CC BY
24
ПРЕПАРАТЫ
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВАКЦИННОГО ШТАММА Л-3 ОТ ДРУГИХ ШТАММОВ ВИРУСА ПАРОТИТА МЕТОДОМ ОТ-ПЦР
'Кулак М. В.,1 Бела вин П. A.f Wemecoea H.A., 2Юнасова Т.Н., Толикова Л. Н„ \2Бектемиров T.A.j 'Игнатьев Г.М.
1 Научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская обл., п. Кольцово; Институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва; 3НП0 «Сибэнзим», Новосибирск
г Предложен метод дифференциации вакцинного штамма Л-3 от всех штаммов других гено- л типов вируса паротита в образцах спинномозговой жидкости, слюны и крови на основе ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа. Показана его воспроизводимость и специфичность, определена чувствительность. Получена рекомбинантная плазмида, содержащая полноразмерную копию гена И/ЫЬ вируса паротита штамма Л-3, которая является положительным контролем при дифференциации Л-3 от остальных штаммов. Данный подход был использован для определения РНК вируса паротита в слюне и крови добровольцев, привитых живой паротитной вакциной на основе штамма Л-3, а также 18-и пациентов с подтвержденным диагнозом «эпидемический паротит».
Ключевые слова: вакцинный штамм Л-3, дифференциация, асептический менингит
у _/
Зпидемический паротит входит в число пяти наиболее распространенных респираторных вирусных заболеваний человека. Вспышки заболевания регистрируются практически во всех странах мира [6, 18, 19, 21, 22, 31, 32, 33]. Возбудителем является вирус паротита, принадлежащий к семейству Рагаптхом^ае, роду РиЬи^гиэ [30]. Основные симптомы заболевания — лихорадка, общая интоксикация, увеличение одной или обеих слюнных желез, и осложнения, одно из которых — асептический менингит (АМ) [23]. Данное осложнение может привести к энцефалиту, развитию паралича и даже к смерти [29]. Эффективным средством профилактики паротита является вакцинация. Для производства вакцин используются штаммы, относящиеся к разным генотипам: иегу! 1_упп и РиЫп1 — генотип А; 11гаЬе — генотип В; ЬгадгеЬ — генотип О [17, 27]. Российский штамм Ленинград-3 (Л-3) близок к штамму ЬгадгеЬ, но не может быть отнесен к генотипу Э [4, 9]. Частота возникновения АМ для перечисленных вакцинных штаммов несколько отличается. Так, частота АМ для штамма иегуШпп составляет в среднем 0,61 на 100 ООО доз случаев АМ [10]. Для штамма ИиЫ™ этот же показатель составил в среднем 6 на 100 000 привитых [13, 25]. Для штамма 11гаЬе отмечалось 100 случаев АМ на 100 000 привитых [36], что привело к отказу от применения данной вакцины. Нет достоверных данных о случаях АМ при применении отечественной вакцины. Во время мониторинга заболеваемости паротитом в Новосибирске в 2002-2005 гг. не было выявлено и подтверждено ни одного случая АМ при вакцинации и ревакцинации 80 тыс.
чел. Штамм Л-3 генетически близок к штамму L-Zagreb, но не является абсолютно идентичным ему [4,7]. Штамм L-Zagreb применяется для производства вакцины против эпидемического паротита в Хорватии, Индии и Египте. По данным индийских исследователей, результаты использования вакцины MMR, в состав которой входит штамм L-Zagreb (производства Serum Institute of India Ltd.), в периоде 1998 по 2004 гг. было применено 190 723 дозы. В результате было зарегистрировано всего два случая АМ у 15 — и 16-месячных детей, симптомы которого исчезли через одну неделю после появления [28]. Данные, полученные в Бразилии, о случаях АМ при применении вакцины на основе штамма L-Zagreb индийского производства достаточно противоречивы. Так, в одном случае частота АМ составила один случай на 6199 привитых, а в другом — один случай на 19 247 привитых [15]. В тоже время данные других исследователей, зарегистрировавших один случай АМ на 95 361,5 привитых (что составляет 0,5033-1,5519 на 100 000 доз), демонстрируют более низкую частоту АМ при применении данного вакцинного штамма [16].
Иногда при изучении АМ, возникающего при применении вакцин против эпидемического паротита, могут применяться либо не релевантные методы учета [20, 34, 35], либо не адекватные методы исследования [16, 24], что может приводить к расхождению данных в оценке количества поствакцинальных осложнений, и, как следствие, к не правильным выводам [11].
