CC BY
76
Дифференциация клинически значимых штаммов энтерококков от представителей нормальной микрофлоры животных с использованием математических моделей
М.В. Сычёва, к.б.н, ФГБОУ ВО Оренбургский ГАУ
Одной из важнейших задач клинической микробиологии является дифференциация патогенных вариантов микроорганизмов от представителей нормальной микрофлоры. Сложность указанной проблемы заключается в изучении микроорганизмов, выполняющих, с одной стороны, жизненно важные гомеостатические функции, а с другой — являющихся возбудителями эндогенных инфекций, что в полной мере относится к бактериям рода ЕМегососст.
Установлено, что некоторые культуры энтерококков, приобретя ряд факторов патогенности, могут вызывать серьёзные инфекционные заболевания [1], тогда как другие штаммы служат необходимым компонентом нормального микробиоценоза и, оказывая положительное влияние на макроорганизм, с успехом применяются в качестве основы биопрепаратов пробиотической направленности [2]. Вышеизложенное предопределило цель настоящего исследования — с помощью современных методов математического анализа разработать алгоритм, позволяющий дифференцировать энтерококков — представителей нормальной микрофлоры от этиологических агентов, способных вызывать развитие патологических процессов.
Материал и методы исследования. Изучено 334 штамма бактерий рода ЕМегососст. Из них 162 изолята, выделенные из фекалий клинически здоровых сельскохозяйственных животных, сформировали первую группу и 172 штамма ЕМегососст Брр., изолированные от продуктивных животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, составили вторую группу сравнения.
В качестве биологических характеристик энтерококков были использованы данные сравнительного анализа частоты встречаемости факторов вирулентности (протеолитическая, желатиназная, гемолитическая активности), персистенции (анти-лизоцимная, антикарнозиновая активности, био-плёнкообразование) и полиантибиотикорезистент-ности энтерококков, изученные нами ранее [3—6].
Регрессионные уравнения были рассчитаны в программе «ЗТАТКТГСА 10».
Результаты исследования. Данные, характеризующие биологические признаки, отличающие клинические и фекальные изоляты, были обработаны посредством пакета программ <^ТАТКТ1СА 10». Конечным этапом математической обработки явилось получение регрессионных моделей, позволяющих дифференцировать бактерии рода ЕМегососст
на представителей нормальной микрофлоры и возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний. Биологические свойства исследуемого штамма энтерококков вводили в формулу для расчёта регрессионного уравнения:
У1 = -1,11911 + 0,20244Х1 + 0,03078Х2+ 1,38136Х3 + 0,00336Х4-— 1,11928Х5 + 0,32994Х6 + 0,28211Х7, (1) где У1 — регрессионное уравнение, дифференцирующее энтерококков — представителей нормальной микрофлоры и возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний; Х1 — антилизоцимная активность (АЛА), мкг/мл;
Х2 — антикарнозиновая активность (АКрА), мг/мл;
Х3 — коэффициент биоплёнкообразования (КБ), усл. ед.;
Х4 — полиантибиотикорезистентность; Х5 — протеолитическая активность (ПА), мг/мл • мин;
Х6 — желатиназная активность (ЖА); Х7 — гемолитическая активность (ГА).
При этом биологические свойства энтерококков с учётом их качественной и количественной характеристики дифференцировали в условных и абсолютных единицах. Протеолитическая активность, антилизоцимная, антикарнозиновая активности и биоплёнкообразование — эти количественные признаки были оценены в абсолютных единицах. Желатиназная, гемолитическая активности и по-лиантибиотикорезистентность определялись как качественные признаки. Их наличие оценивалось в 1 усл. ед., а отсутствие этих свойств обозначалось как 0 усл. ед. Результат оценивали путём сравнения полученной величины регрессионного уравнения с диапазоном величин, характерных для патогенных и апатогенных изолятов энтерококков: если У < 0,5 — штамм ЕМегососст Бр. является представителем нормальной микрофлоры, если У >0,5 — изолят ЕМегососст Бр. клинически значим.
