихся над эпителием первичного очага, при локализации в дыхательных путях - с возможной их обструкцией.
В соответствии с МКБ 10 (с дополнениями 2019 г.) под кодом «А 36.» выделяют: дифтерию глотки (дифтерийная мембранозная ангина, тонзиллярная дифтерия) - часто встречаемая форма дифтерии (90-95% случаев), гортани (по частоте регистрации занимает второе место), носоглотки, кожи, другие формы дифтерии (конъюнктивы, носа, половых органов, комбинированная, дифтерийный миокардит, полиневрит) и неуточненную дифтерию.
В 2016 г. предложена новая Российская классификация дифтерии. По клиническому варианту (локализация дифтерийных плёнок) выделяют дифтерию миндалин/ ротоглотки - при распространении с миндалин на язычок, мягкое и твёрдое нёбо и слизистую оболочку полости носа/носоглотки; гортани/гортаноглотки; трахеи и бронхов; полости рта; дифтерию глаза, ушей, кожи; дифтерию половых органов и комбинации разных локализаций. Выделяют локализованную форму дифтерии и генерализованную (распространение возбудителя за пределы первичного очага, наличие специфического дифтерийного отёка подкожной клетчатки и окружающих тканей в области первичного очага инфицирования,
REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDICATION
возможен волнообразный характер поражения органов-мишеней за счёт выхода депонированного ДТ из лимфоузлов). При формулировке диагноза указывается форма заболевания (по тяжести течения) и острое дифтерийное поражение внутренних органов (при наличии): сердца, нервной системы, почек и других органов.
Частыми осложнениями дифтерии, сопровождающейся острыми поражениями внутренних органов, является развитие инфекционно-токсического шока, отёка головного мозга, острой дыхательной, сердечной, почечной недостаточности, ДВС-синдрома, реже - пневмонии, поражения кишечника, печени. Они являются ранними предикторами неблагоприятного тяжёлого течения инфекции. Частота возникновения, характер, тяжесть течения осложнений коррелируют с выраженностью клинических проявлений и сроками начала введения противодифтерийной сыворотки.
Первичное бактерионосительство C. diphtheriae является бессимптомной формой инфекционного процесса. Оно может быть транзиторным (однократное обнаружение возбудителя), кратковременным (выделение в течение 2-х нед), средней продолжительности (до 1 мес), затяжным (1-6 мес), хроническим (более 6 мес). Продолжительное носительство часто выявляется у детей с патологией ЛОР-органов (хронический тонзиллит, аденоидит, синусит), у часто болеющих детей, при дис-биозе слизистой оболочки ротоглотки и носа.
Лечение. Лечение больных дифтерией проводится в специализированном инфекционном боксированном стационаре. Используются этиотропные, патогенетические, симптоматические средства. Основополагающим в терапии всех клинических форм является применение антитоксической противодифтерийной сыворотки (ПДС), которая должна вводиться немедленно после постановки диагноза. Использование ПДС в поздние сроки заболевания не гарантирует защиту от осложнений, при гипертоксической форме - не предупреждает летального исхода. При локализованных формах дифтерии ротоглотки введение ПДС в поздние сроки (после 4-го дня) заболевания нецелесообразно, так как существенно не влияет на клиническую симптоматику. Исключение составляют больные, у которых к моменту госпитализации сохраняются налёты на миндалинах. При тяжёлых токсических формах дифтерии ПДС вводится независимо от сроков госпитализации. Первичная и курсовая дозы ПДС определяются клинической формой дифтерии.
Антибактериальная терапия при локализованных формах дифтерии проводится с использованием макро-лидов (азитромицин, кларитромицин, рокситромицин и др.) и защищённых аминопенициллинов (доксициклин, юнидокс, рифампицин). При токсических формах дифтерии препаратами выбора являются цефалоспорины 3-го поколения (цефотаксим, цефтриаксон, цефиксим и др.), аминопенициллины (амоксициллин и его защищён-ные формы), рифампицин.
В комплекс лечения входит детоксикационная терапия, которая проводится энтерально и путём внутривенного введения глюкозо-солевых растворов. В лечении токсических форм дифтерии ротоглотки перспективно применение экстракорпоральных методов детоксикации (гемосорбция, плазмаферез) с использованием специфических иммуносорбентов. Применение кортикостеро-идов, антиоксидантов, кардиотропных средств патогенетически обосновано при тяжёлых формах дифтерии, развитии тяжёлых осложнений.