Поэтому целью исследования явилось разработка молекулярно-генетического подхода по дифференци-
G
Таблица
Структура олигонуклеотидов
Название Структура олигонуклеотидов 5'->Зч Позиция в геноме Длина
L-3dF ATGTAATTAATGCCAACTGC 7200-7220 20
L-3dR 1 TATGATCTCAAAGCACGCTG 7687-7707 20 ¡
H/Nh-f CCCAGATCTGCCAACTG CAAGGATCATACT 7211-7242 31
H/Nh-r CCCAAGCTTCGCTG CATTCACTATGACTCAA 8327-8359 32
альной диагностике случаев АМ, ассоциированного с применением вакцины против эпидемического паротита на основе штамма Л-3.
Материалы и методы
Вирусы. В работе были использованы следующие штаммы: вакцинный штамм Л-3, штамм Urabe (генотип В) (из ГИСК им. Л.А. Тарасевича); штамм Dragoon (генотип С) и штамм PetroNov, (генотип Н) (из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор«); штамм Enders, (генотип А) (из АТСС); штамм London 1 (генотип D) (из FDA). Штаммы вируса паротита культивировали по ранее описанной методике [1].
Выделение РНК и реакция обратной транскрипции (ОТ). Выделение суммарной РНК из биологических образцов и постановку ОТ проводили, как описано ранее [2].
Оли гону клеотиды. Праймеры L-3dF и L-3dR использовали для дифференциальной диагностики вакцинного штамма Л-3 вируса паротита (таблица). Праймеры H/Nh-f и H/Nh-r использовали для амплификации и последующего клонирования полноразмерного гена H/Nh вируса паротита штамма Л-3 в векторную плазми-ду (таблица). Все праймеры рассчитывали с использованием программного пакета Vector NTI Advance 10 (Informax ink., США).
Получение ДНК фрагмента генома вируса с помощью ПЦР. ПЦР проводилась в объеме 50 мкп, как описано ранее [3]. Условия ПЦР для всех реакций: денатурация 95 °С 5 мин, затем 30 циклов 20 с при 95 °С, 30 с при 55 °С, 1 мин при 72 °С и заключительный этап — 7 мин при 72 °С.
Клонирование фрагментов в вектор pHisE E.coli. Все генно-инженерные манипуляции проводили, как описано ранее [5].
Определение нуклеотидных остатков ДНК. Последовательность нуклеотидных остатков была определена при помощи автоматического сиквенатора Beckman CEQ 2000 (Beckman Coulter, США). Все манипуляции проводили согласно инструкциям, прилагаемым фирмой производителем.
Добровольцы. С участниками исследования подписывалось информационное соглашение об участии в данных исследованиях. Все исследования проводились по согласованию с Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB00001360).
Результаты и обсуждение_
Выбор диагностического фрагмента и постановка ОТ-ПЦР
Проведенный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов, представляющих все 13 ге-
Э
нотипов вируса паротита от А до L поданным Gene Bank, позволил выбрать область 7200-7707 п.н. генома штамма Л-3, которая содержала два сайта узнавания эндо-нуклеазы Taql TCGA так, что один из сайтов являлся уникальным для штамма Л-3, а другой сайт был общим среди всех генотипов вируса паротита. Расчетная длина фрагмента составила 508 п.н. Области гибридизации праймеров являлись консервативными для всех исследованных геномов. Оценку специфичности праймеров в ОТ-ПЦР проводили, используя шесть штаммов вируса паротита: London-1, L-3, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders (номера в базе данных Gene Bank Х98874.1, AY508995, AY681495, AY669145, Х93181, Х93176,соответственно). Результаты ОТ-ПЦР представлены на рис. 1: во всех случаях амплифицируется фрагмент расчетной длины (508 п.н.). Последовательность нуклеотидных остатков всех полученных ампликонов определяли по методу Сэнгера, как описано выше. Результаты подтвердили подлинность амплифицированных фрагментов.