Иллюстрацию расчётов рассмотрим на следующих примерах.
Пример 1. Исследуемый штамм Е. /аесаШ 119, выделенный из фекалий коровы, характеризовался следующими биологическими свойствами: АЛА — 1,515 мкг/мл, АКрА — 2,941 мг/мл, коэффициент биоплёнкообразования — 1,1 усл. ед., полиантибиотикорезистентность отсутствует, ПА — 0,787 мг/мл • мин, желатиназная и гемолитическая активности отсутствуют. Расчёт регрессионного уравнения следующий:
^ =-1,11911 + 0,20244х1515 + + 0,03078х2 941+ 1,38136х11 + 0',00336х0 —
- 1,11928х0 787 + 0,32994х0 + 0,28211^ = 0,1988.
У1<0,5, следовательно, это — штамм энтерококка, являющийся представителем нормальной микрофлоры.
Пример 2. Из секрета вымени коровы, страдающей гнойным маститом, выделена культура энтерококка, которая была идентифицирована до вида (Е. /аесаИъ). Поскольку, с одной стороны, молочнокислые микроорганизмы, в том числе энтерококки, являются специфической микрофлорой молока, а с другой — энтерококки могут выступать в роли этиологического фактора маститов, у штамма были определены информативные биологические признаки: АЛА — 1,711 мкг/мл, АКрА — 1,001 мг/мл, коэффициент биоплёнкообразования — 1,1 усл. ед., штамм полиантибиотикорезистентный, протеоли-тическая активность — 0,261 мг/мл • мин, желати-назная и гемолитическая активности отсутствуют. Расчёт регрессионного уравнения следующий: У1 =-1,11911 + 0,20244х1711 + + 0,03078х1001 + 1,38 1 36х1 1 + 0,00336х1 —
— 1,11928х0 261 + 0,32994х0 + 0,28211х0 = 0,7709.
У1>0,5, следовательно штамм относится к
патогенной микрофлоре.
Доказано, что биологические свойства микроорганизмов, в частности их персистентный потенциал, имеют высокую диагностическую ценность, поэтому мы предприняли попытку рассчитать регрессионное уравнение, включающее в качестве информативных признаков факторы персистенции энтерококков (АЛА, АКрА и биоплёнкообразова-ние), а также видовую принадлежность штамма. Указанные биологические свойства исследуемых культур энтерококков вводили в формулу (2) для расчёта регрессионного уравнения в абсолютных (АЛА, АКрА, БПО) и условных единицах (Е. /ае-саШ — 1, поп/аесаШ виды — 0):
У2= -1,88332 + 0,46732Х1 + 0,39772Х2 —
—0,01994Х3+ 1,36163Х4, (2)
где У2 — регрессионное уравнение, дифференцирующее энтерококков — представителей нормальной микрофлоры и возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний; Х1 — видовая принадлежность; Х2 — антилизоцимная активность, мкг/мл; Х3 — антикарнозиновая активность, мг/мл; Х4 — коэффициент биоплёнкообразования, усл. ед.
Оценка результата проводилась путем сравнения полученной величины регрессионного уравнения с диапазоном величин, характерных для патогенных и апатогенных изолятов энтерококков: если У < 0,5 — штамм ЕМегосвсст Бр. является представителем нормальной микрофлоры, если У >0,5 — изолят ЕМегососст Бр. клинически значим.
Для иллюстрации расчётов приводим следующие примеры.
Пример 1. Из фекалий быка-производителя был выделен штамм, идентифицированный как Е. йыгат. Параллельно культуру протестировали на наличие информативных признаков, которые имели следующие значения: АЛА — 1,603, АКрА — 2,387, коэффициент биоплёнкообразования — 1,10. Расчёт регрессионного уравнения имел следующий вид: У2= -1,88332 + 0,46732х0+ 0,39772х1 603 —
— 0,01994х2387+ 1,36 1 63х11 = 0,2044.