Санация носителей токсигенных штаммов C. diph-theriae проводится с помощью макролидов, рифампи-цина, тетрациклинов (доксициклин, юнидокс). При длительном бактериовыделении рекомендуется 2-3 курса антибактериальной терапии. Используют гипосенсиби-лизирующие препараты (цетиризин, лоратадин и др.), поливитамины (группы В, С, А, Е, микроэлементы), адаптогены (элеутерококк, лимонник), средства, повышающие резистентность слизистой оболочки ротоглотки (лизобакт, ИРС-19, рибомунил, тонзилотрен).
Лабораторная диагностика. Лабораторная диагностика включает бактериологический, биологический, иммунохимический (РПГА, ИФА), молекулярно-биоло-гический (ПЦР, риботипирование, энзимотипирование, секвенирование ДНК) методы. При постановке диагноза «дифтерия» помимо данных лабораторного исследования необходимо учитывать клиническую картину заболевания и данные эпидемиологического анамнеза.
Бактериологический метод является основным. Другие методы исследования имеют вспомогательное значение. Бактериологическое исследование направлено на выделение и идентификацию C. diphtheriae по токсиген-ным и биохимическим свойствам в короткие сроки (3-4 дня) с помощью минимального количества диагностических тестов.
Обследование проводят с диагностической или профилактической целью, по эпидемическим показаниям. Диагностическому обследованию на дифтерию подлежат все больные с ангинами, хроническим тонзиллитом, паратонзиллярным и заглоточными абсцессами. Обследование с профилактической целью проводят при поступлении в лечебно-профилактические учреждения, санатории, закрытые специализированные учреждения, при переводе из одного закрытого специализированного учреждения в другое. По эпидемическим показаниям обследуют всех контактных лиц в очагах дифтерии. Особое внимание следует обращать на выявление скрытых бактерионосителей, которые на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета не имеют клинических проявлений дифтерии, но являются источником инфекции для окружающих.
Материал для исследования (слизь, отделяемое и плёнки из зева и носа) отбирают с помощью двух отдельных сухих тампонов с последующим посевом на одну чашку с плотной питательной средой (при необходимости в транспортную среду). При наличии налёта материал берут с границы поражённой и здоровой ткани. При подозрении на экстрабуккальные формы дифтерии проводят забор из очагов поражения (глаз, ухо, кожа, влагалище и др.) одним сухим тампоном, также следует брать материал из носа и зева двумя сухими тампонами. От больных материал должен быть взят в течение 3-4 ч (не позднее 12 ч) с момента поступления в стационар до назначения антибактериальной терапии.
Для выделения C. diphtheriae проводят прямой посев материала, взятого сухим ватным тампоном или тампоном после культивирования в транспортной среде, на одну из элективно-селективных сред для C. diphtheriae. Предпочтение отдается кровяным теллури-товым средам. Через 24 ч инкубации на кровяных тел-луритовых средах формируются колонии, окрашенные в чёрный или тёмно-серый цвет. Замедленное формирование подозрительных колоний (через 48 ч) в основном выявляется при исследовании материала, взятого у бактерионосителей. Признаки, характерные для ко-
лоний биоваров gravis, mitis, intermedius, проявляются через 48 часов. Эти колонии исследуют на токсигенные свойства. Необходимо изучать токсигенные свойства нескольких колоний, так как из исследуемого материала могут быть выделены одновременно токсигенные и нетоксигенные клоны C. diphtheriae. Для определения токсигенности используют традиционный или модифицированный тест Элека, основанный на методе встречной иммунодиффузии токсина и антитоксина в специальных питательных средах (среда для определения токсина дифтерийного микроба, коринетоксагар). При постановке теста Элека делают посев по У каждой из двух изолированных колоний на среду для определения токсигенности и необожжённой петлей - уколом в столбик среды Пизу; другую половину колонии отсевают в пробирку со скошенным 10% сывороточным агаром, из оставшихся нескольких (5-7) колоний формируют бляшки. В случае множественного роста подозрительных колоний проводят определение уреазной активности в пробе Заксе. При обнаружении только одной колонии её засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петлю, в среду Пизу для определения цистиназной активности. После учёта результатов для дальнейшей идентификации используют культуру со среды Пизу или из бляшки. У выросшей на сывороточном агаре культуры изучают морфологию (окраска по Леффлеру), определяют биохимические свойства (глюкоза, сахароза, мальтоза, крахмал, декстрин), уреазную активность. При необходимости идентифицировать C. ulcerans используют тесты на уреазу и восстановление нитратов в нитриты.
Критерием оценки специфичности преципитатов в тесте Элека служит время появления и расположение
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
линий преципитации испытуемого штамма по отношению к линиям преципитации контрольного токси-генного штамма. Специфические линии преципитации появляются через 24-48 ч, сливаются или направлены на слияние с линиями контрольного штамма. У штаммов C. diphtheriae с низким уровнем продукции токсина специфические линии преципитации могут формироваться позже.