Рестрикционный анализ диагностических фрагментов, полученных в ОТ-ПЦР
Специфический гидролиз полученных фрагментов проводили с помощью эндонукпеазы рестрикции Taql в условиях, рекомендованных производителем («СибЭн-зим», Россия). При обработке продукта амплификации эндонукпеазой рестрикции Taql, в случае с Л-3 образуется три фрагмента с длинами: 148, 152, 208 п.н. В случае с любым другим штаммом вируса паротита выявляются два фрагмента: 356, 152 п.н. Результаты рестрикционного анализа всех шести ампликонов, полученных в ОТ-ПЦР, представлены на рис. 2: видно, что в результате специфического гидролиза в случае штаммов London-1, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders образуются продукты с расчетными длинами 356 и 152 п.н. При гидролизе фрагмента штамма Л-3 образуются три фрагмента с расчетными длинами: 148, 152 и 208 п.н., на рис. 2 они представлены двумя полосами длинами около 150 п.н. и 200 п.н. Для использования данного подхода дифференциации вакцинного штамма /1-3 от других штаммов с помощью ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией, была сконструирована векторная плазмида, несущая в своем составе клонированный ген гемагглютинина штамма Л-3 в качестве положительного контроля.
Клонирование гена HN/h в векторную плазмиду pHisE
Последовательность гена HN/h вируса паротита штамма Л-3 получали методом ПЦР. Фрагмент ДНК встраивали в векторную плазмиду pHisE по сайтам рестрикции Hindlll и Bglll, как описано ранее [5]. В дальнейшем, полученную рекомбинантную плазмиду pHisE-H/Nh ис-
ПРЕПАРАТЫ
500 п.н.
Рис. 7.
Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента гена гемагглютинина в 2%-м агарозном геле. Длина продукта — 508 п.н. 1 и 8 — маркеры, 2-7 — штаммы: London-1, L-3, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders вируса паротита соответственно.
400 п.н. 300 п.н. 200 п.н.
100 п.н.
Рис. 2.
Электрофореграмма рестриктов гена HN/h в 4%-м агарозном геле. 1 и 8 — маркеры длин, 2-7 — штаммы: London-1, L-3, PetroNov, Dragoon, Urabe, Enders вируса паротита, соответственно.
200 п.н.
Рис. 3.
Электрофореграмма продуктов амплификации и рестрикции в 4%-м агарозном геле. 1 — маркер, 2 — продукт амплификации штамма Dragoon; 3,5 и 7 — результат рестрикции полученных фрагментов; 4 — продукт амплификации штамма Л-3; 6 — результат амплификации целевого фрагмента с рекомбинантной плазмиды pHisE-H/Nh, использованной в качестве матрицы.
пользовали в качестве положительного контроля во всех манипуляциях.
ОТ-ПЦР с образцами спинномозговой жидкости (СМЖ), полученных от внешне здоровых людей, а также пациентов с диагнозами гнойный (не вирусный) менингит и клещевой энцефалит
Для изучения специфичности ОТ-ПЦР в исследовании было использовано всего 102 образца СМЖ. Из них 21 образец получен от внешне здоровых людей, 32 образца от пациентов с диагнозами гнойный менингит и 49 с диагнозом клещевой энцефалит. Все образцы были отрицательны на наличие РНК вируса паротита.
Далее была определена чувствительность метода ОТ-ПЦР. Для этого ранее исследованные образцы СМЖ были контаминированы вирусной суспензией в объеме 100 мкл содержащей по 5000 ТЦПД50 вируса паротита штамм Л-3. Полученные пробы титровали 10-кратным разведением до седьмого разведения включительно. В дальнейшем, из пробы каждого разведения была поставлена ОТ-ПЦР. Результаты показывают, что использованный метод позволяет выявить РНК вируса паротита в 98 пробах из 102 (96%) в 0,005 ТЦПД50. Последующий рестрикционный анализ ампликонов соответствовал расчетному. Пример электрофореграммы приведен на рис. 3. Показано, что при использовании пары прайме-ров 1_-3-сШ и 1_-3-с1Р амплифицируется продукт ожидаемой длины. Длины фрагментов, образующихся после обработки эндонуклеазой Тад1, совпадают с теоретически рассчитанными. Картины гидролиза и амплификации целевого фрагмента, полученного с РНК штамма Л-3 вируса паротита и рекомбинантной плазмиды р^зЕ-Н/ЫИ, совпадают.