У1<0,5, следовательно, штамм относится к
нормальной микрофлоре.
Пример 2. У кота с мочекаменной болезнью было проведено количественное микробиологическое исследование мочи, из которой были выделены энтерококки с пограничным значением показателя микробной обсеменённости мочи. В связи с этим этиологическая значимость урокультуры энтерококка была оценена с помощью дифференциальной математической модели. Для этого изолят идентифицировали до вида (Е. /¡ауезсет) и определили у него необходимые диагностические биологические свойства. Уроштамм обладал антилизоцимной (1,315 мкг/мл), антикарнози-новой (3,100 мг/мл) активностями и формировал биоплёнки (1,5 усл. ед.). Расчёт регрессионного уравнения приведён ниже:
У2= -1,88332 + 0,46732х0+ 0,39772х1315 —
— 0,01994х3 100+ 1,36 1 63х1 5= 0,6203.
У2 > 0,5, что соответствует значению клинически значимого штамма.
Для упрощения регрессионного уравнения с целью использования в практике производственных ветеринарных лабораторий мы ограничились определением четырёх биологических характеристик: биоплёнкообразование, протеолитическая, желати-назная и гемолитическая активности, на основании которых было рассчитано регрессионное уравнение для дифференциации культур ЕМегососсыз Брр. на патогенные и апатогенные варианты. Указанные биологические свойства исследуемых штаммов энтерококков вводили в формулу (3) для расчёта регрессионного уравнения в абсолютных (КБ, ПА) и условных (ЖА, ГА) единицах.
У3 = -0,87947 + 1,49972Х1 — 1,09873Х2 +
+0,33292Х3 + 0,27716Х4, (3)
где У3 — регрессионное уравнение, дифференцирующее энтерококков — представителей нормальной микрофлоры и возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний; Х1 — коэффициент биоплёнкообразования, усл. ед.;
Х2 — протеолитическая активность, мг/мл • мин; Х3 — желатиназная активность; Х4 — гемолитическая активность.
Если У3 > 0,5, то штамм является вирулентным; если У3< 0,5 — авирулентным.
Приведём следующие примеры.
Пример 1. Исследуемый штамм Е. /аесшш 79, выделенный из фекалий свиньи, характеризовался
следующими биологическими свойствами: коэффициент биоплёнкообразования — 1,03 усл. ед., протеолитическая активность — 0,442 мг/мл • мин, желатиназная и гемолитическая активности отсутствовали. Результаты расчёта регрессионного уравнения приведены ниже:
У3 = -0,87947 + 1,49972х1 03 - 1,09873х0 442 + + 0,33292х0 + 0,27716хо = 0,1799. '
У3 < 0,5, следовательно, штамм авирулентный.
Пример 2. У культуры Е./аесаШ, изолированной из экскрета половых органов собаки с эндометритом, определили необходимые диагностические признаки: КБ — 1,3 усл. ед., ПА — 0,254 мг/мл • мин, желатиназная и гемолитическая активности отсутствовали. Расчёт регрессионного уравнения следующий:
У3 = -0,87947 + 1,49972х1 3 — 1,09873х0 254 + + 0,33292х0 + 0,27716х0 = 0,7915.'
У3>0,5, следовательно, выделенный штамм энтерококка патогенный.
Исследуемые нами выборки штаммов энтерококков, изолированных от здоровых животных и от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, были рассчитаны с помощью созданных математических моделей на вероятность вхождения каждого из штаммов в определённую выборку. Результатом проведённых расчётов стало 95-процентное подтверждение данных, полученных в ходе бактериологического эксперимента.
Таким образом, охарактеризованные биопрофили фекальных и клинических изолятов энтерококков позволили определить ведущие информативные признаки для дифференциации патогенных ЕМегососст Брр. от представителей нормальной микрофлоры и разработать математические модели, позволившие дифференцировать 95% штаммов энтерококков, выделенных от животных.