Выявление цистиназной активности, способности окислять глюкозу и мальтозу, отношение к крахмалу, декстрину и отсутствие уреазы, наряду с характерными морфо-культуральными признаками (полиморфизм, метахроматичное окрашивание, формирование колоний чёрного или серого цвета на кровяных теллуритовых средах) позволяют отнести клинический изолят к одному из биоваров C. diphtheriae. Выделенный в результате бактериологического исследования штамм C. diphthe-riae является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами.
Основной метод определения ДТ - иммунодиффузия в агаре по Элеку - высокоспецифичен, но позволяет выявлять ДТ только у 84% и 80,4% штаммов, выделенных от больных и носителей соответственно. Для выявления слабо токсигенных штаммов C. diphtheriae возможно использование РНГА и ИФА (см. таблицу).
Эти методы не являются обязательными, но по сравнению с тестом Элека обладают преимуществами по чувствительности и времени проведения анализа. С помощью ИФА возможно выявлять ДТ в бульоне при культивировании патологического материала без этапа выделения чистой культуры. Результаты РНГА и ИФА позволяют дать только предварительный ответ о наличии ДТ.
Tаблица 1
Методы определения токсина и tox-гена C. diphtheriae
Метод Цель Чувствительность Длительность Штаммы
Иммунохими- метод Элека детекция ДТ 0,5-1,0 мкг/мл 24-48 ч токсигенные
ческий РНГА детекция и определение 0,003 Шмл несколько токсигенные и сла-
уровня продукции ДТ часов ботоксигенные
ИФА детекция и количествен- 0,8-1,5 нг/мл несколько токсигенные и сла-
ное определение про- часов ботоксигенные
дукции ДТ
РКоА детекция ДТ чувствительный несколько токсигенные
минут
РЛА детекция и определение 0,001 Шмл несколько токсигенные и сла-
уровня продукции ДТ часов ботоксигенные
Биологический внутрикожная проба определение ДТ по мини- ~ 100000 м.к. 48-72 ч токсигенные
на морских свинках и мальной некротической
кроликах дозе DNM
внутрибрюшинная определение ДТ по 20-60 нг 48 ч токсигенные
проба на морских минимальной летальной
свинках дозе DLM
подкожная проба на детекция ДТ по летально- высокочувствитель- до 5 дней токсигенные
морских свинках му исходу ный
цитотоксичный тест детекция ДТ 0,001 мкг 5-6 дней токсигенные и сла-
на культуре клеток ботоксигенные
Vero
ПЦР детекция /ох-гена и dtxR- >104 м.к. несколько - токсигенные
гена часов - нетоксигенные
Молекулярно- - несущие tox-ген
биологический секвенирование ДНК детекция мутации /ох- Высокочувствитель- несколько - токсигенные
гена и dtxR-гена ный при наличии часов - нетоксигенные
мутаций - несущие tox-ген
REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDICATION
Молекулярно-генетические методы применяют для ускоренной диагностики дифтерийной инфекции (ПЦР) и эпидемиологического мониторинга (ПЦР, ри-ботипирование, энзимотипирование, секвенирование ДНК). ПЦР используют для детекции генов tox и dtxR, кодирующих синтез ДТ. Разработаны различные варианты генодиагностики дифтерийной инфекции (ПЦР в классическом варианте, ПЦР в реальном времени, генодиагностика на основе LAMP, ПЦР в формате мульти-плекс). При использовании ПЦР гены, ответственные за продукцию ДТ, обнаруживают в минимально короткие сроки (в течение одного рабочего дня), при этом можно исследовать чистую и mixt-культуры. Наличие в аналите микроорганизмов контаминантов не влияет на результаты исследования. Результаты ПЦР подтверждают в тесте Элека. Некоторые штаммы, отрицательные в тесте Элека, могут быть положительны в ПЦР. Это является следствием наличия dtxR в геноме как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae. Учитывая, что не продуцирующие токсин, но несущие dtxR штаммы могут явиться причиной серьёзных заболеваний у человека, необходимо расширение подходов к ихидентифика-ции с помощью ПЦР-диагностики.
Бактериологическую диагностику дифтерии и инфекций, вызываемых условно-патогенными корине-бактериями, можно проводить с использованием тест-систем (ФГУП НПО «Микроген», ООО НПО «Диагностические системы», «apiCoryne» («bioMERIUX»). Перспективным методом является MALDI-ToF масс-спектрометрия, основанная на определении уникального молекулярного состава белков и пептидов микроорганизмов.