Определения РНК вируса паротита в образцах, полученных от добровольцев, привитых вакциной против эпидемического паротита на основе штамма Л-3
В исследование был взят биологический материал восьми добровольцев, которые были привиты вакциной против эпидемического паротита. В течение 21 сут. проводилось ежедневное наблюдение за добровольцами, включающее в себя осмотр кожных покровов в месте инъекции, термометрию, осмотр зева. В течение этого срока собирали образцы слюны и крови (из пальца) для определения РНК вируса паротита. Образцы сыворотки крови и слюны хранили до проведения исследований при температуре — 70 °С. У добровольцев исследовали слюну и кровь на наличие РНК вируса методом ОТ-ПЦР с 1 -х по 7-е сут. В течение всего срока наблюдения ни в одном из образцов крови от добровольцев РНК вируса паротита не была обнаружена. РНК вируса паротита в слюне у всех волонтеров обнаруживалась на 2-е, 3-й и 4-е сут. после вакцинации. Подлинность ампликонов была установлена сиквенированием. Полученные амп-ликоны гидролизовали эндонуклеазой 7ад/, при этом результаты полностью совпали с расчетными.
Определения РНК вируса паротита в образцах, полученных от пациентов с диагнозом эпидемический паротит
В исследовании были взяты образцы слюны и крови 18-ти пациентов с клинически подтвержденным диагнозом «Эпидемический паротит». Используя стандартный подход для диагностики эпидемического паротита, заключа-
G
ющийся в амплификации гена SH [26], была обнаружена РНК вируса паротита в слюне у всех 18-ти пациентов, при этом в крови ни в одном из случаев РНК вируса паротита не обнаруживалась. Филогенетический анализ последовательностей полученных ампликонов показал, что все они принадлежат к «дикому» генотипу Н. Более подробный анализ случаев заболевания эпидемическим паротитом, описанных здесь, был опубликован нами ранее [8]. Для проверки чувствительности разработанного нами подхода к определению и дифференциации вируса паротита из положительных образцов слюны была выделена суммарная РНК и использована в ОТ-ПЦР с разработанными нами праймерами (L-3dFn L-3dR), как описано выше. В результате все 18 образцов оказались положительными. При последующей обработке полученных дифференциальных ампликонов рестриктазой Taql, картина гидролиза полностью совпала с ожидаемой.
В результате проделанной работы показана возможность дифференциации вакцинного штамма Л-3 от всех штаммов других генотипов вируса паротита в образцах СМЖ, слюны и крови методом ОТ-ПЦР и последующей рестрикцией ампликонов. Данный подход был осуществлен впервые, так как ранее предложенные методы детекции РНК вируса паротита либо просто подтверждали ее наличие [24], либо требовали дополнительных манипуляций, таких как сиквенирования генаЭН [14, 12]. РНК вируса паротита не была обнаружена в контрольных образцах СМЖ, взятой у пациентов с менингитом, энцефалитом, а также внешне здоровых людей. Таким образом, отсутствие ложноположительных результатов позволяет использовать данный метод для уточнения и/или опровержения паротитной этиологии заболевания при асептическом менингите, а также при других случаях заболеваний центральной нервной системы. Данный подход особенно информативен в случаях поствакцинальных осложнений при применении вакцины против эпидемического паротита на основе штамма Л-3, поскольку позволяет дифференцировать вакцинный штамм от «диких». Получена рекомбинантная плазмида, содержащая полноразмерную копию гена H/Nh вируса паротита штамма Л-3, которая является положительным контролем при дифференциации Л-3 от остальных штаммов. Таким образом, используя наш метод, можно определить наличие РНК вируса паротита и одновременно дифференцировать случай поствакцинального осложнения (AM), вызванного вакцинным штаммом Л-3, от случаев заболевания эпидемическим паротитом.
Авторы выражают благодарность Е.К. Букину за помощь в получении биологических материалов
Литература
1. Агафонов А.П., Ничеухина С.Н., Патрушев H.A. и др.//Вопросы вирусологии. — 1997. — № 5. — С. 222-228.
2. Кулак М.В., Букин Е.К., Отрашевская Е.В. и др.// Биопрепараты. — 2007. — № 2. — С. 13-19.
3. Кулак М.В., Нетесова H.A., Белавин П.А. и др.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2008. — № 1. — С. 34-37.
4. Неверов A.A., Игнатьев Г.М., Юнасова Т.Н. и др.// Биопрепараты. — 2005. — № 6. — С. 21-27.
5. Нетесова H.A., Белавин П.А., Серегина Е.В. и др.// ДАН. — 2004. — Т. 397. — № 4. — С. 546-548.