Вывод. Полезные свойства симбиотических энтерококков определили их частое использование в медицине и ветеринарии в качестве пробиотиков, а также в пищевой промышленности в составе заквасок. Между тем возросшее клиническое значение бактерий рода ЕМегососст ставит вопрос о безопасности их применения и актуализирует проблему дифференциации этиологически значимых штаммов и представителей нормальной микрофлоры.
В литературе описан способ дифференциации энтерококков, являющихся представителями нормальной микрофлоры человека, от патогенных энтерококков путём разграничения потенциально опасных штаммов по их генетическому профилю с применением полимеразной цепной реакции. При обнаружении генов, кодирующих факторы вирулентности, делают заключение о патогенно-сти штамма энтерококка [7]. Несостоятельность
указанного подхода подтверждается в работе D. Johansson, M. Rasmussen (2013), которые, проанализировав биопрофили 42 энтерококков, выделенных из кишечника здоровых людей и пациентов с инфекционным эндокардитом энтерококковой этиологии, не обнаружили существенных различий в частоте встречаемости генетических детерминант вирулентности [8]. Генетическая детерминация факторов патогенности ещё не доказывает фенотипи-ческую реализацию данного свойства в конкретных условиях in situ. Более того, обнаружение признака недостаточно для чёткой дифференциации культур микроорганизмов; необходимы определение уровня экспрессии, а также выявление совокупности наиболее информативных параметров, что в настоящее время позволяют делать современные методы математического анализа [9].
В нашей работе впервые с применением математического анализа были определены ведущие информативные признаки для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов энтерококков, выделенных от животных (видовая принадлежность, антилизоцимная, антикарнозиновая активности, коэффициент биоплёнкообразования, полиантибиотикорезистентность, протеолитиче-ская, желатиназная и гемолитическая активности). На основе полученных данных рассчитаны три регрессионных уравнения, которые легли в основу программ для ЭВМ и используются в работе ГБУ «Оренбургская областная ветеринарная лаборатория» для дифференциации бактерии рода Enterococcus.
Литература
1. Бухарин О.В., Валышева И.В., Карташова О.Л. и др. Характеристика вирулентного потенциала клинических изолятов энтерококков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. № 3. С. 13—18.
2. Сычёва М.В., Валышева И.В. Скрининг антагонистической активности и детерминант вирулентности у фекальных штаммов энтерококков // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2012. № 4 (36). С. 236—239.
3. Пошвина Д.В., Щепитова Н.Е., Сычёва М.В. и др. Видовая характеристика и факторы персистенции энтерококков, выделенных от животных в норме и при патологии // Ветеринария. 2015. № 6. С. 26-30.
4. Пошвина Д. В., Сычёва М.В. Антибиотикорезистентность клинических изолятов бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН [электронный журнал]. 2014. № 3. URL: http://www.elmag.uran.ru.
5. Пошвина Д.В., Сычёва М.В. Видовая характеристика и протеолитическая активность энтерококков // Вестник ветеринарии. 2014. № 2 (69). С. 40-43.
6. Щепитова Н.Е., Пошвина Д.В., Сорокин В.И., Сычёва М.В. Биологическое разнообразие энтерококков, выделенных от животных, в норме и при патологии // Труды Кубанского ГАУ. 2013. № 4 (43). С. 243-245.
7. Вершинин А.Е., Колоджиева В.В., Ермоленко Е.И. и др. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008. № 5. С. 83-87.
8. Johansson D., Rasmussen M. Virulence factors in isolates of Enterococcus faecalis from infective endocarditis and from the normal flora // Microb. Pathog. 2013. Vol. 55. P. 28-31.
9. Бухарин О.В., Валышев А.В. Биология и экология энтерококков. Екатеринбург: УрО РАН, 2012. 227 с.