Комплексное применение различных методов и современных технологий значительно повышает эффективность лабораторной диагностики дифтерии.
Вакцинопрофилактика. Ведущая роль в создании противодифтерийного иммунитета принадлежит антитоксину, который вырабатывается в организме в ответ на поступление дифтерийного анатоксина. Впервые дифтерийный анатоксин получил в 1922 г. Г. Рамон. В России в соответствии с Национальным календарем прививок применяют препараты отечественного производства: АКДС, АДС, АДС-М, АД-М. Разрешены к использованию на коммерческой основе зарубежные комбинированные препараты: Тетракокк, Бубо Кок, ДТ-Вакс, ДТ-Адъюльт («AventisPasteur», Франция), АаКДС «Инфанрикс» («SmitKlein», Германия). Перспективным является использование конъюгированных полимер-субъединичных вакцин, создание векторных и субъединичных вакцин. Для профилактики дифтерийного бактерионосительства, справиться с которым существующими средствами вакцинопрофилактики невозможно, перспективной является разработка новых вакцинных препаратов на основе адгезинов С. diphtheriae, способных стимулировать действие факторов врождённого и адаптивного иммунитета.
Вопросы для самоконтроля:
1. Роль факторов патогенности C. diphtheriaе в патогенезе заболевания?
2. Методы лабораторной диагностики дифтерии?
3. Методы определения токсигенности C. diphtheriaе? Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Чагина И.А., Переварова Ю.С., Переваров В.В., Чаплин А.В., Борисова О.Ю., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С., Алеш-кин В.А. Полиморфизм гена dtxR у современных штаммов Oorynebacterium diphtheriae. Вестник РГМУ. 2017; (1): 34-41.
2. МУК 4.2.3065-13. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции: методические указания (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 14.07.2013 г.). М.; 2013.
3. Борисова О.Ю., Пименова А.С., Чаплин А.В., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Алёшкин А.В., Афанасьев М.С., Караулов А.В. Ускоренный способ генодиагностики дифтерии на основе изотермальной амплификации для выявления ДНК возбудителя. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; (5): 24-32.
4. Sharma N.C., Efstratiou A., Mokrousov I., Mutreja A., Das B., Ra-mamurthy T. Diphtheria. Nat. Rev. Dis. Primers. 2019; 5(1): 81.
5. Oliveira A., Oliveira L.C., Aburjalle F., Benevides L., Tiwari S., Jamal S. B., Silva A. Insight of Genus Corynebacterium: Ascertaining the Role of Pathogenic and Non-pathogenic Species. Frontiers in Microbiology. 2017; (8): Article 1937.
6. Ott L. Adhesion properties of toxigenic Oorynebacteria. AIMS Microbiol. 2018; 4 (1): 85-103.
REFERENCES
1. Chagina I.A., Perevarova Yu.S., Perevarov V.V., Chaplin A.V., Borisova O.Yu., Kafarskaya L.I., Afanasiev S.S., Aleshkin V.A. DtxR gene Polymorphism in modern strains of Corynebacterium diphtheriae. Vestnik RGMU. 2017; (1): 34-41. (in Russian)
2. MUC 4.2.3065-13. Control method. Biological and microbiological factors. Laboratory diagnostics of diphtheria infection: guidelines (approved by the Federal service for supervision of consumer rights protection and human welfare, Chief state sanitary doctor of the Russian Federation G. G. Onishchenko 14.07.2013). Moscow; 2013. (in Russian)
3. Borisova O.Yu., Pimenova A.S., Chaplin A.V., Kafarskaya L.I., Afanasiev S.S., Aleshkin V.A., Aleshkin A.V., Afanasiev M.S., Karaulov A.V. Accelerated method of diphtheria genodiagnostics based on isothermal amplification for detecting the pathogen's DNA. Zhurnal mikro-biologii, epidemiologii i immunobiologii. 2017; (5): 24-32. (in Russian)
4. Sharma N.C., Efstratiou A., Mokrousov I., Mutreja A., Das B., Ra-mamurthy T. Diphtheria. Nat. Rev. Dis. Primers. 2019; 5(1): 81.
5. Oliveira A., Oliveira L.C., Aburjalle F., Benevides L., Tiwari S., Jamal S. B., Silva A. Insight of Genus Corynebacterium: Ascertaining the Role of Pathogenic and Non-pathogenic Species. Frontiers in Microbiology. 2017; (8): Article 1937.
6. Ott L. Adhesion properties of toxigenic corynebacteria. AIMS Microbiol. 2018; 4(1):85-103.
Поступила 18.06.20 Принята к печати 18.07.20