э
6. Afzal M.A., J. Buchanan J., A. Dias M. et al.//J. Med. Virol. — 1997. — № 52. — P. 349-353.
7. Atrasheuskaya A.V., Blatun E.M., Kulak M.V. et al.// Vaccine. — 2007. — 25(24). — P 4651-4658.
8. Atrasheuskaya A.V., Kulak M.V., RubinS. etal.//Clin. Microbiol. Infect. — 2007. — 13(7). — P. 670-676.
9. Atrasheuskaya A.V., Neverov A.A., Rubin S. et al.// Vaccine. — 2006. — 6; 24(10). — P. 1530-1538.
10. Black S., Shinefield H., Ray P et al.//Pediatm Infectto Disio J. — 1997. — 16(5). — P. 500-503.
11. Bonnet M.C., Dutta A., Weinberger C. et al.// Vaccine. — 2006. - 30; 24(49-50). — P. 7037-7045.
12. Boriskin Yu.S., Booth J.C., Yamada A.//J. Virol. Methods. — 1993.-42(1). — P. 23-32.
13. Chamot E., Toscani L., Egger P. et al.//Rev. Epide'm Sante' Publ. — 1998. —46. — P. 100-107.
14. Cusi M.G., Bianchi S., Valassina M. etal.//Res. Virol. — 1996. — 147(4). — P. 227-232.
15. da Cunha S.S., Rodrigues L.C., Barreto M.L. et al.// Vaccine. — 2002. — 20(7-8). — P. 1106-1112.
16. da Silveira C.M., Kmetzsch C.I., Mohrdieck R. etal.// Int. J. Epidemiol. — 2002. — 31. — P. 8-82.
17. Galazka A.M., Robertson S.E., Kraigher A.//Bull. World Health Organ. — 1999. — 77. — P. 3-14.
18. Inou Y., Nakayama T., Yoshida N. et al.//J. Med. Virol. — 2004. — 73(1). — P. 97-104.
19. Jin L., Brown D. W.G., Litton P.A. et al.//Journal of Infectious Diseases — 2004. — 189(6). — P. 1001.
20. Kaic B.//Vaccine. — 2007. — 26; 25(7). — P. 1159-1160.
21. Kashiwagi Y., Takami T., Mori T. et al.//Archives of Virology. — 1999. — 144(3). — P. 593.
22. Kim S.H., Song K.J., Shin Y.K. et al.//Microbiology and Immunology. — 2000. — 44(3). — P. 173.
23. Koskiniemi M., Rautonen J., Lehtokoski-Lehtiniemi E. et al.//Ann. Neurol. — 1991. — 29. — P. 492-497.
24. Kulkarni PS., Phadke M.A., Jadhav S.S. et al.// Vaccine. - 2005. - 16; 23(46-47). - P. 5286-5288.
25. Paccaud M.F., Hazeghi P., Bourquin M. et al.//Sozial und Praventivmedizin. — 1995. — 40(2). — P. 72.
26. Palacios G., Jabado O., Cisterna D. et al.//J. Clin. Microbiol. —2005. —43(4). — P. 1869-1878.
27. Peltola H., Kulkarni P.S., Kapre S.V. et al.//Clin. Infect. Dis. — 2007. — 15; 45(4). — P. 459-466.
28. Phadke M.A., Patki P.S., Kulkarni PS. et al.// Vaccine. — 2004. — 22; 22(31-32). — P. 4135-4136.
29. Plotkin S.A., Orenstein W.A., Offit P.A.//Vaccines. 4th ed. Philadelphia: WB Saunders Company. — 2004. — P. 441-469.
30. Rima B.K., Wishaupt R.G., Welsh M.J. et al.//Vet. Microbiol. — 1995.-44(2-4). — P. 127-134.
31. Santos C.L., Ishida M.A., Foster P.G. etal.//J. Med. Virol. — 2008. — 80(2). — P. 323-329.
32. Takahashi M., Nakayama T., Kashiwagi Y. et al.// J Med Virol. — 2000. — 62(2). — P. 278.
33. Tecle T., Bottiger B., Orvell C. et al.//J. Gen. Virol. — 2001. — 82(Pt. 11). — P. 2675-2680.
34. TesovicG., Begovac J., Bace A.//Lancet. — 1993. — 12; 341(8859). — P. 1541.
35. Tesovic G., Lesnikar V.//Vaccine. — 2006. — 29; 24(40-41). — P. 6371-6373.
36. Ueda K., Miyazaki C., Hidaka Y. et al.//Lancet. — 1995. — 346(8976). — P. 701.
